補(bǔ)腎活血方聯(lián)合補(bǔ)佳樂對宮腔粘連大鼠YAP1/TGF-β1信號通路的影響

閆曉彤，朱 婷，章曉樂，齊 聰，蔣國靜，胡攀偉

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院婦科，上海 201203)

宮腔粘連(Intrauterine adhesions，IUA)是在感染、流產(chǎn)手術(shù)、宮腔操作等因素所致的子宮內(nèi)膜基底層損傷后，引發(fā)的宮腔或?qū)m頸管內(nèi)膜破壞、局面創(chuàng)面粘連，臨床上主要表現(xiàn)為月經(jīng)過少、閉經(jīng)、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、不孕等[1-2]。近些年來，由于性生活的年輕化，人工流產(chǎn)宮腔操作頻率的增加，IUA日益成為威脅女性生殖健康的重要?dú)⑹諿3-4]。目前IUA主要采用宮腔鏡下粘連松解術(shù)，輔以術(shù)后雌孕激素治療，但是這種療法僅對輕、中度IUA有一定療效，同時術(shù)后常出現(xiàn)薄型子宮內(nèi)膜、粘連復(fù)發(fā)等并發(fā)癥[5-6]。補(bǔ)腎活血方前期研究表明補(bǔ)腎活血方可以有效增加IUA患者術(shù)后子宮內(nèi)膜厚度，改善子宮內(nèi)膜供血，預(yù)防宮腔再次粘連[7]。Hippo通路是一條由多種蛋白激酶和轉(zhuǎn)錄因子共同構(gòu)成的激酶通路，通過多途徑與TGF-β 信號發(fā)生交匯，參與子宮內(nèi)膜纖維化調(diào)控進(jìn)程[8-9]。YAP/TGF-β 信號通路能夠調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞分化為肌成纖維細(xì)胞，介導(dǎo)纖維化進(jìn)程[10-12]。本研究通過雙重?fù)p傷建立宮腔粘連模型，運(yùn)用組織學(xué)染色觀察大鼠子宮內(nèi)膜病理，免疫組化檢測YAP1/TGF-β1蛋白表達(dá)，統(tǒng)計孕囊數(shù)目進(jìn)行生育力評估，系統(tǒng)性評價益氣活血方的臨床應(yīng)用價值，探討其內(nèi)在的調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物：清潔級雌性SD大鼠40只(斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限公司)，體重約為(200±20)g，飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)動物房中，自由攝食飲水，人工光照明暗交替12 h，飼養(yǎng)室溫度為(25±2)℃，相對濕度30%～70%。本研究經(jīng)過上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物福利與倫理委員會批準(zhǔn)同意。實(shí)驗(yàn)動物許可證號SCXK(滬)20020-00058。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器：YAP1抗體(批號ab76252)，TGF-β1抗體(批號ab31013)，二甲苯(國藥集團(tuán)有限公司)，蘇木素伊紅染色(索萊寶)，Masson三色試劑盒(珠海貝索有限公司)，中性福爾馬林固定液(索萊寶試劑有限公司)，中性樹膠(國藥集團(tuán)有限公司)，補(bǔ)佳樂(批號20171038，拜耳有限公司)，超低溫冰箱(三洋公司)，顯微鏡(奧林巴斯公司)，石蠟切片機(jī)(徠卡公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)藥物：補(bǔ)腎活血方由黃芪30 g，巴戟天、當(dāng)歸、水蛭各15 g，牛膝18 g，熟地黃12 g，鹿角片、川芎各9 g，炙甘草6 g組成。中藥購自上海萬仕誠藥業(yè)，由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院制劑室煎煮而成，參照人與大鼠體表面積換算系數(shù)0.018[13]，將中藥制備成每1 ml 含1.16 g原藥材的湯劑，留存于4 ℃ 冰箱。補(bǔ)佳樂用量參照課題組前期研究[14]，將補(bǔ)佳樂碾成粉末，取0.18 g溶于10 ml 0.9%氯化鈉溶液，留存于4 ℃冰箱。補(bǔ)腎活血方與補(bǔ)佳樂混懸液即在前期中藥制備基礎(chǔ)上直接加入補(bǔ)佳樂粉末，充分搖勻，留存于4 ℃冰箱。

1.2.2 動物分組、建模與給藥：大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，以陰道脫落細(xì)胞法選擇處于動情周期的大鼠進(jìn)行造模手術(shù)。將40只雌性大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表分為假手術(shù)組、模型組、中藥組、西藥組、中藥+西藥組，每組8只。假手術(shù)組僅切開皮膚然后縫合處理，其余各組通過手術(shù)建立IUA模型，參照前期課題組方法[14]制備IUA模型。首先將醫(yī)用無菌術(shù)線浸泡于脂多糖溶液過夜，待大鼠完全麻醉后切開下腹部輕輕分離出子宮，在子宮頸上方約5 mm處作縱行切口，利用刮勺經(jīng)切口進(jìn)入行刮宮術(shù)，當(dāng)宮腔四壁出現(xiàn)粗糙感時停止刮宮，隨后將脂多糖棉線置入宮腔加重感染，并在腹壁留一尾絲以便后續(xù)取出，最后運(yùn)用0.9%氯化鈉溶液沖洗腹腔，縫合腹壁，待24 h后取出棉線，9 d后即可形成大鼠IUA模型。當(dāng)造模成功后開始灌胃給藥，1次/d，每次2 ml，假手術(shù)組與模型組予0.9%氯化鈉溶液，中藥組予補(bǔ)腎活血方11.61 g/kg，西藥組予補(bǔ)佳樂0.18 mg/kg，中藥+西藥組予補(bǔ)腎活血方與補(bǔ)佳樂混懸液，各組連續(xù)灌胃28 d，末次給藥24 h后選取4只大鼠處死，進(jìn)行雙側(cè)子宮取材和重量稱量，剩余4只大鼠與雄鼠進(jìn)行合籠。

1.2.3 HE染色檢測子宮內(nèi)膜組織病理變化：采用中性福爾馬林固定固定標(biāo)本后，經(jīng)過梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋后切片，脫蠟至水，按照試劑盒說明書依次進(jìn)行HE染色，中性樹膠封片。待過夜晾干后，在高倍鏡下(100倍)隨機(jī)選擇5個視野，記錄子宮內(nèi)膜腺體數(shù)及內(nèi)膜厚度，計算其平均值。

1.2.4 Masson染色檢測子宮內(nèi)膜纖維化程度：每組剩余的石蠟切片經(jīng)過脫蠟至水、蘇木精液染核、麗春紅酸性復(fù)紅液染色、冰醋酸水溶液浸洗、磷鉬酸水溶液分化、苯胺藍(lán)染色、二甲苯透明等操作后，以中性樹膠封片。待過夜晾干后，在高倍鏡下(100倍)隨機(jī)選取5個視野，用Image J軟件計算得到子宮內(nèi)膜間質(zhì)纖維化百分比，記錄其平均值。

1.2.5 免疫組化檢測子宮內(nèi)膜YAP1與TGF-β1蛋白：對每組剩余石蠟標(biāo)本進(jìn)行二甲苯脫蠟、乙醇水化、內(nèi)源性過氧化氫酶去除、抗原修復(fù)等操作，隨后滴加5% 的牛血清蛋白封閉1 h，再分別孵育一抗(YAP1 1∶200；TGF-β11∶200)與對應(yīng)的熒光二抗(1∶1000)，接著給予DAPI(1∶1000)避光染核2 min，最后滴加防淬滅封片劑封片。待玻片晾干后置于熒光顯微鏡下觀察記錄，用Image J軟件計算免疫組化中的陽性細(xì)胞百分比。

1.2.6 生育力測定：每組選取剩余4只大鼠，與雄鼠以2∶1比例進(jìn)行合籠交配，7 d后處死大鼠，記錄大鼠雙側(cè)子宮胚胎植入數(shù)目。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，對于多樣本均數(shù)間的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Dunnett’s法；P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠子宮內(nèi)膜組織形態(tài)學(xué)比較 見圖1(表1)。給藥結(jié)束后，剖視見假手術(shù)組子宮外觀形態(tài)正常，質(zhì)軟，色粉紅，造模組大鼠子宮與周圍組織偶見疏松粘連，子宮質(zhì)略硬，外觀形態(tài)略有粗細(xì)不均，表面見瘀血狀紅點(diǎn)。通過HE切片染色，發(fā)現(xiàn)假手術(shù)組子宮內(nèi)膜腔表面有豐富完整的子宮內(nèi)膜腺體和多個腺體圍繞的腺體腔，模型組大鼠子宮腔腺體紊亂破碎，腔壁呈現(xiàn)較多炎性細(xì)胞，出現(xiàn)粘連甚至閉鎖現(xiàn)象。與假手術(shù)組相比，各組子宮內(nèi)膜厚度變薄(P<0.05)；與模型組相比，中藥+西藥組大鼠子宮內(nèi)膜明顯增厚(P<0.05)，單用中藥與西藥雖內(nèi)膜厚度有所增加，但經(jīng)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。在內(nèi)膜腺體數(shù)量上，與假手術(shù)相比，模型組腺體明顯減少(P<0.05)，中藥+西藥組也有所減少，組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與模型組比較，中藥+西藥組的腺體明顯增多(P<0.05)，中藥組與西藥組雖有增加，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。經(jīng)過藥物灌胃后中藥、西藥、中藥+西藥組均有一定的改善，但中藥+西藥組宮腔改善較為明顯，子宮腔的腺體數(shù)量更多，子宮內(nèi)膜厚度增加，炎癥細(xì)胞浸潤明顯減少。

圖1 各組大鼠子宮內(nèi)膜組織病理變化(HE染色，×100)

表1 各組大鼠子宮內(nèi)膜厚度與腺體數(shù)量比較

2.2 各組大鼠子宮內(nèi)膜纖維化程度比較 見圖2(表2)。通過內(nèi)膜組織Masson染色，發(fā)現(xiàn)與假手術(shù)組比較，模型組藍(lán)色膠原纖維分布不規(guī)則，可見沉積現(xiàn)象，藍(lán)染纖維化面積明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，中藥組、西藥組、中藥+西藥組治療后膠原纖維的染色現(xiàn)象均無模型組明顯，纖維化程度明顯減輕(P<0.05)；與中藥+西藥組比較，單用中藥與西藥的纖維化程度更高(P<0.05)，提示中藥+西藥組能夠發(fā)揮抑制IUA纖維化的最大效應(yīng)。

表2 各組大鼠子宮內(nèi)膜纖維化程度比較(%)

圖2 各組大鼠子宮內(nèi)膜纖維化程度(Masson染色，×100)

2.3 各組大鼠子宮內(nèi)膜YAP1與TGF-β1蛋白比較 見圖3、4(表3)。與假手術(shù)組比較，模型組YAP1蛋白顯著增高(P<0.05)；與模型組比較，中藥組、中藥+西藥組三組子宮內(nèi)膜YAP1蛋白表達(dá)明顯下降(P<0.05)，而西藥組YAP1蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與中藥+西藥組比較，單用中藥與西藥的YAP1蛋白表達(dá)更多(P<0.05)。與假手術(shù)組比較，模型組子宮內(nèi)膜TGF-β1蛋白顯著增高(P<0.05)；與模型組比較，中藥+西藥組TGF-β1蛋白表達(dá)明顯下降(P<0.05)，中藥組與西藥組的TGF-β1蛋白表達(dá)量也呈現(xiàn)下降趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與中藥+西藥組比較，西藥組TGF-β1蛋白表達(dá)明顯增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而中藥組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表3 各組大鼠子宮內(nèi)膜YAP1和TGF-β1蛋白陽性率比較(%)

圖3 各組大鼠子宮內(nèi)膜YAP1蛋白比較(免疫組化染色，×100)

2.4 各組大鼠妊娠結(jié)局比較 見表4。通過計算大鼠孕囊數(shù)目后發(fā)現(xiàn)，假手術(shù)組胚胎孕囊成串珠狀排列于子宮，單側(cè)孕囊7～9個不等。與假手術(shù)組比較，僅中藥+西藥組大鼠見2枚妊娠孕囊，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，其余各組大鼠均未發(fā)現(xiàn)孕囊；與模型組比較，中藥+西藥組孕囊數(shù)目差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖4 各組大鼠子宮內(nèi)膜TGF-β1蛋白比較(免疫組化染色，×100)

表4 各組大鼠妊娠結(jié)局比較(個)

3 討 論

目前宮腔鏡下粘連分解術(shù)是宮腔粘連最常見的治療手段，但是術(shù)后復(fù)發(fā)率高達(dá)30%～62.5%，常需要配合雌激素輔助促進(jìn)子宮內(nèi)膜生長、修復(fù)手術(shù)創(chuàng)面，在宮腔粘連的治療上仍有必要研究新的治療策略，解決宮腔粘連復(fù)發(fā)和妊娠率低下的難題[15]。本研究采用機(jī)械和感染雙重因素建立IUA模型，通過形態(tài)學(xué)染色發(fā)現(xiàn)中藥組+西藥組能夠有效改善宮腔粘連，抑制內(nèi)膜纖維化，相比于中藥或者西藥單獨(dú)應(yīng)用，中藥與西藥的聯(lián)合應(yīng)用療效更明顯。通過免疫組化蛋白檢測發(fā)現(xiàn)中藥+西藥組能夠有效抑制YAP1/TGF-β1蛋白表達(dá)，其抑制作用優(yōu)于單用中藥或西藥。觀察妊娠結(jié)局，發(fā)現(xiàn)中藥+西藥聯(lián)合應(yīng)用能夠促進(jìn)孕囊個數(shù)，而單用中藥或西藥時，宮腔粘連大鼠的妊娠結(jié)局未能得到改善。

在IUA的發(fā)病機(jī)制上，目前主要認(rèn)為是由于子宮內(nèi)膜基底層損傷造成上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞再生增多，新生血管形成受阻，伴有成纖維細(xì)胞裂解酶活性降低、成纖維細(xì)胞大量增殖，最終形成宮腔粘連纖維樣和瘢痕內(nèi)膜[16]。IUA的特征性病理變化是組織纖維化，這種纖維化是由包括TGF-β 在內(nèi)諸多生長因子調(diào)節(jié)。TGF-β1作為一種條件細(xì)胞生長、侵襲、黏附、遷移的多功能細(xì)胞因子，參與Smad信號通路調(diào)控膠原纖維產(chǎn)生和纖維化進(jìn)程，下調(diào)TGF-β 信號能夠減少細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生和沉積，抑制宮腔粘連進(jìn)展[17]。Hippo通路是一條進(jìn)化高度保守的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，通常情況下以核心激酶MST1/2～LATS1/2磷酸化依賴的方式負(fù)向調(diào)控下游關(guān)鍵效應(yīng)蛋白YAP/TAZ。當(dāng)Hippo通路被激活時，YAP/TAZ被磷酸化滯留于細(xì)胞質(zhì)，而當(dāng)Hippo通路被抑制時，YAP/TZA未被磷酸化，得以易位入核，刺激基因表達(dá)[18]。研究表明Hippo通路能夠調(diào)控TGF-β 通路，敲除Hippo通路上游LATS激酶，能夠恢復(fù)YAP/TAZ核定位和TGF-β 轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)纖維化進(jìn)程[7]。

中醫(yī)認(rèn)為腎虛精血不足，血瘀氣滯是宮腔粘連的基本病機(jī)，治療關(guān)鍵在于補(bǔ)腎填精，補(bǔ)血活血[19-20]。補(bǔ)腎活血方是上海市名中醫(yī)齊聰教授治療宮腔粘連的臨床經(jīng)典用方，以血肉有情之品鹿角為君藥，菟絲子、巴戟天、熟地為臣，填精補(bǔ)腎，黃芪補(bǔ)氣，氣為血之帥，氣行則血行，更用蟲類藥水蛭，引藥入胞宮，聯(lián)用當(dāng)歸、牛膝、川芎，補(bǔ)血活血，再予炙甘草調(diào)和諸藥，全方補(bǔ)而不滯，滋而不膩，共奏補(bǔ)腎活血之功。本研究模擬臨床實(shí)際治療方案，探究了中藥組、西藥組、中藥+西藥組對宮腔粘連的治療作用，發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎活血方與補(bǔ)佳樂聯(lián)用能夠有效抑制宮腔纖維化，改善子宮內(nèi)膜厚度和腺體數(shù)，恢復(fù)宮腔功能，這可能與其能激活Hippo通路，抑制YAP/TGF-β 信號轉(zhuǎn)錄作用相關(guān)。通過觀察妊娠結(jié)局，發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎活血方聯(lián)合補(bǔ)佳樂可能通過改變宮腔粘連提升大鼠子宮內(nèi)膜容受性，改變?nèi)焉锝Y(jié)局。本研究論證了補(bǔ)腎活血方聯(lián)合補(bǔ)佳樂對宮腔粘連大鼠的治療作用以及其對YAP1/TGF-β1通路的干預(yù)調(diào)控，但對于其中的上下游分子機(jī)制仍不明確，還需設(shè)計進(jìn)一步的相關(guān)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其內(nèi)在的分子機(jī)制，為補(bǔ)腎活血方聯(lián)合補(bǔ)佳樂治療宮腔粘連的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

綜上所述，補(bǔ)腎活血方聯(lián)合補(bǔ)佳樂治療可通過抑制YAP1/TGF-β1信號通路降低纖維化，恢復(fù)宮腔粘連大鼠子宮內(nèi)膜容受性，從而有效治療宮腔粘連，改善妊娠結(jié)局。