福鼎白茶不同干燥方式的代謝組研究

張玉琴

（福鼎漢儀樓茶業(yè)有限公司，福建 福鼎 355200）

1 引言

1.1 白茶概述

白茶，由于制法特殊，所制成品茶外表滿披白毫，顏色顯白，故稱白茶。白茶的加工在六大茶類中是最簡(jiǎn)單的，一般分為萎凋→干燥。它是一類不進(jìn)行殺青或揉捻，僅經(jīng)晾干或文火晾干后生產(chǎn)的優(yōu)質(zhì)茶葉，具有形態(tài)芽毫整齊，滿身披毫，毫香清鮮，湯色黃紅清亮，風(fēng)味明凈回甘的質(zhì)量特征。

干燥對(duì)白茶的品質(zhì)穩(wěn)定及提升起到不可替代的作用，越簡(jiǎn)潔的加工工藝越考驗(yàn)制茶過程中的技術(shù)。干燥方式一般有曬干、烘干、蒸干、陰干、陰曬結(jié)合、高溫烘焙、微波干燥等。茶葉萎凋后茶坯的含水量已經(jīng)很低，葉溫表面接近干燥氣流溫度，以導(dǎo)致茶葉表面形成一層干硬的外殼，茶葉中的水分難蒸發(fā)出來，會(huì)影響白茶的品質(zhì)和后續(xù)的貯藏。白茶通過全程萎凋后再直接烘烤的工藝方法形成了其內(nèi)特有的代謝物積累模式，并由此產(chǎn)生了其特有的品味和健康特性。

1.2 白茶中的主要內(nèi)含成分

茶葉作為全球認(rèn)可的純天然健康飲料被更多的人所重視，以巨大的人力與物力致力于對(duì)茶的深入研究，在科研的過程中除逐步確認(rèn)了茶葉的傳統(tǒng)養(yǎng)生作用之外，還發(fā)掘出了茶的抗氧化、抗衰老、抗病毒、抗炎消菌等作用。茶樹的內(nèi)含化學(xué)物質(zhì)十分豐富，到目前為止，在茶樹中經(jīng)分離、確認(rèn)的已知物質(zhì)約有七百余種。茶鮮葉中富含約75%～80%的水分，干物質(zhì)濃度約為20%～25%，干燥物質(zhì)中含有了成百上千種物質(zhì)，主要可分為蛋白質(zhì)，茶多酚，生物堿，氨基酸，碳水化合物，礦物質(zhì)，煙酸，細(xì)胞色素，脂肪類和芳香化合物等。白茶除去了其他茶葉類所固有的特點(diǎn)以外，黃酮萃取率與內(nèi)含元素量都最高，具有很強(qiáng)烈的抗氧化效果，白茶的主要工藝程序黃酮濃度為的十六點(diǎn)二倍，是其他茶類工藝的14.2～21.4倍。其次，白茶內(nèi)含元素中的氨基酸濃度也很高，主要為茶氨酸，茶氨酸能增強(qiáng)免疫、抗腫瘤、防止過度焦慮，增加學(xué)習(xí)效果，并增強(qiáng)對(duì)人體神經(jīng)系統(tǒng)的敏銳度，提高注意力等功用。近年來，更多研究關(guān)注于白茶的代謝物積累，與其所形成的加工機(jī)理。

1.3 代謝組學(xué)概述

代謝物組學(xué)的定義首先源于代謝物組，代謝物組通常是指某一生物學(xué)或細(xì)菌在一特殊生理學(xué)時(shí)間內(nèi)全部的低分子量新陳代謝產(chǎn)品，而代謝物組學(xué)則是對(duì)某一生物學(xué)或細(xì)菌在一特殊生理學(xué)時(shí)間內(nèi)的全部低分子量新陳代謝產(chǎn)品，并且開展定性與量化分析研究的一個(gè)新學(xué)科。這是以組群指標(biāo)分析方法為基礎(chǔ)，以高通量測(cè)定與信息處理技術(shù)為手段，以信息建模和系統(tǒng)集成為研究目標(biāo)的系統(tǒng)生態(tài)學(xué)的一個(gè)分支。它產(chǎn)生于20世紀(jì)90年代末，被看作是"組學(xué)"體系的終點(diǎn)。這是除轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)之外的三大最重要的生物學(xué)功能組，重點(diǎn)是通過結(jié)合分析技術(shù)和多元統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)行分析，對(duì)生物學(xué)樣品中代謝功能素的綜合分析方法。

虞昕磊等研究人員提出代謝組學(xué)是以整體系統(tǒng)的研究方式，對(duì)細(xì)胞組織中和由機(jī)體產(chǎn)生的低分子數(shù)目代謝物質(zhì)進(jìn)行定性或定量研究，以發(fā)現(xiàn)各種代謝網(wǎng)絡(luò)間的相互關(guān)系。蘇小琴等人證實(shí)組學(xué)技術(shù)在茶樹生理生化，茶葉加工，種質(zhì)資源特性等方面都得到了廣泛應(yīng)用，以質(zhì)譜分析法和核磁共振為核心內(nèi)容的代謝組學(xué)高新技術(shù)，具備高靈敏率，高精度高通量的技術(shù)特點(diǎn)，作為一個(gè)整體性的科技對(duì)策和科學(xué)研究方法，對(duì)中國茶樹生長規(guī)律與發(fā)展特點(diǎn)研究茶樹品種改良品種控制功能成分研究，及其產(chǎn)品在加工貯藏過程中的化學(xué)成分規(guī)律研究產(chǎn)生了巨大推動(dòng)作用，其成果極大充實(shí)了茶學(xué)方面的理論知識(shí)，為生產(chǎn)優(yōu)良茶樹產(chǎn)品，培育茶樹資源提供了大量科技數(shù)據(jù)，促進(jìn)了中國茶學(xué)這門學(xué)科的蓬勃發(fā)展。

1.4 研究目的與意義

干燥方法對(duì)白茶的質(zhì)量保持和提高都具有難以取代的重要意義，目前有研究成果指出，對(duì)不同的干燥方法所制作出的白茶質(zhì)量和內(nèi)含成份都有很明顯的影響，鄧仕彬教授等在制茶工序中對(duì)白茶質(zhì)量的影響方面也做過深入研究，包括分析了萎凋方法對(duì)白茶質(zhì)量的影響和風(fēng)干工藝中生化成份改變及其對(duì)白茶質(zhì)量的影響等，為在產(chǎn)品中提高白茶質(zhì)量提出了參考，但并未有關(guān)于福鼎白茶的各種風(fēng)干方法的非靶向代謝組學(xué)研究成果。因此本文中使用了代謝組學(xué)研究技術(shù)，探究不同干燥方式制成的福鼎白茶的代謝物組成結(jié)構(gòu)，篩選差異代謝物，有利于系統(tǒng)比較不同干燥方式對(duì)福鼎白茶品質(zhì)形成的影響，促進(jìn)福鼎白茶加工工藝的改進(jìn)，為福鼎白茶品質(zhì)形成機(jī)理研究奠定科學(xué)基礎(chǔ)。

2 不同干燥方式工藝

2.1 材料與試劑

茶葉原料：本實(shí)驗(yàn)材料采自福鼎省無量山茶園，等級(jí)為一芽二三葉的地方群種茶樹鮮葉。檢測(cè)設(shè)備：超高液相色譜（Ultra Performance Liquid Chromatography UPLC Shim-pack UFLC）（Shima-pack UFLC SHIMADZU CBM30A,）和串連質(zhì)譜（Tandem mass spectrometry）（Applied Biosystems 4500 QTRAP）；研磨儀（MM 400，Retsch）；冷凍干燥機(jī)（Scientz-100F）。

2.2 茶葉加工

采用嫩度為一芽二三葉的地方群種茶樹鮮葉為原料，通過相同的方式進(jìn)行萎凋，然后分為四份按不同的干燥方式（烘干、曬干、陰干、陰曬結(jié)合）進(jìn)行干燥，后將制好的白茶樣品置于實(shí)驗(yàn)室以供下一步檢測(cè)分析樣品中代謝物組成結(jié)構(gòu)實(shí)驗(yàn)操作需要。（如圖1所示）。

炭焙工藝：炭焙工具包括：焙籠、焙蒂、鐵鍋、蔑籮、軟籮、木炭、炭火、鍋鏟等。放置若干量的木炭于鐵鍋中，用干柴草生火將其燒紅備用。純木炭燒紅后觀察有無余煙，若有余煙冒出，則說明炭火尚未穩(wěn)定，待炭火穩(wěn)定后再進(jìn)行下一步的操作。木炭在焙茶前要燃燒完全，否則容易在烘焙的過程中生成明煙。蓋灰的目的是控制炭火的溫度，還能守住熱量。鐵鍋擱放在穩(wěn)定架上，鍋底裝大半鍋的炭灰，將燒紅的木炭均勻地放置在炭灰上，憑經(jīng)驗(yàn)觀察炭火狀況，感覺炭火穩(wěn)定后再用炭灰均勻地覆蓋在炭火上，使其形成“暗火”。

再將焙籠圈罩在鐵鍋外面。把焙蒂放在操作臺(tái)上的蔑籮中，將茶葉輕攤在焙蒂上，其厚度可根據(jù)所焙茶葉的不同等級(jí)而靈活掌握，一般在6cm-10cm左右，中間可相應(yīng)攤厚，周圍稍攤薄。攤好茶葉后，將焙蒂移到焙籠上開始烘焙。烘焙干度達(dá)到要求后即將焙蒂轉(zhuǎn)移至操作臺(tái)上，將茶葉倒在軟籮中，再雙手提卷軟籮將茶葉倒入茶箱中防潮袋內(nèi)，待溫度稍降后進(jìn)行過秤定量、封袋封箱，入庫備用。

機(jī)械烘焙工藝：經(jīng)過高溫烘焙的白茶，會(huì)讓白茶帶來一些不好的表現(xiàn)，比如出現(xiàn)口干、上頭、鎖喉等不良身體反應(yīng)。此外，高溫干燥會(huì)破壞白茶中的活性酶，從而影響白茶的后期轉(zhuǎn)化，這樣對(duì)白茶后期的轉(zhuǎn)化是非常不利的。

相對(duì)傳統(tǒng)炭焙工藝，現(xiàn)代的機(jī)械烘焙，操作上較易于摸索和掌握，自動(dòng)化、智能化程度較高，節(jié)省人工，烘焙容量大、效率高。機(jī)械烘焙對(duì)火候的控制最為準(zhǔn)確，溫差一般不會(huì)超出5℃，質(zhì)量穩(wěn)定。

機(jī)械烘焙主要是通過加熱空氣的溫度來干燥茶葉，熱量更集中于茶葉的表面；而炭焙通過木炭的燃燒形成的紅外線，對(duì)白茶進(jìn)行由內(nèi)到外的熱量輻射，自然會(huì)更加通透全面。機(jī)械烘焙的白茶帶有“火功香”，香味和滋味都比較單一，缺少炭焙白茶獨(dú)特的氣韻。不過，只要遵從白茶干燥工藝“文火慢燉”原則的機(jī)械烘焙，也能做出高品質(zhì)的白茶，讓它在漫長的醞釀過程中保有生命力。

2.3 色譜與質(zhì)譜檢測(cè)

將經(jīng)不同干燥方法加工出的茶葉毛茶分裝在離心管中，離心管蓋上戳洞后進(jìn)行冷凍干燥，凍干要求溫度為真空度：0.02mbar;-50℃。凍干后的山毛茶拋光研磨為大小相同的茶粉，稱取30mg，并加入1mL的乙酰丙胺。渦量混勻后在25℃超聲20min、離心10min后，轉(zhuǎn)移細(xì)胞并上清于離心管內(nèi)，再放在-20℃的冰箱下進(jìn)行儲(chǔ)存。使用之前將其稀釋50倍。各白茶不同干燥方式樣本均有3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

質(zhì)譜采集條件：LIT和三重四極桿掃描是在三重四極桿線性離子阱質(zhì)譜儀，AB6500 Q TRAP UPLC/ MS/ MS系統(tǒng)上獲得的，該系統(tǒng)配備了ESI Turbo離子噴霧接口，可由Analyst 1.6.3軟件控制運(yùn)行正負(fù)兩種離子模式。在QQQ和LIT模式下分別用10和100μmol/ L聚丙二醇溶液進(jìn)行儀器調(diào)諧和質(zhì)量校準(zhǔn)。QQQ掃描使用MRM模式，并將碰撞氣體（氮?dú)猓┰O(shè)置為中等。通過進(jìn)一步的DP和CE優(yōu)化，完成了各個(gè)MRM離子對(duì)的DP和CE。根據(jù)每個(gè)時(shí)期內(nèi)洗脫的代謝物，在每個(gè)時(shí)期監(jiān)測(cè)一組特定的MRM離子對(duì)。

超高效液相色譜-四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)利用 Waters MassLynx 采集，采集到的數(shù)據(jù)再導(dǎo)入 到Progenesis QI 2.1軟件中進(jìn)行峰對(duì)齊、峰識(shí)別、歸一化等數(shù)據(jù)前處理。差異化合物篩選條件：VIP＞1、Fold Change＞2或＜0.5，再利用 SIMCA 13.0對(duì)篩選后的物質(zhì)進(jìn)行主成分分析以及載荷圖繪制。

3 不同干燥方式代謝物分析

3.1 代謝物概況

基于UPLC-MS/MS檢測(cè)平臺(tái)和自建數(shù)據(jù)庫，從四種干燥方式制成的福鼎白茶樣中共檢測(cè)到977個(gè)化合物，主要分為89個(gè)氨基酸類、17個(gè)苯丙素類、41個(gè)苯的衍生物類、108個(gè)酚酸類、51個(gè)核苷酸及其衍生物類、244個(gè)黃酮類、68個(gè)生物堿類、69個(gè)糖苷類、63個(gè)糖類、17個(gè)維生素類，89個(gè)有機(jī)酸類、38個(gè)脂肪酸類、66個(gè)脂質(zhì)、11個(gè)其他、6個(gè)其他類。

樣本主成分分析（PCA）得分圖如下（其中AD表示陰干 BD表示烘干 SD表示曬干 SAD表示陰曬結(jié)合）。由圖可知，四種不同干燥方式的白茶代謝物結(jié)構(gòu)差異是顯著的。從圖中可以看出曬干組內(nèi)距離最近，說明曬干干燥方式的白茶平行樣本重復(fù)性高，代謝物結(jié)構(gòu)最相似。陰干和烘干距離最遠(yuǎn)，說明陰干和烘干干燥方式的白茶內(nèi) 涵的代謝物差異最大。

3.2 陰干組與烘干組的比較分析

按照不同新陳代謝物的遴選準(zhǔn)則:可變重要性投影（Variable Importance in Projection,VIP）VIP＞1，fold change＞2或者差異倍數(shù)值（fold change）FC＜0.5，相比于陰干，烘干中篩選出不同新陳代謝物四十五種，包括氨基酸及其產(chǎn)生物類（4個(gè)）、酚酸類（8個(gè)）、黃酮類（8個(gè)）、核苷酸極其產(chǎn)生物類（1個(gè)）、脂肪酸類（10個(gè)）、生物堿類（3個(gè)）、糖甙類（3個(gè)）、糖類（2個(gè)）、有機(jī)質(zhì)類（4個(gè)）、脂質(zhì)類（1個(gè)）、其他類（1個(gè)）。明顯升高的中間代謝物主要有咯肼、溶血磷脂酰膽堿20:5、櫻黃素-4'-O-葡萄糖刺激苷，3,5-二氫氧基-3-甲基戊酸、根皮素等約二十種，顯著明顯降低的中間代謝物則有一，2,3,6-四-O-沒食子酰-D-葡萄糖刺激、二倍?；?六羥基二苯甲?；?葡萄糖、E,E,Z-1,3,12-十九碳三烯-5,14-二醇、2α-羥基熊果酸等25種。

3.3 陰干組與曬干組的比較分析

根據(jù)不同代謝物的遴選準(zhǔn)則:變量重要性投影（VariabLE ImportancE in Projection,VIP）VIP＞1，fold change＞2或者差異倍數(shù)值（fold change）FC＜0.5相比于在陰干，或曬干中遴選出不同代謝物十九種，其中顯著明顯升高的代謝物主要有有咯肼、溶血性磷脂酰膽堿20:5、9-氧代壬酸、短葉蘇木酚酸甲酯、l-甲硫氨酸等九種，顯著明顯降低的代謝物主要有e,e,Z-1,3,12-十九碳三烯-5,14-二醇、二十碳二烯酸、2,4,6-三羥基苯甲酸甲酯、2-阿魏酰-sn-甘油、咖啡酸苯乙酯、油酰單乙醇胺等10種。

3.4 曬干組與烘干組的比較分析

按照不同新陳代謝物檢測(cè)準(zhǔn)則:可變重要性投影（VariabLe ImpOrtaNce in PrOjection,VIP）VIP＞1，foLD change＞2或者差異倍數(shù)值（fold change）FC＜0.5，相比于曬干，烘干中篩選出不同新陳代謝物二十九種，其中顯著上調(diào)的新陳代謝物有根皮素、二氫查爾酮-4'-o-葡萄糖苷、l-吡咯烷酮-5-羧酸鈉、3,5-二羥基-3-甲基戊酸、n-(3-吲哚乙?；?-l-丙氨酸等二十三種，顯著明顯降低的新陳代謝物則有一，2,3,6-四-o-沒食子酰-d-標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖、二倍?；?六羥基二苯甲?；?標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖、槲皮素-7-O-蕓香糖苷-4'-O-葡萄糖苷等6種。

3.5 陰干組與陰曬結(jié)合組的比較分析

按照不同新陳代謝物檢測(cè)準(zhǔn)則:可變重要性投影（VariablE ImpOrtancE in Projection,VIP）VIP＞1，fold change＞2或者差異倍數(shù)值（fold change）FC＜0.5，相比于陰干，陰曬結(jié)合中篩選出不同新陳代謝物十五種，其中顯著上調(diào)的新陳代謝物有咯肼、溶血磷脂酰膽堿20:5、2,4,6-三羥基苯甲酸甲酯、5-羥基-3,7,4'-三甲氧基黃酮、(-)-表兒茶素-3-(3''-o-甲基)沒食子酸酯等十種，顯著明顯降低的新陳代謝物則有e,e,Z-1,3,12-十九碳三烯-5,14-二醇、2-阿魏酰-sn-甘油、二十碳二烯酸、槲皮素-3-O-阿拉伯糖苷（番石榴苷）等5種。

3.6 烘干組與陰曬結(jié)合組的比較分析

根據(jù)不同代謝物檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)：變量重要性投影（VariabLe ImpOrtance in PrOjectiOn,VIP）VIP＞1，folD change＞2或者差異倍數(shù)值（fold change）FC＜0.5，相比在烘干，陰曬等結(jié)合過程中篩出不同代謝物三十種，其中顯著明顯升高的代謝物主要有櫻黃素-4'-o-葡萄糖苷、根皮素、l-吡咯烷酮-5-羧酸鈉、二氫查爾酮-4'-o-葡萄糖甙等十九種，顯著明顯降低的代謝物主要有二,4,6-三羥基苯甲酸甲酯、1,2,3,6-四-o-沒食子酰-d-葡萄糖、二倍酰基-六羥基二苯甲?；?葡萄糖、2-羥基苯并噻唑、1-O-沒食子酰-鼠李糖等11種。

3.7 曬干組與陰曬結(jié)合組的比較分析

按照以下不同代謝物檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)：變量重要性投影值（Variable Importance in Projection,VIP）VIP＞1，fold change＞2或者差異倍數(shù)值（fold change）FC＜0.5，相比于曬干，在陰曬結(jié)合中篩出了不同代謝物五種，其中顯著上調(diào)的代謝物有二,4,6-三羥基苯甲酸甲酯、溶血磷脂酰膽堿20:5、3,5,7,2'-四羥基黃酮；橡精、(-)-表兒茶素-3-(3''-O-甲基)沒食子酸酯、5-羥基3,7,4'-三甲氧基黃酮，沒有顯著下降的代謝物。白茶樣中代謝物N-乙酰-L-蛋氨酸和櫻黃素-4'-O-葡萄糖苷在烘干白茶樣中含量最高，其次為曬干白茶樣，陰曬結(jié)合白茶樣，在陰干白茶樣中的含量最低。

3.8 總結(jié)

相比于焙火、曬干和陰曬結(jié)合三種干燥方法，陰干白茶樣中的2-羥基十六烷酸、10-十七碳烯酸、2R-羥基十八烷酸、9-氫氧基-10,12-十八碳二烯酸乙腈、雀巢咖啡酸苯乙腈、黃油酰單乙醇胺、2-阿魏酰-sn-甘油生產(chǎn)、20多碳二烯酸、E,E,Z-1,3,12-十九碳三烯-5,14-二醇等共9種代謝物含量顯著更高，而咯肼、溶血磷脂酰膽堿20:5、N-乙酰-L-蛋氨酸、L-甲硫氨酸則顯著低于其他三種干燥方式樣。

咖啡酸苯乙酯是蜂膠中最主要的有效成分，并由于它有抗氧化、抗炎、抑瘤、抗菌、自身免疫力等諸多藥理作用而倍受人們重視。雀巢咖啡酸苯乙腈分子結(jié)構(gòu)中具有兒茶酚結(jié)構(gòu)，是一類強(qiáng)力抗氧化劑，還因?yàn)閺?qiáng)烈的抗炎和抗氧化活性而能夠發(fā)揮抗腫瘤的功效，在中醫(yī)藥上有著很廣泛的使用前景。N-乙酰-L-蛋氨酸主要用作營養(yǎng)增補(bǔ)劑。

相比于陰干白茶樣，烘干白茶樣中檢測(cè)出櫻黃素-4'-O-葡萄糖苷、根皮素等20種代謝物顯著上調(diào)，1,2,3,6-四O-沒食子酰-D-葡萄糖、2α-羥基熊果酸等25種顯著下調(diào);曬干中檢測(cè)出短葉蘇木酚酸甲酯、L-甲硫氨酸等等9種代謝物顯著上調(diào)，十九碳三烯-5,14-二醇、二十碳二烯酸等10種代謝物顯著下調(diào);陰曬結(jié)合中檢測(cè)出2,4,6-三羥基苯甲酸甲酯、5-羥基-3,7,4'-三甲氧基黃酮等10種代謝物顯著上調(diào)，二十碳二烯酸、槲皮素-3-O-阿拉伯糖苷等5種代謝物顯著下調(diào)。

相比于焙火樣，在曬干樣中檢查出的根皮素、二氫查爾酮-4'-O-葡萄糖苷等二十三種代謝物明顯升高，1,2,3,6-四-O-沒食子酰-D-葡萄糖、二倍?；?六羥基二苯甲?；?葡萄糖等六種顯著降低；陰曬后結(jié)合試驗(yàn)中測(cè)定出，櫻黃素-4'-O-葡萄糖苷、根皮素等十九種代謝物明顯升高，2,4,6-三羥基苯甲酸甲酯、1,2,3,6-四-O-沒食子酰-D-葡萄糖刺激等十一種顯著降低。

相比于曬干樣，陰曬結(jié)合樣中檢測(cè)出2,4,6-三羥基苯甲酸甲酯、溶血磷脂酰膽堿 20:5等5種代謝物顯著上調(diào)，沒有顯著下調(diào)的代謝物。

4 結(jié)論

通過采用代謝組學(xué)技術(shù)，分析了福鼎地方群種經(jīng)陰干、烘干、曬干和陰曬結(jié)合四種不同干燥方式制成的白茶中的非揮發(fā)性化學(xué)成分的差異情況，共檢測(cè)得到977種非揮發(fā)性化合物。研究結(jié)果表明，咖啡酸苯乙酯、二十碳二烯酸、L-甲硫氨酸、櫻黃素-4'-O-葡萄糖苷、N-乙酰-L-蛋氨酸等14種 代謝物是白茶四種不同干燥方式白茶樣中共有的代謝物。這些研究結(jié)果可為后續(xù)深入研究白茶品質(zhì)化學(xué)提供一些參考依據(jù)。