芹菜葉斑病病原菌細極鏈格孢藥劑篩選

張建強，Abdramane salah zene，王江來，李佳佳，張曉夢，吳康莉，田永強

(1.阿壩師范學院資源與環(huán)境學院，四川阿壩 624000；2.蘭州交通大學生物與制藥工程學院，蘭州 730070；3.甘肅省植物源生物農藥工程技術研究中心，蘭州 730070)

0 引 言

【研究意義】芹菜(Apiumgraveolens)屬傘形科芹屬。近年來，甘肅地區(qū)芹菜種植因連年重茬，使得芹菜病害加重，尤其葉斑病發(fā)生嚴重，芹菜產量和品質受到影響。芹菜葉斑病主要危害葉片，也可危害莖。芹菜葉斑病發(fā)生高峰期在7月中旬, 此時正值高溫季節(jié), 防治難度加大。 芹菜葉斑病的防治措施很多, 除了栽培抗性品種和生物防治，目前種植過程當中主要以化學防治為主，由于引起葉斑病的病原菌不同而給田間防治帶來困難，篩選出對特定病原菌有最佳效果的藥劑對滿足生產需求具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】引起葉斑病的致病菌種類很多，不同病原菌對不同的藥劑敏感性存在差異，如引起芹菜葉斑病的病菌有芹菜尾孢菌(Cercosporaapii)[1]，鏈格孢(Alternariaspp.)[2]，芹菜殼針孢(Septoriaapiicola)[3]和假單胞桿菌屬(Pseudomonas)[4]。目前鏈格孢屬引起的農作物病害的防治主要以化學農藥為主，如申玉香等[5]研究發(fā)現(xiàn)，苯醚甲環(huán)唑可有效防治芹菜葉斑?。获T連榮等[6]研究表明，10%的多抗霉素對鏈格孢菌(Alternariaalternata)毒力最強，EC50值為0.035 1 mg/mL；王媛媛等[7]研究表明，異菌脲對病菌的毒力作用最強，EC50值為0.36 5 mg/L，霜·錳鋅、咪鮮胺錳鹽等藥劑對玉米鏈格孢病菌也具有較好的抑制效果。金程凡[8]以10%苯醚甲環(huán)唑和40%氟硅唑對蕓薹鏈格孢(A.brassicae)進行抑制試驗，其EC50分別為0.480 2和0.942 1 mg/L；徐太東等[9]以10%苯醚甲環(huán)唑、40%氟硅唑、50%福美雙、70%代森錳鋅對多隔鏈格孢菌進行防治，其EC50分別為17.89、3.41、44.27、42.34 μg/mL，用50%嘧菌酯、43%戊唑醇、40%腈菌唑對瓜鏈格孢進行防治，其EC50分別為3.45、21.35、5.21 μg/mL；Chang Shu等[10]用烏索酸對鏈格孢的防治具有非常好的效果?！颈狙芯壳腥朦c】葉斑病對芹菜生長的危害及造成的產量損失，是目前芹菜種植過程當中主要的問題之一。細極鏈格孢引起的芹菜葉斑病目前尚未有報道，在甘肅部分地區(qū)芹菜葉斑病的防治一些常見的老品種殺菌劑防治效果并不理想。研究篩選對芹菜葉斑病(病菌為：細極鏈格孢Alternariatenuissima)具有良好防治作用的藥劑。【擬解決的關鍵問題】采用菌絲生長速率法和瓊脂片法分別用14種藥劑，測定細極鏈格孢菌絲和孢子萌發(fā)做室內毒力，運用田間試驗篩選出對細極鏈格孢引起的葉斑病防治效果最佳的殺菌劑，為芹菜葉斑病的科學防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試病原菌

2019年9月采集甘肅省定西市栽培地典型染病芹菜葉片，經前期分離得到致病菌為細極鏈格孢(A.tenuissima)[11]。

1.1.2 供試藥劑

50%多菌靈、43%戊唑醇、25%嘧菌酯、25%腈菌唑、30%琥膠肥酸銅、3%甲霜惡霉靈、40%嘧霉胺、66.5%霜霉威鹽酸鹽、10%苯醚甲環(huán)唑、72%霜脲錳鋅、22.5%啶氧菌酯、52.5%噁酮霜脲氰、30%氟環(huán)咪鮮胺；14種藥劑進行室內毒力測定。表1

1.1.3 培養(yǎng)基

培養(yǎng)基選用PDA培養(yǎng)基(馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂18 g)；試驗主要儀器為超凈工作臺、滅菌鍋，恒溫培養(yǎng)箱等。

1.2 方 法

1.2.1 14種殺菌劑對芹菜葉斑病病原菌的毒力測定

采用菌絲生長速率法[12]測定14種殺菌劑對芹菜葉斑病病原菌細極鏈格孢的抑菌情況；將芹菜葉斑病病菌置于PDA培養(yǎng)基上25℃培養(yǎng)7 d，用直徑8 mm的打孔器打取菌餅備用；將滅菌后的PDA培養(yǎng)基待冷卻到45℃時加入相應稀釋倍數(shù)的殺菌劑的量，每種藥劑分別設置5個濃度梯度，制成系列不同濃度的平板待平板冷凝后，將菌餅接種于含不同稀釋倍數(shù)殺菌劑的PDA培養(yǎng)基中央，每處理設置3個重復，以不加藥劑的PDA平板為對照，25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待空白對照長滿平板后，用十字交叉法[13]測量菌落直徑，并計算菌絲生長抑制率，抑菌率=(對照組菌落直徑-處理組菌落直徑)/對照組菌落直徑×100%。采用生物統(tǒng)計方法建立病原菌菌絲生長抑制率與藥劑濃度對數(shù)的毒力回歸方程。以殺菌劑濃度對數(shù)為橫坐標(x)，生長抑制率對應的幾率值為縱坐標(y)繪制毒力回歸曲線，求得毒力回歸方程y=a+bx，相關系數(shù)r，并以毒力回歸方程計算EC50。比較每種藥劑毒力的大小，評價不同殺菌劑對芹菜葉斑病病原菌細極鏈格孢的抑制效果，篩選出抑制效果最好的殺菌劑[14]。

1.2.2 14種殺菌劑對細極鏈格孢孢子萌發(fā)的毒力測定

采用瓊脂培養(yǎng)法[15]，并做改進，在潔凈無菌的載玻片上滴加含有不同濃度殺菌劑的1.5%水瓊脂培養(yǎng)基，待水瓊脂凝成薄層后，將有瓊脂培養(yǎng)基的一面朝上，平放在培養(yǎng)皿中的“U”形玻棒上，再吸取10 μL濃度為1.5×105的細極鏈格孢分生孢子懸浮液均勻涂抹在水瓊脂平面上，平板底部加浸水的濾紙片保溫培養(yǎng)，置于25℃溫度下，培養(yǎng)48 h，每個處理重復3次。并以不加殺菌劑為對照。在光學顯微鏡下觀察，每次鏡檢100個孢子，統(tǒng)計細極鏈格孢孢子萌發(fā)情況。萌發(fā)抑制率(%)=(對照萌發(fā)率-處理萌發(fā)率)/對照萌發(fā)率×100%[16]。求得毒力回歸方程y=a+bx，相關系數(shù)r，并以毒力回歸方程計算EC50。

1.2.3 田間藥效試驗

在定西市內官營鎮(zhèn)芹菜種植基地進行，該種植區(qū)往年芹菜葉斑病發(fā)病較重。選擇對病原菌菌絲和孢子抑制效果最好的5種藥劑(3%甲霜惡霉靈、5%香芹酚、10%苯醚甲環(huán)唑、25%嘧菌酯、43%戊唑醇)進行田間試驗，藥劑噴施按照廠家說明書，清水作為對照。試驗小區(qū)采用隨機區(qū)組設計，每小區(qū)重復3次，小區(qū)面積30 m2，于發(fā)病初期(6月)噴藥，共施藥3次，間隔10 d。第3次施藥后15 d調查發(fā)病情況，并計算發(fā)病率、防效。計算公式為：

發(fā)病率=發(fā)病株數(shù)/調查總株數(shù)×100%；

防效=(對照發(fā)病率-處理發(fā)病率)/對照發(fā)病率×100%。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)利用Excel2003和DPS 7.05數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)軟件進行數(shù)據(jù)分析，并應用Duncan氏新復極差法進行差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 藥劑對芹菜葉斑病病原菌菌絲的抑菌效果

研究表明，不同濃度梯度對芹菜葉斑病病原菌菌絲生長均有不同程度的抑制作用，濃度與抑制率呈正相關；14種供試藥劑中抑菌作用最差的為25%嘧菌酯和50%多菌靈，最高濃度下抑菌率分別為9.9%和30.1%，其余12種藥劑均有較好的抑制效果，其中72%霜脲錳鋅抑菌效果最好，最高濃度下抑菌率為85.6%，其次為5%香芹酚，最高濃度下抑菌率為83.9%。表2

表2 不同濃度藥劑下病原菌菌絲的抑制率變化

續(xù)表2 不同濃度藥劑下病原菌菌絲的抑制率變化

2.2 14種藥劑對芹菜葉斑病病原菌的室內毒力

研究表明，抑菌率與質量濃度對數(shù)值的相關系數(shù)達顯著水平，存在線性相關。14種供試藥劑對芹菜葉斑病病原菌菌絲生長抑制效果差別較大，抑制效果最好的依次為3%甲霜惡霉靈、5%香芹酚、10%苯醚甲環(huán)唑，其EC50值分別為10.8、19.9 、26.2 μg/mL；25%嘧菌酯和50%多菌靈幾乎對芹菜葉斑病病原菌無抑制效果，其EC50值均大于1 mg/L。表3

表3 不同殺菌劑下芹菜病原菌菌絲的室內毒力變化

2.3 14種藥劑對芹菜葉斑病病原菌孢子的抑菌效果

研究表明，不同濃度梯度對芹菜葉斑病病原菌孢子萌發(fā)均有不同程度的抑制作用，濃度與抑制率呈正相關；14種供試藥劑中抑菌作用最好的為50%多菌靈和43%戊唑醇，最高濃度下抑菌率分別為98%和95.5%；抑菌作用最差的為52.5%噁酮霜脲氰和30%氟環(huán)咪鮮胺，最高濃度下抑菌率分別為40.0%和37.4%。表4

表4 不同濃度藥劑下病原菌孢子的抑制率變化

續(xù)表4 不同濃度藥劑下病原菌孢子的抑制率變化

2.4 14種藥劑對芹菜葉斑病病原菌孢子的室內毒力

研究表明，抑菌率與藥劑質量濃度對數(shù)值的相關系數(shù)達顯著水平，存在線性相關。14種供試藥劑對芹菜葉斑病病原菌孢子萌發(fā)抑制效果差別較大，抑制效果最好的依次為3%甲霜惡霉靈、25%嘧菌酯、43%戊唑醇，其EC50值分別為15.7、29.5、38.7 μg/mL；其中5%香芹酚、10%苯醚甲環(huán)唑、30%氟環(huán)咪鮮等也有較好的抑制效果，66.5%霜霉威鹽酸鹽幾乎對病原菌孢子無抑制效果，其EC50值均大于1 mg/L。表5

表5 不同殺菌劑下芹菜病原菌孢子的室內毒力變化

2.5 田間防效

研究表明，5種供試藥劑對芹菜葉斑病均具一定防效，但是其防治效果差異明顯，其中，3%甲霜惡霉靈水劑250 g/667m2處理的防效最高，為96.3%；其次是5%香芹酚水劑100 mL/667m2處理和10%苯醚甲環(huán)唑微乳劑80 mL/667m2處理，防效分別為83.9%和78.9%，其余2個處理防效間無顯著差異，防效顯著低于甲霜惡霉靈處理。表6

表6 5種殺菌劑下芹菜葉斑病的防效

3 討 論

蔬菜鏈格孢葉斑病病原菌多樣性研究表明[17]，全國14個省份蔬菜主產區(qū)進行病害調查發(fā)現(xiàn)，鏈格孢屬的8個種能夠侵染包括茄科、葫蘆科、十字花科和百合科的32種寄主，具有非常廣泛的寄主。

近年來，芹菜在甘肅種植地區(qū)分布范圍較廣、規(guī)模較大、播種重茬多，再加上大棚的高溫高濕環(huán)境，發(fā)病率也有所上升，導致芹菜的產量與品質受到了嚴重的影響。在芹菜種植中對葉斑病的防治目前主要以化學農藥為主，但對細極鏈格孢引起的葉斑病防治未有報道，目前僅有張錚等[18]對三葉木通葉斑病病原菌細極鏈格孢進行過研究，藥劑篩選表明戊唑醇對該病原菌菌絲生長和孢子萌發(fā)的抑制力最強。申玉香等[5]藥劑篩選表明苯醚甲環(huán)唑可有效防治芹菜葉斑病，防效隨著用量的增加而提高，但是未能說明引起葉斑病的具體病菌。

4 結 論

14種殺菌劑中對病原菌菌絲抑制效果最好的分別為3%甲霜惡霉靈、5%香芹酚、10%苯醚甲環(huán)唑、其EC50分別為10.8、19.9、26.2 μg/mL。對孢子萌發(fā)抑制效果最好的分別為3%甲霜惡霉靈、25%嘧菌酯、43%戊唑醇，其EC50分別為15.7、29.5、38.7 μg/mL。只有3%甲霜惡霉靈對菌絲和孢子同時具有最佳的防治效果，不僅能抑制菌絲的生長還能抑制孢子進一步對植物的擴大侵染。3%甲霜惡霉靈田間防治效果最佳，防效高達96.3%。