烏骨雞禽白血病病毒感染病例的診斷

王心媛，張澤穎，楊磊，寧玲忠，蒙麗舟，馬宏超，蘇建明，雷紅宇

（湖南農業(yè)大學動物醫(yī)學院，湖南 長沙 410128）

禽白血?。ˋvian leukosis）是由禽白血病病毒（Avian leukosis virus，ALV）等引起的禽類多種腫瘤性傳染病的總稱，臨床上包括淋巴細胞性白血病、成紅細胞性白血病、成髓細胞性白血病和骨髓細胞瘤病等多種，以淋巴細胞性白血病最常見[1]。禽白血病病毒（ALV）是一種反轉錄病毒，根據(jù)其囊膜蛋白特性可分為多種亞型，其中J亞型是常見的亞型[2]。動物感染ALV后的病理變化主要是在法氏囊、肝、脾或骨髓等多器官組織出現(xiàn)腫瘤，從而導致生長遲緩、生產性能下降，以及抵抗力下降而容易感染其他病菌致使死亡率增加，嚴重危害養(yǎng)禽業(yè)的健康發(fā)展，是我國動物疫病規(guī)劃防控的主要禽病之一。烏骨雞是我國特有的藥用珍禽，在各地形成不同類型的地方品種，具有很大的發(fā)展前景[3]。這些年來，關于地方品系雞群中發(fā)生禽白血病的報道逐年增多，給烏骨雞養(yǎng)殖的發(fā)展帶來巨大威脅[4]。本文擬對一例湖南本地烏骨雞疑似ALV感染的病例進行研究，通過臨床觀察、實驗室檢測等進行診斷，為臨床上發(fā)生禽白血病的防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病例來源

疑似ALV感染病例來自于湖南省某規(guī)?；癁豕请u種雞場。

1.1.2 實驗藥劑

ALV p27抗原檢測試劑盒，購自美國IDEXX公司；Trizol試劑、反轉錄試劑盒，購自北京全式金生物科技有限公司；蘇木素、伊紅試劑，購自南昌雨露實驗器材有限公司；無水乙醇、二甲苯、石蠟、福爾馬林、甘油、氯仿、異丙醇，購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 病料采集

先從發(fā)病雞場詳細了解臨床醫(yī)學資料，根據(jù)其臨床癥狀和剖檢眼觀病理變化初步診斷，采取疑似病例的內臟器官，部分置于10%福爾馬林溶液中，部分置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。同時，采集部分病雞的精液、雞蛋清和血液，置冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 ALVp27抗原檢測

采用ELISA方法進行病料中ALV群特異性抗原p27的檢測，參照IDEXX禽白血病p27抗原檢測試劑盒說明書進行，具體如下：先將被檢樣品稀釋500倍，取100μL陰性對照、陽性對照、稀釋的被檢樣品分別加入檢測板的不同孔中，37℃下孵育1h，洗滌3～5次。每孔再加入100μL酶標抗體，37℃下孵育1h，洗滌3～5次。每孔加100μL的TMB底物溶液，室溫避光顯色15 min。最后每孔加100μL的終止液，在650 nm波長下測量其吸光度值（A650)。根據(jù)公式計算數(shù)據(jù)，公式為：S/P值=（待檢樣品OD值－陰性對照OD值）/(陽性對照OD值－陰性對照OD值）。結果判斷標準為：S/P＜0.2為陰性，S/P≥0.2為陽性。

1.2.3 病理變化觀察

對發(fā)病明顯的病雞進行剖檢，觀察并記錄各臟器眼觀病理變化。采集病雞心臟、肝臟、脾臟、肺臟及腎臟等組織器官于10%福爾馬林溶液中固定，進行常規(guī)石蠟切片及蘇木素伊紅染色，中性樹脂封片后，在光學顯微鏡下觀察其組織學病理變化。

1.2.4 RT-PCR檢測

參照胡海等[5]方法設計并合成ALV特異性P27檢測引物，上游引物序列為：5′-CCGGGGGAACTG GTTGCTAT-3′,下游引物序列為：5′-ATCTGGC TGTGACTTCTGCC-3′。采用RT-PCR對病料樣品進行ALV檢測，Trizol法提取組織總RNA，根據(jù)cDNASynthesis Kit說明書將提取的RNA逆轉錄成cDNA，各反應體系如下：利用反轉錄試劑盒反轉錄生成cDNA，并以此為模板進行PCR擴增。PCR擴增體系為：2×Taq Mix 12.5μL，ddH2O 8μL，上、下游引物各1μL，模板DNA 2.5μL，共25μL。擴增程序為：95℃預變性3min，95℃變性15s，60℃退火20s，72℃延伸60s，共35個循環(huán)；72℃再延伸10min。PCR產物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，于紫外光凝膠成像分析系統(tǒng)下觀察。

2 結果與分析

2.1 臨床癥狀與眼觀病變

根據(jù)臨床資料調查得出，病雞最早出現(xiàn)在5周齡時，到20周齡時死亡率最高。臨床上可見病雞出現(xiàn)精神萎頓、食欲減少、消瘦，觸摸可見胸骨輕微變形（圖1 A）。部分病例出現(xiàn)腹瀉、腹部腫大。剖檢可見肝臟顏色深紅，體積較正常肝臟大幾倍，其表面和切面上散在分布有結節(jié)型或彌漫型灰白色病灶，部分病例在腸系膜上也可見結節(jié)（圖1 B～D）。

圖1 病雞的臨床癥狀和眼觀病變

2.2 組織學病理變化

光學顯微鏡下病雞肝臟病變最為明顯，可見病雞肝組織的正常結構被破壞，肝索排列發(fā)生紊亂，肝細胞出現(xiàn)變性、壞死，可見核濃縮、核碎裂和核溶解。肝臟中央靜脈和小靜脈擴張，充滿大量血液，血管周邊有大量成淋巴細胞浸潤增生，呈灶狀或彌漫性分布（圖2）。

圖2 病雞肝臟的組織學病變

2.3 ALV p27抗原檢測結果

對病雞樣品進行ELISA檢測，結果顯示ALV p27抗原陽性率為100%。

2.4 RT-PCR檢測結果

取病雞的肝臟組織，提取其RNA、經反轉錄及PCR等檢測后，瓊脂糖凝膠電泳結果顯示病料樣品均擴增出225bp的目的片段（圖3），結果表明：病雞已感染ALV。

圖3 病雞肝臟PCR檢測結果

3 討論

烏骨雞是我國特有的一個家禽遺傳資源，屬肉蛋藥兼用型雞種，具有較高的營養(yǎng)價值和藥用價值，在多個地方有其優(yōu)勢品種和配套系[3]。禽白血病是一種禽類腫瘤性傳染病，該病的傳播方式主要是水平傳播和垂直傳播，臨床上以免疫抑制、生長遲緩、產蛋率下降以及多器官組織發(fā)生腫瘤為主要特征，給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經濟損失。本研究對湖南某烏骨雞種雞場采集的病料（疑似禽白血病），通過ELISA方法檢測出ALVp27抗原，通過RT-PCR檢測確定了ALV的感染，同時結合臨床癥狀和病理變化，確診該雞場出現(xiàn)由ALV所致的淋巴細胞性白血病。

對于禽白血病的檢測方法，目前已經建立的有IFA、ELISA、ISH、PCR、熒光定量RT-PCR等方法。奚德華等[6]對IFA、ELISA和RT-PCR方法進行比較，發(fā)現(xiàn)這三種方法的陽性和陰性符合率均較高，但各自有優(yōu)缺點，其中ELISA適合在臨床上使用，RT-PCR和IFA敏感性更高，適合在實驗室進行診斷。因此，在禽白血病的診斷上應該盡量結合多種方法進行。由于ALV感染后病雞出現(xiàn)免疫抑制，在臨床上常因并發(fā)其他疾病而引起雞群大量死亡[7]，因此，在診斷時應仔細區(qū)分。

雖然禽白血病在全世界流行性非常廣泛，但大多數(shù)養(yǎng)雞業(yè)發(fā)達的國家都已經基本消滅和控制。我國也采取多種措施加強對禽白血病防控，目前，對白羽肉雞和蛋雞群中該病防控與凈化已有明顯進展，且依然需要進行定期監(jiān)測。但是，由于我國地方雞群品種繁多，養(yǎng)殖環(huán)境復雜，禽白血病的防控效果成效不佳，嚴重危害了我國地方品種雞的健康發(fā)展[8]。因此，還需進一步了解ALV的流行特征和變異機制，研發(fā)快速檢測技術，切實加強各地養(yǎng)雞場（尤其是種雞場）的禽白血病監(jiān)控和凈化工作，保障養(yǎng)禽業(yè)的健康發(fā)展。