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    不同陰囊圍度湖羊睪酮和雌二醇濃度及其合成相關(guān)基因的表達(dá)水平

    2022-08-10 06:27:54劉佳美路婷婷要榮宇李發(fā)弟樂祥鵬李萬宏
    草業(yè)科學(xué) 2022年7期
    關(guān)鍵詞:圍度精子發(fā)生湖羊

    劉佳美,路婷婷,姚 婷,要榮宇,李發(fā)弟,2,樂祥鵬,李萬宏

    (1. 蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 / 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部草牧業(yè)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 / 草地農(nóng)業(yè)教育部工程研究中心 /草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院, 甘肅 蘭州 730020;2. 甘肅省肉羊繁育生物技術(shù)工程實(shí)驗(yàn)室, 甘肅 民勤 733300)

    睪丸是公羊精子發(fā)生的場所,其發(fā)育質(zhì)量直接關(guān)系到公羊的繁殖能力。Zamiri 等[1]研究表明公羊睪丸周長與精子濃度呈正相關(guān)關(guān)系。Yarney 等[2]發(fā)現(xiàn)13 月齡睪丸直徑較大的公羊每日精子產(chǎn)量較高,17 月齡睪丸直徑較大的公羊產(chǎn)生更多的精子,且精子活力更高。在牛的研究中也有類似結(jié)果,Palasz等[3]發(fā)現(xiàn)公牛陰囊圍度與精子畸形率負(fù)相關(guān)。陰囊圍較大的公牛所配的母牛受胎率也較高[4]?;诓G丸大小與精子發(fā)生和精液質(zhì)量呈正相關(guān)關(guān)系,生產(chǎn)上,往往將睪丸大小作為選擇種公羊繁殖力的重要指標(biāo)之一。在對(duì)睪丸的測量方法中,陰囊圍度測定簡單、遺傳力高,是初步評(píng)估性成熟后種公畜繁殖力的最佳指標(biāo)[5]。因此,根據(jù)陰囊圍度大小,選育具有高繁殖力的優(yōu)良種公羊,提高精子產(chǎn)量和質(zhì)量,從而提高受精率并增加優(yōu)良種公羊的后代的數(shù)量,也是養(yǎng)羊生產(chǎn)提高經(jīng)濟(jì)效益的主要途徑之一。

    睪丸大小主要由睪丸支持細(xì)胞數(shù)目所決定,同時(shí)支持細(xì)胞數(shù)目還決定了精子產(chǎn)量。睪丸發(fā)育和精子發(fā)生受到下丘腦-垂體-性腺軸系的激素調(diào)控,垂體分泌的促性腺激素分別與睪丸間質(zhì)細(xì)胞和支持細(xì)胞上受體結(jié)合后,通過調(diào)節(jié)類固醇激素合成和釋放進(jìn)而影響睪丸內(nèi)細(xì)胞增殖、精子發(fā)生等生物學(xué)事件。以往關(guān)于睪丸大小和精子發(fā)生的研究主要集中在公羊配種期階段,而初情期到性成熟階段是湖羊出生后睪丸快速發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)期,其睪丸內(nèi)環(huán)境對(duì)睪丸發(fā)育和成年后繁殖能力至關(guān)重要。孫武[6]研究發(fā)現(xiàn)湖羊精子發(fā)生與睪丸大小密切相關(guān),與小睪丸組相比,大睪丸組生殖細(xì)胞的體積和細(xì)胞核明顯較大,且生殖細(xì)胞間的胞質(zhì)橋明顯增大,GO 富集分析結(jié)果顯示促黃體素受體LHR(luteinizing hormone receptor)被顯著富集到精子發(fā)生條目。因此,為了探究不同繁殖力公羊睪丸內(nèi)類固醇激素合成差異,本研究選擇斷奶后在相同飼養(yǎng)條件下生長至165 日齡的湖羊公羔,根據(jù)陰囊圍大小,選擇大圍度組(高繁殖力)和小圍度組(低繁殖力)公羊個(gè)體,采用ELISA、實(shí)時(shí)熒光定量qPCR 及H.E 染色等方法,研究其外周血液睪酮、雌二醇水平、睪丸內(nèi)促性腺激素受體、類固醇激素合成相關(guān)基因及蛋白的表達(dá)、睪丸組織形態(tài)學(xué)以及附睪精子數(shù)的差異,為根據(jù)陰囊圍度大小選擇繁殖力高的公羔提供科學(xué)依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 試劑

    Trizol 購于TransGen Biotech,反轉(zhuǎn)錄試劑盒及熒光定量qPCR 試劑盒購于Takara,綿羊睪酮和雌二醇ELISA 檢測試劑盒購于CUSABIO,BCA 蛋白濃度測定試劑盒和PMSF 購于碧云天生物技術(shù)有限公 司,Tris-HCl (pH 7.4)、Tris-HCl (pH 8.8)、Tris-HCl(pH 6.8)、SDS 購于Solarbio,TPER 組織蛋白抽提劑和超敏ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒購于Thermo Scientific,5 × 上樣緩沖液購于Biosharp,0.45 μm PVDF 膜購于Millipore,兔多抗ACTB 購于proteintech,兔多抗FSHR、兔多抗HSD3B1 以及羊抗兔IgG (HRP)購于Abcam,三色蛋白預(yù)染marker 購于上海翊圣生物科技有限公司,Tween 20 和脫脂奶粉購于Biofroxx。

    1.2 試驗(yàn)動(dòng)物與樣品采集

    參照莫負(fù)濤[7]方法,選擇137 只體況良好的斷奶湖羊公羔在民勤中天羊業(yè)有限公司飼喂相同日糧,在相同環(huán)境下飼養(yǎng)至165 日齡。用軟尺測量所有羊只陰囊圍度大小,根據(jù)睪丸發(fā)育狀況[6]和陰囊圍大小,選取兩側(cè)睪丸發(fā)育一致的個(gè)體18 只,分為小圍度組S [(18.53 ± 0.42) cm]和大圍度組L [(27.29 ±1.13 cm],每組9 只。頸靜脈采集血液后進(jìn)行屠宰,分離睪丸鞘膜和精索后,利用天平分別測定睪丸和附睪重量,利用排水法測定睪丸體積。采集左側(cè)睪丸組織,一份保存于液氮,另一份多聚甲醛固定。

    陰囊圍度為兩側(cè)睪丸并行時(shí),陰囊最大處的水平周徑。

    睪丸體積利用排水法測定,即將睪丸放入盛滿生理鹽水的燒杯中,溢出水的體積計(jì)為睪丸體積。

    睪丸系數(shù) = 睪丸重量/體重 × 100%。

    1.3 試驗(yàn)方法

    1.3.1 睪酮和雌二醇濃度測定

    將外周血液在4 ℃條件下1 000 r·min?1離心30 min分離血清。按照說明書,利用綿羊睪酮、雌二醇ELISA 檢測試劑盒測定血清中睪酮和雌二醇。

    1.3.2 附睪精子數(shù)測定

    采集左側(cè)附睪尾部,稱取重量后剪碎,加入50 mL生理鹽水后放在37 ℃水浴鍋孵育30 min,然后利用血球計(jì)數(shù)板統(tǒng)計(jì)精子數(shù)量,精子密度用附睪組織重量進(jìn)行校準(zhǔn)。

    1.3.3 睪丸組織H.E 染色

    取睪丸組織(1 cm3)在10 %多聚甲醛中固定,脫水、透明、石蠟包埋后制作成厚度為4 μm 的切片。經(jīng)H.E 染色后,用Scopeimage 9.0 軟件在100 倍拍照并測量,每個(gè)睪丸隨機(jī)選擇6~10 個(gè)生精小管利用十字交叉法測量其直徑。

    1.3.4 睪丸組織RNA 提取與反轉(zhuǎn)錄

    利用Trizol 法提取睪丸組織總RNA,經(jīng)電泳和NanoDrop 2000 檢測總RNA 的質(zhì)量后,取總RNA 2 μL,依次加入5 μL RNase free H2O,1 μL gDNA eraser和2 μL 5 × gDNA Eraser Buffer,42 ℃ 10 min 去 除

    DNA 殘留,冰水冷卻后加入1 μL RNase free H2O,4 μL Primer Mix,4 μL 5 × PrimerScript Buffer 和1 μL RT Enzyme Mix,混勻后經(jīng)42 ℃ 25 min 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,85 ℃ 5 s 滅活后稀釋20 倍備用[8]。

    1.3.5 實(shí)時(shí)熒光定量qPCR

    利用實(shí)時(shí)熒光定量qPCR 方法檢測促性腺激素受體基因FSHR、LHR以及類固醇激素代謝相關(guān)基因STAR、HSD3B1、CYP19A1、CYP11A1和ABP表達(dá)量。引物由上海生工合成(表1)。PCR 反應(yīng)體系為:10 μL 2 × SYBR Ex Taq,4 μL ddH2O,1 μL 引物和5 μL cDNA?;靹蚝?5 ℃ 4 min;然后95 ℃ 15 s,60 ℃35 s,40 個(gè)循環(huán)。通過熔解曲線判斷引物特異性。以ACTB作為內(nèi)參基因,利用2?ΔΔCt法計(jì)算各基因的相對(duì)表達(dá)量。

    表1 熒光定量PCR 引物Table 1 Primer sequences used for qPCR

    1.3.6 Western Blot (WB)

    在液氮中充分研磨睪丸組織樣品,按照重量體積比為1 ∶ 20 將組織粉末加入到混有PMSF 的TPER 組織蛋白抽提劑(TPER ∶ PMSF=100 ∶ 1),渦旋振蕩1 min,在4 ℃和 ? 20 ℃反復(fù)凍融兩次,取上清液,用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測蛋白濃度。取稀釋至2 μg·μL?1的蛋白樣品20 μL,加入5 μL 5 × 上樣緩沖液,95 ℃變性5 min。恒壓80 V 電泳約30 min,在濃縮膠中壓成一條直線,再120 V 電泳1 h 30 min。采用負(fù)極-濾紙-膠-膜-濾紙-正極的三明治結(jié)構(gòu),恒流0.2 A 轉(zhuǎn)膜2 h。之后用5%脫脂奶粉常溫?fù)u床封閉2 h。一抗采用兔抗ACTB、FSHR、HSD3B1,分別按照1 ∶ 4 000、1 ∶ 800 和1 ∶ 1 200 稀釋,4 ℃孵育過夜。用1 ∶ 8 000 稀釋的二抗常溫?fù)u床孵育1 h。將添加了顯影液的PVDF 膜放置在BIO-RAD 凝膠成像儀中進(jìn)行掃描。采用ImageJ 進(jìn)行圖像分析。

    1.4 數(shù)據(jù)分析

    試驗(yàn)結(jié)果以平均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)誤表示,利用SPSS 13.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,利用Levene 檢驗(yàn)方差齊性,兩組間差異比較使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),P< 0.05 表示差異顯著,P< 0.01 表示差異極顯著。

    2 結(jié)果

    2.1 不同陰囊圍度湖羊的睪丸發(fā)育狀況及組織形態(tài)學(xué)觀察

    本研究測量的137 只湖羊陰囊圍度分布中(圖1),最小值為15.8 cm,最大為32.8 cm。選擇用于后續(xù)研究的18 只羊睪丸參數(shù)表明(表2),L 組湖羊陰囊圍度、睪丸重量、睪丸體積、睪丸系數(shù)、附睪重量和附睪尾部精子數(shù)量均極顯著高于S 組湖羊(P< 0.01)。L 組睪丸組織曲細(xì)精管生精上皮有多層不同發(fā)育階段的生精細(xì)胞,管腔內(nèi)可見精子(圖2),L 組睪丸組織曲細(xì)精管直徑極顯著高于S 組(P< 0.01)。

    圖2 不同陰囊圍度湖羊睪丸組織形態(tài)學(xué)觀察(100 × )Figure 2 Histomorphological observation of the testis of Hu sheep with different scrotal circumference (100 × )

    表2 不同陰囊圍度湖羊的睪丸發(fā)育狀況Table 2 Testicular development of Hu sheep with different scrotal circumference

    圖1 試驗(yàn)羊陰囊圍度直方圖Figure 1 Histogram of scrotal circumference

    2.2 不同陰囊圍度湖羊外周血液睪酮和雌二醇濃度

    與S 組相比,L 組湖羊外周血液中睪酮和雌二醇濃度均顯著升高(P< 0.05) (表3)。

    表3 不同陰囊圍度湖羊外周血液睪酮和雌二醇濃度Table 3 Plasma concentration of testosterone and estradiol in Hu sheep with different scrotal circumference

    2.3 不同陰囊圍度湖羊睪丸組織中類固醇激素代謝相關(guān)基因及蛋白表達(dá)

    與S 組相比,L 組HSD3B1、CYP19A1、ABP表達(dá)極顯著上調(diào)(P< 0.01),STAR、FSHR、LHR表達(dá)顯著上調(diào)(P< 0.05),CYP11A1基因表達(dá)上調(diào),差異不顯著(P= 0.086) (圖3)。WB 結(jié)果顯示,與S 組相比較,L 組HSD3B1 表達(dá)顯著上調(diào)(P< 0.05) (圖4、圖5)。

    圖3 不同陰囊圍度湖羊睪丸組織中類固醇激素代謝相關(guān)基因表達(dá)Figure 3 Expression of steroidogenesis-related genes in testis of Hu sheep with different scrotal circumference

    圖4 不同陰囊圍度湖羊睪丸組織中相關(guān)蛋白WB 分析Figure 4 WB analysis of steroidogenesis-related proteins in testis of Hu sheep with different scrotal circumference

    圖5 不同陰囊圍度湖羊睪丸組織中相關(guān)蛋白表達(dá)分析Figure 5 WB analysis of steroidogenesis-related proteins in testis of Hu sheep with different scrotal circumference

    3 討論

    睪酮是由睪丸間質(zhì)細(xì)胞合成和分泌的類固醇激素,高濃度的睪酮能夠促進(jìn)睪丸發(fā)育[9]。間質(zhì)細(xì)胞的增殖分化和睪酮的合成均受到垂體分泌的LH 的調(diào)控[10]。岳根華和張泉福[11]發(fā)現(xiàn)湖羊公羔出生后早期血漿LH 濃度與睪丸重量、直徑正相關(guān),且血漿LH 濃度高于晚熟品種考力代羊,說明湖羊出生后睪丸發(fā)育啟動(dòng)時(shí)間早、性成熟早與其生后早期較高血漿LH 水平有關(guān)。LH 與間質(zhì)細(xì)胞上的LHR 結(jié)合后激活cAMP-PKA 途徑和SF-1 途徑[12],促進(jìn)睪酮合成關(guān)鍵酶STAR 基因的表達(dá)[13]。膽固醇作為合成睪酮的原料,被STAR 轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體內(nèi)膜,在芳香化酶CYP11A1 的催化作用下生成孕烯醇酮,然后在光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)處經(jīng)HSD3B1 催化轉(zhuǎn)化為孕酮,之后依次經(jīng)過CYP17A1 和HSD17B3 的催化作用最終生成睪酮。在小鼠的研究中發(fā)現(xiàn),LHR敲除小鼠血清睪酮含量顯著低于野生型小鼠,睪丸曲細(xì)精管較窄,間質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量和大小顯著減少,而且精子發(fā)生在圓形精子細(xì)胞階段受阻[14]。與野生型相比,LHR基因敲除小鼠睪丸中 STAR、CYP11A1 和HSD17B3 的蛋白表達(dá)在3 周齡后均顯著降低[15]。在本研究中,L 組參與調(diào)控睪酮合成的相關(guān)基因HSD3B1在mRNA 水平極顯著上調(diào),LHR、STAR的表達(dá)顯著上調(diào),CYP11A1的表達(dá)呈上調(diào)趨勢,HSD3B1 蛋白水平也顯著上調(diào),促進(jìn)類固醇激素合成,進(jìn)而導(dǎo)致湖羊外周血液中睪酮水平顯著升高。有研究表明,在初情期前LH 和睪酮濃度更高、睪丸更大的公羊,更有利于精子的發(fā)生[16]。在Palasz 等[3]的研究中,1 周歲肉牛的睪酮峰值水平與陰囊圍度正相關(guān)。本研究中L 組間質(zhì)細(xì)胞合成睪酮能力較強(qiáng),引起外周血液睪酮濃度升高。同時(shí)合成的睪酮進(jìn)入曲細(xì)精管管腔和支持細(xì)胞分泌的ABP 結(jié)合,在曲細(xì)精管管腔內(nèi)形成局部高濃度睪酮的富集,刺激曲細(xì)精管發(fā)育和精子發(fā)生。本研究中L 組睪丸曲細(xì)精管直徑增加,生精上皮有多層不同發(fā)育階段的生精細(xì)胞,管腔內(nèi)的成熟精子增多,附睪尾部精子數(shù)也明顯增加,均說明睪酮促進(jìn)了睪丸的發(fā)育,有利于維持精子的正常發(fā)生和成熟。

    睪丸發(fā)育過程中,支持細(xì)胞的數(shù)量對(duì)睪丸的大小起著決定性作用,支持細(xì)胞在初情期時(shí)迅速增殖,在性成熟后停止增殖[17]。FSH 能夠與支持細(xì)胞表面的FSHR 結(jié)合,刺激支持細(xì)胞增殖[18]。支持細(xì)胞成熟后激活精子發(fā)生,導(dǎo)致生精上皮中精子形成[19]。FSHR 基因敲除的小鼠,初情期后睪丸體積變小[20]。本研究中,L 組睪丸中FSHR在mRNA 水平的表達(dá)顯著高于S 組,這與前期研究相一致。另外,間質(zhì)細(xì)胞合成的睪酮還可以在支持細(xì)胞中經(jīng)芳香化酶CYP19A1 的催化作用轉(zhuǎn)化成雌二醇[21],促進(jìn)支持細(xì)胞增殖和維持精子發(fā)生[22-23],有利于精子的存活[24]。睪丸組織中有大量的雌激素受體表達(dá)[25]。FSH 可通過支持細(xì)胞表面FSHR 的作用,顯著提高未成年小鼠的芳香化酶活性,引起10 日齡的小鼠雌二醇分泌提高[26]。體外研究表明,雌二醇能抑制新生期小鼠睪丸支持細(xì)胞的分化,誘導(dǎo)支持細(xì)胞的增殖[27]。在本研究中,L 組湖羊睪丸中雌二醇合成關(guān)鍵酶基因CYP19A1表達(dá)極顯著上調(diào),外周血液中雌二醇含量也隨之顯著升高,進(jìn)一步促進(jìn)曲細(xì)精管發(fā)育和精子發(fā)生,這與附睪中精子數(shù)增加相一致。

    4 結(jié)論

    綜上所述,陰囊圍度大的165 日齡湖羊公羔控制類固醇激素合成相關(guān)蛋白以及基因表達(dá)水平顯著高于陰囊圍度小的湖羊公羔,進(jìn)而導(dǎo)致陰囊圍度大的湖羊公羔的睪酮和雌二醇分泌增強(qiáng),其更具有較好的生精環(huán)境并有利于睪丸發(fā)育和精子發(fā)生。

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