珍稀瀕危植物獨(dú)花蘭研究進(jìn)展

張 慧，劉旭陽(yáng)，王仕寶，朱志凱，吳 鵬

( 1.漢中職業(yè)技術(shù)學(xué)院 藥學(xué)院；陜西 漢中 723000;2.漢中職業(yè)技術(shù)學(xué)院 秦巴山區(qū)藥(食)用植物研究所,陜西 漢中 723000;3.漢中市南鄭區(qū)食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心,陜西 漢中 723000 )

蘭科獨(dú)花蘭(ChangnieniaamoenaS. S. Chien)是我國(guó)特有的單種屬植物，其藥用價(jià)值較高，在《全國(guó)中草藥匯編》中記載：其藥材名為長(zhǎng)年蘭，以假鱗莖或全草入藥，其功效為清熱、涼血、解毒，主治咳嗽，痰中帶血，熱癤疔瘡[1]。獨(dú)花蘭的外部形態(tài)特殊、色彩美麗，全株只有一葉一花，葉片寬卵狀橢圓形至寬橢圓形，一般長(zhǎng)6.5～11.5 cm，寬5～8.2 cm，葉片上面綠色，背面紫紅色?；ㄝ沩斏?，長(zhǎng)10～17 cm，紫色，花白色、帶淡紫色或肉紅色暈，唇瓣上有紫紅色斑點(diǎn)[2]。近年來(lái)，由于環(huán)境的變化、過(guò)度的采挖及自身繁育困難等因素，導(dǎo)致獨(dú)花蘭資源急劇減少，1992年被《中國(guó)植物紅皮書—稀有瀕危植物( 第一冊(cè)) 》列為珍稀瀕危種，成為國(guó)家二級(jí)保護(hù)植物[3]。文章主要針對(duì)獨(dú)花蘭的分布區(qū)域、群落特征、繁育特征、組織培養(yǎng)育苗技術(shù)和遺傳與變異五個(gè)方面方面進(jìn)行綜述，以期為獨(dú)花蘭的深入研究提供參考依據(jù)。

1 分布區(qū)域

查閱中國(guó)植物志[2]、FRPS圖庫(kù)照片分布圖(圖1)及相關(guān)文獻(xiàn)[4～8]，得出獨(dú)花蘭分布在13個(gè)省(市)區(qū)，主要以湖北、湖南等華中地區(qū)為中心，北至河南、陜西南部，南至浙江、江西及廣西等地，西至四川，甘肅南部，東至安徽、河南一帶。此外，還包括重慶、貴州等地。另有報(bào)道[9]：獨(dú)花蘭于1970年在陜西省平利縣首次發(fā)現(xiàn)，之后四十多年再未發(fā)現(xiàn)，直到2011年和2012年分別在陜西化龍山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)內(nèi)被重新發(fā)現(xiàn)。2018-2020年，進(jìn)行中藥資源普查期間，在陜西寧強(qiáng)縣域發(fā)現(xiàn)多個(gè)獨(dú)花蘭野生分布群落[10]。

圖1 FRPS圖庫(kù)照片分布

2 群落特征

生物群落特征主要包括群落中物種的多樣性、群落的生長(zhǎng)形式、結(jié)構(gòu)、優(yōu)勢(shì)種等多個(gè)方面。獨(dú)花蘭群落一般分布于坡度15～45°的陰坡，海拔范圍常為400～1 700 m，山地黃棕壤，郁閉度40%～75%，林下腐殖質(zhì)豐富、水分充足的土壤，同時(shí)排水性良好。鄔剛等基于鄰接格子法和直接計(jì)數(shù)法，研究了英山縣現(xiàn)有的168株獨(dú)花蘭的種群數(shù)量及分布格局，利用方差/均值比率法，得出草盤鎮(zhèn)桃花沖村獨(dú)花蘭小種群為集群分布[11]。神農(nóng)架南坡獨(dú)花蘭主要分布的伴生植物，包括以化香樹、四照花、華千金榆等為主的落葉闊葉林及箬竹組成的灌叢下，北溫帶物種為群落中的優(yōu)勢(shì)物種[12]。雞公山保護(hù)區(qū)獨(dú)花蘭主要分布在落葉闊葉林和杉木林中，主要植被有水杉、樸樹、元寶槭、常春藤、絡(luò)石、山胡椒、絞股藍(lán)等[13]。貴州臺(tái)江縣獨(dú)花蘭的生境調(diào)查發(fā)現(xiàn)其生于針闊混交疏林下，主要喬木樹種有杉木、金葉子、鵝掌楸、楠木等，主要灌木有櫟屬，主要草本有苔草屬、百合屬、蝦脊蘭、金蘭等植物[14]。王仕寶等在陜西寧強(qiáng)縣區(qū)域內(nèi)落葉闊葉林或針闊混交林中發(fā)現(xiàn)了獨(dú)花蘭野生種群，其植被喬木層有殼斗科、松科及樺木科；灌木層主要有小檗科、山茱萸科、忍冬科、漆樹科、冬青科、禾本科(竹亞科)等;草本層主要包括百合科、唇形科、蘭科、鹿蹄草科、薯蕷科、禾本科(禾亞科)、龍膽科等植物[10]。

3 繁育特征

3.1 繁育與傳粉

獨(dú)花蘭是自交親和的蟲媒花，正常情況下需借助前來(lái)吮吸花粘液分泌物的昆蟲觸及隱藏在藥帽下的花粉或粘盤，將花粉塊帶到柱頭凹陷處的腔室內(nèi)完成授粉。雖然獨(dú)花蘭具有花距，但不分泌花蜜，不能為傳粉者提供回報(bào)，是欺騙性傳粉模式[15]，并且獨(dú)花蘭花期在4月份，海拔較高區(qū)域溫度較低，受訪昆蟲偏少，傳粉者較少。研究表明在獨(dú)花蘭群落內(nèi)出現(xiàn)的昆蟲有15種，為其傳粉的只有熊蜂。三條熊蜂是神農(nóng)架龍門河群體傳粉者，仿熊蜂是神農(nóng)架關(guān)門山群體的唯一傳粉者?？梢姡瑐鞣壅呦拗剖菍?dǎo)致自然結(jié)實(shí)率低的主要原因[16]。此外，結(jié)合文獻(xiàn)[17]，對(duì)獨(dú)花蘭的生理構(gòu)造研究表明，花藥帽較大，并且包蓋緊密，不利于花粉塊的外露和傳播；花粉塊柄不發(fā)達(dá)，不能將花粉塊托起將花藥帽頂開；粘盤不發(fā)達(dá)，無(wú)法將花粉塊帶出藥帽。因此，整個(gè)花期內(nèi)，如果沒有昆蟲的幫助，花粉塊將一直包藏在花藥帽下，無(wú)法正常完成授粉過(guò)程。獨(dú)花蘭的這些生物學(xué)缺陷導(dǎo)致了其只開花不結(jié)果，繁殖率低下。琚煜熙[12]跟蹤調(diào)查雞公山自然保護(hù)區(qū)內(nèi)14個(gè)分布群的340株獨(dú)花蘭，發(fā)現(xiàn)其開花株數(shù)為215株，開花率為 63.2%，結(jié)果株數(shù)僅有12株，結(jié)實(shí)率僅為5.6%。桂先群[18]分別于2008年4月24日和2014年4月25日對(duì)天堂寨自然保護(hù)區(qū)內(nèi)的獨(dú)花蘭進(jìn)行人工授粉。結(jié)果顯示，自花受粉后花被枯萎凋落，子房會(huì)伸長(zhǎng)，果實(shí)成熟期結(jié)果，未受粉的花被鮮艷，子房不會(huì)伸長(zhǎng)，果實(shí)成熟期不結(jié)果，表明獨(dú)花蘭是自交親和的異交種。同時(shí)，該試驗(yàn)除進(jìn)一步證實(shí)了獨(dú)花蘭的生物學(xué)特性是其致危的重要因素外，還對(duì)人工授粉技術(shù)提高其種群密度的應(yīng)用提供了依據(jù)。

3.2 繁育與菌根

蘭科植物作為最進(jìn)化復(fù)雜的類群之一。在自然環(huán)境下,蘭科植物的大多數(shù)種子極為細(xì)小，缺乏胚乳組織，需要和適宜的真菌共生才能萌發(fā)。獨(dú)花蘭作為蘭科植物也不例外，種子的胚發(fā)育不完全，沒有貯藏種子萌發(fā)所需的營(yíng)養(yǎng)組織，在自然條件下，獨(dú)花蘭的種子不能正常萌發(fā)；當(dāng)獨(dú)花蘭的種子與特定的真菌形成穩(wěn)定的共生關(guān)系后，才使種子利用真菌提供的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì), 繼而萌發(fā)并生長(zhǎng)成植株。武靜宇根據(jù)獨(dú)花蘭菌根真菌培養(yǎng)的特點(diǎn)及其形態(tài)學(xué)特征，初步將其菌根真菌鑒定為蘭科共生絲核菌，后采用分子生物學(xué)方法，將其菌根真菌的rDNA ITS序列進(jìn)行Blast同源比對(duì)，進(jìn)一步得出該真菌屬于膠膜菌屬[19]。有文獻(xiàn)報(bào)道獨(dú)花蘭具有典型的蘭科植物菌根構(gòu)造；分離得到的獨(dú)花蘭的菌根真菌主要屬于擔(dān)子菌和有絲孢菌的菌株，鐮刀菌屬為優(yōu)勢(shì)種屬；利用回接試驗(yàn)法來(lái)判斷從獨(dú)花蘭根中分離到的真菌是否為菌根真菌時(shí)發(fā)現(xiàn)大部分菌株對(duì)華石斛組培幼苗生長(zhǎng)有不同程度的促進(jìn)作用[20～21]?；诖耍ㄟ^(guò)篩選適合的真菌進(jìn)行獨(dú)花蘭種子的共生萌發(fā)試驗(yàn)，為有效實(shí)現(xiàn)獨(dú)花蘭植物的種質(zhì)保育，進(jìn)行瀕危野生居群的生態(tài)恢復(fù)顯得尤為重要。

3.3 繁育與營(yíng)養(yǎng)體

花的發(fā)育和開花對(duì)物種繁殖具有重要意義。對(duì)于多年生植物, 其生殖生長(zhǎng)需要建立在若干年的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)的基礎(chǔ)之上。因此，植株?duì)I養(yǎng)生長(zhǎng)狀況影響著花的發(fā)育和開花。獨(dú)花蘭的地下部生長(zhǎng)有假鱗莖，假鱗莖作為一種變態(tài)莖，是獨(dú)花蘭植物體的重要營(yíng)養(yǎng)器官，每個(gè)假鱗莖的頂端生有1個(gè)葉片，并且是花芽著生的地方。獨(dú)花蘭葉片大小能夠體現(xiàn)植株個(gè)體大小，反映植株所處的發(fā)育階段。葉片大小與地下莖體積和假鱗莖數(shù)目呈高度正相關(guān)，同時(shí)，依據(jù)葉片的大小、假鱗莖的數(shù)量及地下莖的體積大小可以判斷獨(dú)花蘭是否達(dá)到有性生殖的狀態(tài)；其葉片越大，光合作用產(chǎn)物就會(huì)越多,可以滿足有性生殖的需要。熊治廷對(duì)安徽天堂寨自然保護(hù)區(qū)內(nèi)野生獨(dú)花蘭進(jìn)行了兩月有余的連續(xù)定株觀測(cè)和群體統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)獨(dú)花蘭植株開花與否和地下假鱗莖的數(shù)目、地下莖的總體積和葉片的面積具有極顯著相關(guān)性，絕大多數(shù)開花的獨(dú)花蘭地下假鱗莖數(shù)為3，地下莖總體積通常達(dá)8 cm3，葉片的面積達(dá) 33 cm3[22]。個(gè)體較大的植株，葉片大，光合產(chǎn)物多，開花持續(xù)期較長(zhǎng)。此外，獨(dú)花蘭可依靠自身的假鱗莖進(jìn)行緩慢的無(wú)性生殖[23]，其假鱗莖具新老更替特點(diǎn)，經(jīng)過(guò)1個(gè)生長(zhǎng)季后即不再生葉開花，以后由新的假鱗莖繼續(xù)展葉開花，因老的假鱗莖所儲(chǔ)存的營(yíng)養(yǎng)物供應(yīng)了抽葶開花的需要，在花謝后老的假鱗莖呈現(xiàn)出萎縮壞死狀[22]。陳戈[24]等在春秋兩季利用假鱗莖，采取組織個(gè)體分株法進(jìn)行獨(dú)花蘭繁育，獨(dú)花蘭生長(zhǎng)2～3年可進(jìn)行1次分株，分株后至少需要有5個(gè)連接的假球莖。

4 組織培養(yǎng)育苗

為解決獨(dú)花蘭自然情況下的繁殖困難，傳粉受精與結(jié)實(shí)率較低的問(wèn)題，相關(guān)學(xué)者通過(guò)研究，成功提出了獨(dú)花蘭的快速繁育方案。Jiang[25]等分別以4月和6月份采集的假鱗莖和節(jié)段化假鱗莖為外植體，1/2MS+1.0 mg/L6-BA+0.05 mg/LNAA+10%椰子汁培養(yǎng)基為芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基，結(jié)果顯示，節(jié)段化假鱗莖上沒有芽產(chǎn)生，認(rèn)為這與假鱗莖切面上有大量酚類物質(zhì)的滲出，導(dǎo)致節(jié)段化的假鱗莖壞死有關(guān)；4月份采集的假鱗莖為外植體培養(yǎng)12周可產(chǎn)生腋芽，6月份所采的假球莖為外植體，培養(yǎng)7周后，每個(gè)外植體產(chǎn)生1.4個(gè)芽，這一現(xiàn)象與獨(dú)花蘭4月花期營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗有關(guān)，同時(shí)認(rèn)為以獨(dú)花蘭假鱗莖為外植體時(shí)，適宜采收期為6月上旬。最佳生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基為1/2MS+1.0mg/LNAA+0.1 mg/L6-BA，平均每芽生根4.5條，最高生根率為88.9%。將4～5 cm高的試管苗移栽到腐殖質(zhì):沙土(1:1)混合物的盆栽中，在溫室中生長(zhǎng)7周后移栽到大田，之后在野外生長(zhǎng)兩個(gè)月后成活率約為75%。此外，劉國(guó)順[3]、高麗[26]、劉賽思[27]等也研究了獨(dú)花蘭的組織培養(yǎng)技術(shù)。劉國(guó)順發(fā)現(xiàn)75%酒精消毒30 s，然后0.2%HgCl消毒6～7 min為外植體消毒的最佳方式，試驗(yàn)外植體的污染率為14.3%[3]。結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)，對(duì)獨(dú)花蘭不同外植體、培養(yǎng)基、誘導(dǎo)率和生根率進(jìn)行了匯總(見表1)。目前，組織培養(yǎng)育苗技術(shù)是實(shí)現(xiàn)獨(dú)花蘭快速規(guī)?；敝车囊环N有效手段。

表1 文獻(xiàn)中記載的獨(dú)花蘭組織培養(yǎng)情況

5 遺傳變異特征

基于BLAST1鑒定、遺傳變異、建樹分析，巫偉峰[28]等對(duì)12個(gè)蘭屬本地樣品和250條GenBank下載的蘭科ITS2序列(其中81條屬于蘭屬)進(jìn)行了評(píng)估。結(jié)果表明，ITS2序列在蘭屬植物的分子鑒定、親緣關(guān)系、系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系等方面具有一定的應(yīng)用價(jià)值,可作為蘭屬植物DNA條形碼鑒定的輔助條形碼。獨(dú)花蘭作為蘭科的單種屬植物，可以結(jié)合ITS2序列對(duì)同族植物進(jìn)行研究DNA條形碼和系統(tǒng)發(fā)育的關(guān)系。為了研究獨(dú)花蘭的分類地位，Yi[29]利用下一代測(cè)序技術(shù)測(cè)定了獨(dú)花蘭的葉綠體全基因組序列，結(jié)果表明獨(dú)花蘭與布袋蘭親緣關(guān)系較近。Li[30～31]結(jié)合傳粉和生態(tài)學(xué)的研究結(jié)果，利用用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA(RAPD)技術(shù)對(duì)獨(dú)花蘭的遺傳多樣性水平和分配進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，可能是由于生境破壞致使獨(dú)花蘭數(shù)量減少甚至局部滅絕，基因流動(dòng)受限導(dǎo)致獨(dú)花蘭群體內(nèi)變異低而群體間變異大；并提出了獨(dú)花蘭棲息地保護(hù)和傳粉者保護(hù)、人工授粉以及遷地保護(hù)的保護(hù)管理措施。孫海芹[32]等采用(單因素方差分析法)和UPGMA聚類分析等方法，研究了分布于神農(nóng)架、廬山和新寧的12個(gè)自然居群獨(dú)花蘭的形態(tài)變異，發(fā)現(xiàn)廬山居群13個(gè)性狀的平均觀測(cè)值均高于新寧和神農(nóng)架居群，在物種水平上各性狀存在較多的變異，并且營(yíng)養(yǎng)器官變異性較高。單因素方差分析結(jié)果顯示3個(gè)地區(qū)間多個(gè)形態(tài)性狀存在極顯著差異；UPGMA聚類分析表明這3個(gè)地區(qū)分別形成明顯不同的分支。在以傳粉者為媒介自然選擇的影響下，神農(nóng)架龍門河和關(guān)門山兩個(gè)地點(diǎn)間存在明顯的形態(tài)分化。

6 展望

目前，關(guān)于獨(dú)花蘭的研究報(bào)道相對(duì)較少，主要集中在分布區(qū)域、群落特征、繁育特征、組織培養(yǎng)育苗技術(shù)及遺傳與變異等方面，尚未見關(guān)于獨(dú)花蘭的化學(xué)成分、藥理作用等方面的報(bào)道，這可能與獨(dú)花蘭為瀕危植物，資源稀缺有較大關(guān)系。獨(dú)花蘭是一種珍貴的瀕危藥用植物，具有較高的藥用價(jià)值；且獨(dú)花蘭耐陰又耐寒，植株矮小，花色艷麗，具有較高的觀賞價(jià)值，是室內(nèi)培養(yǎng)的良好的花卉品種，這便導(dǎo)致了獨(dú)花蘭采挖過(guò)度，資源減少。同時(shí)，獨(dú)花蘭對(duì)傳粉者的高度依賴和專一性，致使傳粉困難，結(jié)實(shí)率低，還有種子的萌發(fā)也需要與菌根真菌形成共生關(guān)系，在適宜的溫度和濕度下才能萌發(fā)，生態(tài)環(huán)境的破壞可能影響其傳粉者和菌根真菌，從而影響?yīng)毣ㄌm的自然生長(zhǎng)與繁育，這又進(jìn)一步導(dǎo)致了獨(dú)花蘭資源的稀缺。針對(duì)現(xiàn)狀，應(yīng)該積極采取應(yīng)對(duì)措施保護(hù)獨(dú)花蘭生境，利用人工授粉和組織培養(yǎng)育苗技術(shù)提高獨(dú)花蘭的繁育率，豐富其資源。在此基礎(chǔ)上，對(duì)獨(dú)花蘭進(jìn)行更深入的研究，以期在藥用、生態(tài)、遺傳及觀賞等方面體現(xiàn)更高的綜合價(jià)值。