嗜堿性粒細(xì)胞在過敏性疾病中研究進(jìn)展及臨床應(yīng)用展望

鐘文偉 李京陽 耿麗婷 張建華

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院（上海 200092）

Th2免疫應(yīng)答是包括支氣管哮喘在內(nèi)的過敏性疾病發(fā)病的最重要的免疫學(xué)機(jī)制。多種免疫細(xì)胞、炎癥細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子、炎癥遞質(zhì)相互協(xié)同在過敏性炎癥的形成和發(fā)展過程中起著關(guān)鍵作用。在眾多免疫細(xì)胞中，嗜堿性粒細(xì)胞（basophil，Ba）在過敏性疾病發(fā)病機(jī)制中的作用逐漸引起關(guān)注，尤其是作為生物標(biāo)記物在過敏性疾病診斷以及療效評價(jià)中的價(jià)值是目前研究的熱點(diǎn)。本文就Ba在過敏性疾病發(fā)病機(jī)制中的進(jìn)展及其臨床應(yīng)用前景作一闡述。

1 嗜堿性粒細(xì)胞基礎(chǔ)研究

Ba 是一類發(fā)現(xiàn)早，但長期被忽視的免疫細(xì)胞。Ba 在外周血中含量很低，僅占白細(xì)胞總數(shù)0.5%左右。Ba 一直被認(rèn)為是參與Th 2 免疫應(yīng)答的下游效應(yīng)細(xì)胞。近年來隨著對Ba研究的進(jìn)一步深入，人們對Ba 及其功能有了新的發(fā)現(xiàn)和認(rèn)識，認(rèn)為其在過敏性疾病發(fā)病機(jī)制中起著始動(dòng)者、效應(yīng)者和調(diào)節(jié)者作用[1-3]。

1.1 啟動(dòng)Th2免疫應(yīng)答

近20 年來對于Ba 是否具有抗原遞呈細(xì)胞功能做了大量研究。最早Nature Immunology等雜志連續(xù)報(bào)道了關(guān)于Ba 具有抗原遞呈功能的研究結(jié)果[4-6]。首先，研究發(fā)現(xiàn)在變應(yīng)原致敏早期Ba在引流淋巴結(jié)中顯著升高且在時(shí)間上早于Th2細(xì)胞和IL-4水平升高，而且發(fā)現(xiàn)Ba和T細(xì)胞在局部淋巴結(jié)中存在細(xì)胞-細(xì)胞接觸現(xiàn)象[7-10]。其次，Ba 在體內(nèi)外研究中發(fā)現(xiàn)可攝取可溶性抗原卵清蛋白（ovalbumin，OVA）。再次，體內(nèi)、外研究發(fā)現(xiàn)Ba可表達(dá)共刺激分子CD80、CD86、CD40，并在IgE/抗原復(fù)合物刺激下即刻大量釋放IL-4[4-6,11-12]，在體外也證實(shí)了Ba 可通過IL-4自分泌形式（無外源性IL-4的條件下）單獨(dú)促進(jìn)Th2細(xì)胞分化的結(jié)果[4-6,8-9,12-13]。最后在哮喘、過敏性皮炎等動(dòng)物模型中，采用特異性抗體剔除循環(huán)Ba可顯著抑制變應(yīng)原特異性Th2細(xì)胞產(chǎn)生，并伴sIgE水平降低和氣道過敏性炎癥減輕[11-12]。相反，回輸體外OVA“致敏”Ba到正常小鼠后可產(chǎn)生OVA-sIgE和OVA特異性Th2細(xì)胞并產(chǎn)生過敏性氣道炎癥[11-12]，這些體內(nèi)、外研究充分表明Ba通過抗原遞呈功能在Th 2 免疫應(yīng)答始動(dòng)階段起著關(guān)鍵作用。但有學(xué)者認(rèn)為Ba這種抗原遞呈功能不是專職的，Ba無法遞呈不溶性抗原成分，因此其抗原遞呈功能比較單一[14]。一些研究發(fā)現(xiàn)盡管Ba表面可以檢測到MHC-II分子蛋白成分，但無法在mRNA水平檢測到MHC-II分子或僅檢測到低水平表達(dá)[3,15]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)Ba通過胞啃作用(trogocytosis)機(jī)制從DCs獲得MHC-II-肽段[14,16]。因而，目前推測Ba可能通過3種不同模式參與始動(dòng)Th 2 免疫應(yīng)答[17]：①Ba 通過抗原遞呈功能，表達(dá)共刺激分子，分泌早期“IL-4”單獨(dú)啟動(dòng)Th2細(xì)胞定向分化；②Ba通過分泌IL-4等促Th2類細(xì)胞因子輔助樹突狀細(xì)胞（dendritic cells，DCs）啟動(dòng)Th2細(xì)胞定向分化；③Ba還可以通過胞啃作用機(jī)制從DCs 獲得MHC II-肽段進(jìn)而發(fā)揮其抗原遞呈細(xì)胞功能[8,16]。

1.2 記憶性免疫應(yīng)答

Ba研究的另一關(guān)注點(diǎn)是其對記憶性免疫應(yīng)答中的作用。研究提示Ba在記憶性免疫應(yīng)答中起著重要作用[8-9,18]。首先，在動(dòng)物模型中輸入或剔除Ba可顯著影響記憶性Th2免疫應(yīng)答，而將Ba輸入到OVA致敏小鼠可顯著增強(qiáng)記憶性Th 2 免疫應(yīng)答[19]。其次，體外研究發(fā)現(xiàn)，將來源于OVA致敏激發(fā)后小鼠肺組織中的Ba與肺組織效應(yīng)性T細(xì)胞共培養(yǎng)可顯著延長T 細(xì)胞存活時(shí)間，促進(jìn)單細(xì)胞水平的Th 2 細(xì)胞因子表達(dá)[19]。而且，人Ba在體外也可增強(qiáng)記憶性Th2細(xì)胞分泌IL-4[9,19]。再者，Ba參與Th2免疫應(yīng)答涉及細(xì)胞間相互接觸。在Th2免疫應(yīng)答模型中觀察到Ba在受感染組織與記憶性T 細(xì)胞有著動(dòng)態(tài)接觸，并增強(qiáng)記憶性T細(xì)胞釋放IL-4[7]。除Ba增強(qiáng)Th2免疫應(yīng)答外，活化的Ba在體外可在沒有DCs參與下增強(qiáng)記憶性Th17反應(yīng)[20-21]，而Th17則是參與過敏性氣道炎癥的重要免疫細(xì)胞[22-23]。Ba還可通過促進(jìn)B細(xì)胞增殖和抗體產(chǎn)生增強(qiáng)記憶性B 細(xì)胞免疫應(yīng)答[24-26]。可見，Ba在增強(qiáng)記憶性T細(xì)胞、記憶性體液免疫，尤其是記憶性Th2免疫應(yīng)答中起著重要作用，然而Ba以何種機(jī)制參與記憶性Th2免疫應(yīng)答仍未闡明。

2 臨床應(yīng)用

過敏性疾病如哮喘、變應(yīng)性鼻炎等是兒童時(shí)期常見疾病，其發(fā)病率呈逐年升高趨勢。在過敏性疾病的診治中臨床醫(yī)師經(jīng)常困惑的問題是：是不是過敏？是什么過敏？以及治療后會不會再過敏？這些問題的核心是可靠的診斷手段以及監(jiān)測病情變化的可靠生物學(xué)標(biāo)記。大量臨床研究表明基于嗜堿性粒細(xì)胞活化狀態(tài)的嗜堿性粒細(xì)胞活化試驗(yàn)（basophil activation test，BAT）在過敏性疾病診斷以及病情監(jiān)測中具有很好的臨床應(yīng)用前景。

2.1 嗜堿性粒細(xì)胞活化試驗(yàn)

Ba 和肥大細(xì)胞是I 型變態(tài)反應(yīng)中的關(guān)鍵效應(yīng)細(xì)胞，兩種細(xì)胞表面都表達(dá)IgE 高親和力受體FcεRI[27]。在致敏個(gè)體中，高親和力IgE 受體和變應(yīng)原特異性IgE（specific IgE，sIgE）結(jié)合，當(dāng)接觸變應(yīng)原時(shí)通過sIgE和膜高親和力IgE受體結(jié)合交聯(lián)而脫顆粒，并迅速上調(diào)活化標(biāo)記CD63（定位于溶酶體的一種膜蛋白，脫顆粒過程中CD63向細(xì)胞膜移位）和CD 203 c，通過流式細(xì)胞儀檢測這些特異性表面標(biāo)記表達(dá)情況可判斷機(jī)體是否存在對特定變應(yīng)原過敏[28]。由于肥大細(xì)胞主要存在于組織，無法直接檢測肥大細(xì)胞脫顆?，F(xiàn)象。而Ba盡管在外周血中含量少，但仍然可以利用特異性表面標(biāo)記通過流式細(xì)胞儀檢測。BAT就是利用Ba的生物 學(xué)特點(diǎn)基于流式細(xì)胞術(shù)而開發(fā)的檢測方法。BAT是一種體外功能試驗(yàn)，體外模擬I型變態(tài)反應(yīng)并測量變應(yīng)原刺激后Ba脫顆粒的程度。Ba活性有兩種常用的測量方法：Ba反應(yīng)性（對特定變應(yīng)原刺激產(chǎn)生脫顆粒反應(yīng)的Ba 數(shù)量）和Ba變應(yīng)原敏感性閾值（basophil allergen threshold sensitivity，CD-sens，50%Ba對特定變應(yīng)原發(fā)生脫顆粒時(shí)的變應(yīng)原濃度），前者主要應(yīng)用于過敏性疾病的診斷，而后者主要用于監(jiān)測過敏性疾病治療評估及對變應(yīng)原耐受的自然進(jìn)程。BAT是一種功能性分析，其結(jié)果不僅取決于sIgE的數(shù)量，還取決于其親和力，取決于是否存在其他同型抗體（如IgG4）[28-30]。

2.2 BAT在食物過敏中的應(yīng)用價(jià)值

食物過敏是兒童時(shí)期常見過敏性疾病，表現(xiàn)為口腔過敏綜合征、胃腸道過敏反應(yīng)、蕁麻疹、濕疹、鼻結(jié)膜過敏、支氣管痙攣的多系統(tǒng)表現(xiàn)[31-32]。目前食物過敏診斷基于臨床病史結(jié)合血液中sIgE和/或皮膚點(diǎn)刺試驗(yàn)（skin prick test,SPT）結(jié)果?？诜澄锛ぐl(fā)試驗(yàn)(oral food challenge,OFC)是診斷食物過敏的金標(biāo)準(zhǔn)。其中sIgE和SPT這兩種檢測方法靈敏度高但特異性低，陽性變應(yīng)原不一定是引起食物過敏的真正變應(yīng)原，不能區(qū)分致敏和過敏，給臨床判斷是否存在該類食物過敏帶來困惑。作為診斷食物過敏金標(biāo)準(zhǔn)的OFC由于不僅耗時(shí)而且存在嚴(yán)重過敏反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)，臨床上較少采用[32-33]。因而臨床上需要一種靈敏度和特異度高且風(fēng)險(xiǎn)小的診斷方法。臨床研究發(fā)現(xiàn)BAT作為一種模擬體外過敏反應(yīng)的檢測手段是一種很有希望取代OFC 的診斷方法。BAT 已被驗(yàn)證用于IgE 介導(dǎo)的食物過敏診斷，并顯示出高度的靈敏度和特異度。BAT 診斷食物過敏的準(zhǔn)確性高于sIgE和SPT，特異度在75%到100%之間，靈敏度在77%到98%之間[34]。不僅如此，BAT還能夠?qū)⑴R床過敏患者與致敏但耐受的患者區(qū)分開來[35-36]。除此之外，Ba反應(yīng)性還有助于區(qū)分能否耐受加熱處理的牛奶和雞蛋變應(yīng)原[37-39]。由于是體外診斷方法，BAT 沒有任何引起嚴(yán)重過敏反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。因而BAT在食物過敏診斷中有著傳統(tǒng)診斷方法所不具備的優(yōu)勢，極具臨床應(yīng)用前景。

2.3 BAT在藥物過敏中的應(yīng)用價(jià)值

藥物過敏是一個(gè)重要的健康問題，診斷錯(cuò)誤會造成嚴(yán)重后果。一方面假陽性結(jié)果導(dǎo)致不必要的藥物回避，造成臨床上用藥困難；另一方面假陰性結(jié)果可能會造成藥物過敏，產(chǎn)生更為嚴(yán)重的后果。因而準(zhǔn)確判斷藥物過敏在臨床工作中尤為重要。目前藥物過敏診斷手段主要有藥物皮膚試驗(yàn)、特異性IgE 以及藥物激發(fā)試驗(yàn)等，前兩種診斷方法總體上特異度和靈敏度通常比較低，皮試假陽性率高，特異度IgE靈敏度低[40-41]。藥物激發(fā)試驗(yàn)是診斷藥物過敏的金標(biāo)準(zhǔn)，但存在發(fā)生嚴(yán)重過敏反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)[41]。BAT 在藥物過敏診斷中的研究較為深入和廣泛，涉及多種類藥物。研究發(fā)現(xiàn)BAT 在診斷神經(jīng)肌肉阻滯、β-內(nèi)酰胺類抗生素、喹諾酮類抗生素、造影劑，非甾體抗炎藥藥物過敏中有著較高靈敏度和特異度。如在診斷神經(jīng)肌肉阻滯過敏中其靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值（PPV）和陰性預(yù)測值（NPV）通常分別在50%～100%、85%～90%、85%～100%和55%～80%之間。對于β-內(nèi)酰胺類抗生素，其靈敏度、特異度、PPV 和NPV 則分別在30%～55%、80%～100%、50%～90%、55%左右[42]。尤為重要的是BAT 可檢測出皮膚試驗(yàn)陰性的藥物過敏患者[43-45]。BAT 還可應(yīng)用于發(fā)現(xiàn)藥物交叉過敏反應(yīng)。不像藥物皮膚試驗(yàn)和特異性IgE 檢測，其檢測受到變應(yīng)原皮試液和檢測試劑限制，只能對有限的藥物進(jìn)行檢測，BAT則沒有上述限制，幾乎對所有可疑藥物進(jìn)行檢測。另外，和食物過敏診斷一樣，BAT作為體外診斷方法沒有安全性顧慮。

2.4 BAT在預(yù)測輸血過敏反應(yīng)中的應(yīng)用價(jià)值

輸血反應(yīng)是臨床上可危及生命的急重癥，其中輸血過程中引起的輸血過敏反應(yīng)（allergic transfusion reactions，ATRs）目前仍無檢測手段早期發(fā)現(xiàn)并予以預(yù)防。近來，有限臨床研究發(fā)現(xiàn)被動(dòng)免疫BAT（passive immune basophil activation test，pi-BAT)可預(yù)測輸血過程中的過敏反應(yīng)[46-47]。其原理是分離正常人嗜堿性粒細(xì)胞并脫去細(xì)胞表面IgE，加入受體血漿和配體血漿，在出現(xiàn)過敏反應(yīng)患者中存在變應(yīng)原特異性IgE，配體血漿中存在變應(yīng)原，因而可通過IgE/FcεR受體通路活化嗜堿性粒細(xì)胞。Yasui等[46]在對9 例無ATRs 和22 例ATRs 病例進(jìn)行pi-BAT 檢測，發(fā)現(xiàn)10例中重度ATRs病例中有9例pi-BAT陽性，而9例無ATRs中pi-BAT檢測均為陰性。該研究為臨床識別潛在ATRs 患者，尤其是中重度ATRs 患者提供了有效手段。但pi-BAT 在預(yù)測ATRs 中的臨床價(jià)值仍有待大樣本臨床研究。

另外，BAT 在慢性蕁麻疹[48-49]、局部變應(yīng)性鼻炎[50]、昆蟲毒液過敏[51]等多種過敏性疾病的診斷中有著診斷價(jià)值。

2.5 BAT在監(jiān)測過敏性疾病及治療評估的價(jià)值

Ba敏感性是一種穩(wěn)定且可重復(fù)的測量方法，可用于評估變應(yīng)原特異性免疫治療（allergen specific immunotherapy，AIT）及生物制劑治療的療效。研究發(fā)現(xiàn)在AIT 治療過程中，隨著患者對變應(yīng)原耐受性增加Ba對相應(yīng)變應(yīng)原的敏感性顯著降低。AIT后Ba變應(yīng)原敏感性的降低是由于sIgG（尤其是IgG4）升高，sIgG可與細(xì)胞結(jié)合的sIgE競爭變應(yīng)原，導(dǎo)致Ba對相應(yīng)變應(yīng)原敏感性降低。食物過敏進(jìn)行免疫治療過程中，Ba對相應(yīng)食物變應(yīng)原的反應(yīng)性在治療期間降低，因而可作為食物過敏免疫治療的臨床反應(yīng)的監(jiān)測手段。在毒液特異性免疫治療中，患者外周血Ba對相應(yīng)毒素的敏感性顯著下降，而Ba敏感性持續(xù)維持高水平患者在停止免疫治療后出現(xiàn)過敏風(fēng)險(xiǎn)顯著增加[52]。

生物制劑是過敏性疾病治療的重要手段。研究發(fā)現(xiàn)BAT在監(jiān)測生物制劑治療反應(yīng)中有著顯著臨床價(jià)值。研究發(fā)現(xiàn)在使用奧馬珠單抗治療期間，反映Ba敏感性的指標(biāo)CD-sens顯著下降，而停止治療后恢復(fù)到預(yù)處理水平。在奧馬珠單抗治療牛奶過敏的兒童中Ba 對牛奶敏感性的改善可預(yù)測其對牛奶耐受結(jié)局[53]。在哮喘患者，Ba敏感性還可用于識別對該治療有反應(yīng)的患者和評估治療效果。

嗜堿性粒細(xì)胞作為生物標(biāo)記物其在哮喘管理中的作用仍在探索中。喘息癥狀在兒童時(shí)期十分常見，其中既有急性呼吸道感染誘發(fā)的哮喘急性發(fā)作，也有單純呼吸道感染誘發(fā)的喘息性支氣管炎，臨床上無法通過喘息癥狀來診斷哮喘[54-55]。目前小年齡兒童哮喘診斷、治療主要基于其喘息發(fā)作頻率以及按改良哮喘預(yù)測指數(shù)（mAPI）預(yù)測是否存在哮喘高危風(fēng)險(xiǎn)而做出[56-58]。然而基于mAPI的哮喘預(yù)測陽性率為60%～70%，有較高的漏診率[59-61]。為此筆者團(tuán)隊(duì)通過建立反復(fù)喘息兒童的隊(duì)列，探討外周血嗜堿性粒細(xì)胞活化狀態(tài)在早期診斷哮喘中的價(jià)值。通過2年隨訪筆者團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)診斷哮喘的喘息兒童中以CD63或CD203c為標(biāo)記的嗜堿性粒細(xì)胞活化試驗(yàn)陽性率（CD63-BAT或CD203c-BAT）顯著高于未診斷哮喘的喘息兒童，哮喘陽性預(yù)測值均高于傳統(tǒng)API的陽性預(yù)測值[62]。當(dāng)然，由于研究是小樣本探索性研究，研究結(jié)論有待大樣本臨床研究進(jìn)一步確定。

2.6 BAT在過敏性疾病中應(yīng)用的優(yōu)點(diǎn)和不足

BAT 的優(yōu)勢十分明顯，如需要血標(biāo)本量少；檢測時(shí)間短，適合快速診斷報(bào)告；靈敏度和特異度高；結(jié)果直觀，可動(dòng)態(tài)監(jiān)測；體外模仿過敏反應(yīng)過程，結(jié)果可靠且可避免過敏原激發(fā)造成的風(fēng)險(xiǎn)等。BAT的缺點(diǎn)在于檢測費(fèi)用高，臨床尚不能普及；嗜堿性粒細(xì)胞易受外界因素干擾，操作要求高；不適合多種過敏原篩查；缺乏充分臨床研究數(shù)據(jù)以確定正常范圍；約 5%～10%人群嗜堿性粒細(xì)胞對刺激物反應(yīng)等。因而BAT 適合以下情況：①已知SPT 引起假陽性；②缺乏相應(yīng)試劑用于SPT 或sIgE 檢測；③癥狀和SPT 結(jié)果不一致；④SPT 可能會導(dǎo)致嚴(yán)重過敏反應(yīng)；⑤激發(fā)試驗(yàn)前評估可能變應(yīng)原。

3 總結(jié)與展望

Ba是一類含量較少的重要免疫細(xì)胞，其在Th2免疫應(yīng)答和過敏性疾病中起著重要作用，但是其是否具備專業(yè)抗原遞呈細(xì)胞功能仍有爭議。目前認(rèn)為Ba可能通過單獨(dú)或與DCs相互配合（分泌IL-4及通過細(xì)胞啃作用從DCs獲得MHC-II類分子）參與Th2免疫應(yīng)答的始動(dòng)環(huán)節(jié)。另外Ba在體內(nèi)外均有增強(qiáng)記憶性Th2、Th17細(xì)胞現(xiàn)象，但具體機(jī)制仍未闡明，有待進(jìn)一步研究明確。作為過敏反應(yīng)的重要效應(yīng)細(xì)胞，嗜堿性粒細(xì)胞在臨床中的應(yīng)用價(jià)值越來越引起關(guān)注。BAT目前處于臨床應(yīng)用前的探索階段，尚未廣泛應(yīng)用于臨床。臨床研究發(fā)現(xiàn)BAT在多種過敏性疾病的診斷中有著敏感性和特異性高且可避免過敏原激發(fā)造成的風(fēng)險(xiǎn)的獨(dú)特優(yōu)勢，有望在不久的將來成為診斷過敏性疾病的重要手段（圖1）。而基于BAT 原理發(fā)展而來的CD-sens在監(jiān)測過敏性疾病進(jìn)程、SIT和生物制劑療效中具有作為生物學(xué)標(biāo)記的潛在價(jià)值，但仍然需要大樣本臨床研究明確。

圖1 嗜堿性粒細(xì)胞臨床應(yīng)用前景