實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)棘球絳蟲(chóng)方法的建立及應(yīng)用

趙福振，都 勇，蔣曉霞，李玉全，周傲白雪，李寒雪，諶升友，羅寶正

棘球蚴病又稱包蟲(chóng)病，是一種由棘球絳蟲(chóng)中絳期(metacestode)幼蟲(chóng)寄生于人或動(dòng)物體內(nèi)而引起的一種危害嚴(yán)重的人獸共患寄生蟲(chóng)病，在世界范圍內(nèi)嚴(yán)重危害人體健康和畜牧業(yè)發(fā)展[1]。棘球絳蟲(chóng)目前共5種，包括細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)(Echinococcusgranulosus)、多房棘球絳蟲(chóng)(Echinococcusmultilocularis)、少節(jié)棘球絳蟲(chóng)(Echinococcusoligarthra)、福氏棘球絳蟲(chóng)(Echinococcusvogeli)和石渠棘球絳蟲(chóng)(Echinococcusshiquicus)。在我國(guó)主要存在的是細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)、多房棘球絳蟲(chóng)和石渠棘球絳蟲(chóng)。棘球蚴病呈全球性分布，我國(guó)主要流行于西藏、四川、青海、寧夏等省(自治區(qū))，其中屬四川省甘孜藏族自治州最為嚴(yán)重[2]。目前，我國(guó)人獸之間主要流行的囊性棘球蚴病和泡型棘球蚴病分別是由細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)和多房棘球絳蟲(chóng)感染引起[3]，少有其它棘球絳蟲(chóng)感染人的病例。

棘球絳蟲(chóng)的終末宿主要是犬、貓、狐、狼等食肉類動(dòng)物，牛、羊等有蹄類動(dòng)物是常見(jiàn)的中間宿主[3]，人類通過(guò)誤食絳蟲(chóng)蟲(chóng)卵被感染后也可成為中間宿主。棘球蚴中的原頭蚴可在終末宿主小腸內(nèi)發(fā)育成成蟲(chóng)，并產(chǎn)生蟲(chóng)卵。蟲(chóng)卵會(huì)隨宿主糞便排出，影響周邊水源等環(huán)境，中間宿主感染后，蟲(chóng)卵會(huì)在體內(nèi)發(fā)育成棘球蚴，幾乎可以感染任何器官(尤其是肝臟)，導(dǎo)致器官發(fā)生功能障礙，嚴(yán)重的可致死亡。棘球蚴和蟲(chóng)卵是棘球絳蟲(chóng)的不同生長(zhǎng)階段，遺傳物質(zhì)信息保持不變。本文使用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)，根據(jù)5種棘球絳蟲(chóng)的線粒體基因序列設(shè)計(jì)引物探針，建立一種對(duì)終末宿主和中間宿主快速、高效、靈敏的檢測(cè)方法以進(jìn)行早期診斷，發(fā)現(xiàn)問(wèn)題及時(shí)進(jìn)行驅(qū)蟲(chóng)消毒治療等工作，在一定程度上可切斷棘球絳蟲(chóng)的傳染鏈條，對(duì)棘球蚴病防控環(huán)節(jié)可發(fā)揮重要作用，期望為棘球蚴病的預(yù)防和控制環(huán)節(jié)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 樣本 犬糞便樣本84份，為中國(guó)疾病預(yù)防控制中心寄生蟲(chóng)病預(yù)防控制所的測(cè)評(píng)樣本，其中陽(yáng)性樣品為實(shí)驗(yàn)室人工感染的陽(yáng)性犬糞樣品，陰性樣品為非棘球蚴病流行區(qū)家犬糞便樣品?；疾∨！⒀蚪馄实牟∽兘M織樣本及其囊液共18份，由天之泰生物技術(shù)研究院(珠海)有限公司提供，已對(duì)病變組織解剖并觀察確診為陽(yáng)性；犬弓首蛔蟲(chóng)(Toxocaracanis)、多頭絳蟲(chóng)(Taeniamulticeps)、豬帶絳蟲(chóng)(Taeniasolium)、牛帶絳蟲(chóng)(Taeniasaginata)基因組DNA各1份，為實(shí)驗(yàn)室保存樣本；陽(yáng)性質(zhì)粒為含有目的基因的重組質(zhì)粒，由上海旭冠生物科技發(fā)展有限公司合成。

1.2 主要試劑 熒光PCR反應(yīng)試劑使用珠海寶銳生物科技有限公司的“Superstart Premix plus(Probe qPCR)”產(chǎn)品，DNA提取試劑盒使用Omega Bio-Tek公司的“Stool DNA Kit”產(chǎn)品和“Tissue DNA Kit”產(chǎn)品，

1.3 主要儀器設(shè)備 ABI QuantStudio 5實(shí)時(shí)熒光PCR儀，ABI QuantStudio 7實(shí)時(shí)熒光PCR儀，eppendorf 5424R高速冷凍離心機(jī)。

1.4 引物探針設(shè)計(jì) 在NCBI GenBank基因庫(kù)中，針對(duì)細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)(MN787561.1)、多房棘球絳蟲(chóng)(AB777918.1)、少節(jié)棘球絳蟲(chóng)(AB208545.1)、福氏棘球絳蟲(chóng)(AB208546.1)和石渠棘球絳蟲(chóng)(AB159139.1)線粒體COX1基因序列，選擇高度同源區(qū)域(圖1)，利用生物分析軟件OLIGO 7.0設(shè)計(jì)一組特異性引物、探針(表1)。引物、探針均由賽默飛公司合成。

圖1 5種絳蟲(chóng)蚴COX1部分序列比對(duì)及特異性引物結(jié)合位點(diǎn)

表1 棘球絳蟲(chóng)引物和探針序列

1.5 樣本DNA提取 按照Omega Bio-Tek公司的“Stool DNA Kit”產(chǎn)品和“Tissue DNA Kit”產(chǎn)品的使用說(shuō)明書(shū)提取。糞便樣本使用“Stool DNA Kit”產(chǎn)品提取，病變組織樣本使用“Tissue DNA Kit”產(chǎn)品提取。

1.6 反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序 反應(yīng)體系(25 μL)：實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)試劑(2×)12.5 μL，上游引物(10 μmol/L)1 μL，下游引物(10 μmol/L)1 μL，探針(10 μmol/L)0.5 μL，DNA模板5 μL，滅菌超純水補(bǔ)至25 μL。

擴(kuò)增程序：95 ℃ 5 min；(95 ℃ 15 s，55 ℃ 30 s)×40個(gè)循環(huán)，55 ℃ 30 s處收集熒光，報(bào)告基團(tuán)為FAM。

1.7 方法建立 使用陽(yáng)性質(zhì)粒，通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)對(duì)反應(yīng)條件、反應(yīng)程序等參數(shù)進(jìn)行測(cè)試，包括引物探針濃度、擴(kuò)增程序參數(shù)。

1.8 靈敏度試驗(yàn) 將陽(yáng)性質(zhì)粒以10倍梯度進(jìn)行稀釋，對(duì)經(jīng)梯度稀釋的陽(yáng)性質(zhì)粒分別使用上述1.6反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序進(jìn)行熒光PCR檢測(cè)，驗(yàn)證所建立方法的靈敏度。

1.9 特異性試驗(yàn) 以1.1中的犬弓首蛔蟲(chóng)、多頭絳蟲(chóng)、豬帶絳蟲(chóng)、牛帶絳蟲(chóng)基因組DNA為模板，再取1.8中稀釋的陽(yáng)性質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照，使用上述1.6中的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序進(jìn)行熒光PCR檢測(cè)，驗(yàn)證所建立方法的特異性。

1.10 樣本檢測(cè) 取1.1中樣本提取的DNA作為模板，再取1.8中稀釋的陽(yáng)性質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照，按照1.6中的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序進(jìn)行熒光PCR檢測(cè)，并與中國(guó)疾病預(yù)防控制中心寄生蟲(chóng)病預(yù)防控制所提供的結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，以檢驗(yàn)所建立方法對(duì)樣品的檢測(cè)情況。

2 結(jié) 果

2.1 樣本信息 動(dòng)物病變組織樣本均為天之泰生物技術(shù)研究院(珠海)有限公司解剖并提供發(fā)生明顯病變的樣本，牛肺臟病變組織獲取囊液的過(guò)程見(jiàn)圖2。

圖2 從病變牛肺臟中收集囊液

2.2 方法 結(jié)合引物探針Tm值的大小，在退火階段使用梯度功能分別進(jìn)行53 ℃、55 ℃、57 ℃反應(yīng)，測(cè)試不同退火溫度。確定退火溫度后，對(duì)引物探針?lè)謩e使用3種用量進(jìn)行比對(duì)測(cè)試(引物探針濃度均為10 μmol/L)，根據(jù)擴(kuò)增曲線形狀、Ct值大小和熒光值綜合判定，最終確定在55 ℃退火，上游引物1 μL、下游引物1 μL、探針0.5 μL的條件為最優(yōu)，見(jiàn)圖3、圖4。

圖3 不同退火溫度結(jié)果對(duì)比

1：Forward primer 1 μL，Reverse primer 1 μL，Probe 1 μL；2：Forward primer 1 μL，Reverse primer 1 μL，Probe 0.5 μL；3：Forward primer 0.5 μL，Reverse primer 0.5 μL，Probe 0.25 μL

2.3 靈敏度試驗(yàn) 取1.1中的重組質(zhì)粒作為模板，以10倍梯度稀釋作為陽(yáng)性樣品，取107～100共8個(gè)梯度的陽(yáng)性質(zhì)粒，共出現(xiàn)8個(gè)擴(kuò)增曲線，檢出的最低濃度梯度是101copies/μL。曲線從左到右依次為107～100，見(jiàn)圖5。

圖5 靈敏度試驗(yàn)結(jié)果

2.4 特異性試驗(yàn) 本研究所建立的方法對(duì)犬弓首蛔蟲(chóng)、多頭絳蟲(chóng)、豬帶絳蟲(chóng)、牛帶絳蟲(chóng)的檢測(cè)均未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，特異性效果良好，見(jiàn)圖6。

N：Negative control; P:positive control

2.5 樣本檢測(cè) 根據(jù)所建立的檢測(cè)方法對(duì)上述84份犬糞樣本和18份病變組織樣本及其囊液樣本進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，84份犬糞中共有41份樣本為陽(yáng)性，43份樣本為陰性，其中19號(hào)和30號(hào)樣本熒光PCR結(jié)果均為陰性，與中國(guó)疾病預(yù)防控制中心寄生蟲(chóng)病預(yù)防控制所結(jié)果不一致，符合率為97.6%；病變組織樣本18份均為陽(yáng)性，結(jié)果與解剖情況完全一致。以上所有陽(yáng)性結(jié)果均出現(xiàn)顯著的擴(kuò)增曲線，見(jiàn)圖7、圖8。

N：Negative control；P：Positive control

N：Negative control；P：Positive control

3 討 論

我國(guó)棘球蚴病主要流行的地區(qū)基本為牧區(qū)或半牧區(qū)，這些地區(qū)環(huán)境復(fù)雜，常有野生動(dòng)物出沒(méi)，有開(kāi)放的溪水等水源，故傳染源分布廣泛。調(diào)查研究表明，犬是人類和畜牧動(dòng)物感染棘球蚴病的重要傳染源，且犬等終末宿主的糞便會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染，包括土壤和水源等，使人和畜牧動(dòng)物被感染；家庭屠宰、隨意丟棄患病的動(dòng)物內(nèi)臟又易讓犬、野生動(dòng)物等終末宿主進(jìn)食后感染棘球絳蟲(chóng)，進(jìn)而使人和畜牧動(dòng)物增加患病風(fēng)險(xiǎn)。因此，對(duì)糞便、動(dòng)物內(nèi)臟、土壤[4]、水源甚至種植的蔬菜水果[5]等進(jìn)行檢測(cè)意義重大，可以在消滅傳染源、切斷傳播途徑兩個(gè)方面預(yù)防和控制棘球蚴病。

目前棘球蚴病的檢測(cè)手段主要包括影像學(xué)診斷[6]、免疫學(xué)檢測(cè)[7]和核酸檢測(cè)[8-9]。影像學(xué)在人群篩查方面是主要的臨床診斷方法，有著準(zhǔn)確、直觀等優(yōu)勢(shì)，便攜式超聲設(shè)備的成熟也使得影像學(xué)在對(duì)動(dòng)物現(xiàn)場(chǎng)診斷方面實(shí)現(xiàn)了突破。免疫學(xué)以ELISA最為常見(jiàn)，在流行病學(xué)調(diào)查方面，可通過(guò)對(duì)血清抗體和糞樣中的抗原進(jìn)行檢測(cè)，了解流行情況和推測(cè)未來(lái)趨勢(shì)。核酸檢測(cè)技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)不同來(lái)源樣本檢測(cè)的需求，使用合適的DNA提取試劑盒即可進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)，相比其它兩類方法還有著高特異性和高靈敏度的特點(diǎn)，檢測(cè)通量大，在早期診斷中優(yōu)勢(shì)明顯。綜上所述，核酸檢測(cè)方法更適用于棘球絳蟲(chóng)的終末宿主感染檢測(cè)、中間宿主病變組織檢測(cè)和環(huán)境污染監(jiān)測(cè)。核酸檢測(cè)常見(jiàn)有普通PCR、熒光PCR、LAMP和RPA/RAA等方法，其中以熒光PCR在操作性、檢測(cè)時(shí)間、結(jié)果靈敏度、特異性和穩(wěn)定性等方面均有出色的表現(xiàn)，在此次的新冠病例的診斷和篩查中被廣泛應(yīng)用。目前國(guó)內(nèi)熒光PCR的試劑和儀器產(chǎn)業(yè)鏈完善，檢測(cè)成本相比以往大大降低，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于病毒[10]和寄生蟲(chóng)病[11]等領(lǐng)域的檢測(cè)。

本研究成功建立了一種基于實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)棘球絳蟲(chóng)的檢測(cè)方法，理論上適用于任何含有棘球絳蟲(chóng)、蟲(chóng)卵或幼蟲(chóng)的樣本。該方法靈敏度高，可以檢測(cè)到濃度為10 copies/μL，可適用于檢測(cè)犬糞等目的基因含量不高的樣本，在提取時(shí)建議使用專用提取試劑盒，這類試劑盒在提取過(guò)程中可以有效去除糞便中的各種污染物和影響PCR的抑制因子，并高效回收DNA，達(dá)到下游實(shí)驗(yàn)的要求，而一般的提取試劑盒無(wú)法達(dá)到要求，會(huì)影響后續(xù)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。試驗(yàn)中的犬糞樣本為天之泰生物技術(shù)研究院(珠海)有限公司通過(guò)ELISA方法檢測(cè)后的剩余樣本，ELISA方法對(duì)犬糞樣本進(jìn)行前處理時(shí)，通過(guò)在糞樣中加樣品稀釋液后震蕩混懸，最后離心取上清的方式進(jìn)行試驗(yàn)，針對(duì)部分離心后不能吸取上清的糞樣，則重復(fù)以上步驟直至獲取上清。本研究方法檢測(cè)樣本時(shí)，部分樣本出現(xiàn)了Ct值偏高，其中19號(hào)和30號(hào)樣本出現(xiàn)了未檢出的情況，可能與ELISA試驗(yàn)中，部分樣本因復(fù)檢而重復(fù)前處理步驟，導(dǎo)致剩余樣本中蟲(chóng)卵含量過(guò)少，影響目的基因提取有關(guān)。本研究作為通用型的棘球絳蟲(chóng)檢測(cè)方法，無(wú)法鑒別蟲(chóng)種，在今后的研究可繼續(xù)完善，例如可通過(guò)多重?zé)晒釶CR或普通PCR測(cè)序?qū)崿F(xiàn)。

利益沖突：無(wú)

引用本文格式：趙福振，都勇，蔣曉霞，等.實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)棘球絳蟲(chóng)方法的建立及應(yīng)用[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2022，38(1)：29-34.DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2021.00.179