高效液相色譜-一測多評法同時測定金佛止痛丸中8 種成分含量*

李俊霞，劉松，游秋霞

（遂成藥業(yè)股份有限公司，河南 鄭州 451100）

金佛止痛丸由醋延胡索、白芍、郁金、姜黃、三七、佛手、甘草7 味中藥材加工而成，主要用于治療氣血瘀滯所致胃脘疼痛和痛經(jīng)，以及消化性潰瘍、慢性胃炎引起的疼痛［1］。中藥制劑通常由多味中藥材按中醫(yī)理論君、臣、佐、使配伍而成，所含成分復(fù)雜，同時生產(chǎn)制劑所用中藥材因產(chǎn)地、采收季節(jié)等的不同而導(dǎo)致質(zhì)量差異較大，其現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)［1］和文獻(xiàn)［2 -5］僅對其所含芍藥苷、延胡索乙素等成分進(jìn)行了定量研究，難以全面反映金佛止痛丸的整體質(zhì)量，多指標(biāo)成分質(zhì)量控制模式已廣泛應(yīng)用于中藥及中藥制劑，尤其是中成藥復(fù)方制劑。一測多評（QAMS）法［6-7］實(shí)現(xiàn)了對多個成分的同時測定，解決了個別對照品分離難度大、單體不穩(wěn)定、難以供應(yīng)或價格昂貴等弊端，得到了廣泛認(rèn)可。本研究中采用高效液相色譜-一測多評（HPLC -QAMS）法，以去甲氧基姜黃素為內(nèi)參物，對金佛止痛丸君藥醋延胡索主要藥效成分延胡索乙素、去氫紫堇堿和紫堇堿，臣藥白芍代表性成分氧化芍藥苷和芍藥苷，以及佐藥郁金、姜黃共有活性成分雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素和姜黃素的含量進(jìn)行同時測定，為全面評價金佛止痛丸的整體質(zhì)量提供參考?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

UltiMate 3000 型高效液相色譜儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；Agilent 1260 型高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；色譜柱為Ultimate AQ-C18柱（月旭科技上海股份有限公司）；Kromasil C18柱（瑞典Kromasil公司）；Symmetry C18柱（美國Waters公司）；BP211D型電子天平（德國Sartorius 公司，精密為0.01 mg）。

1.2 試藥

芍藥苷對照品（批號110736 -201943，CAS 號23180 -57 -6，含量95.1%），雙去甲氧基姜黃素對照品（批號112004 -201501，CAS 號33171 -05 -0，含量95.0%），去甲氧基姜黃素對照品（批號112003 -201501，CAS 號22608-11-3，含量98.5%），姜黃素對照品（批號110823 -201706，CAS 號458 -37 -7，含量98.7%），延胡索乙素對照品（批號110726 -201819，CAS 號2934-97-6，含量99.8%），均購于中國食品藥品檢定研究院；氧化芍藥苷對照品（批號18031641，CAS號39011 -91 -1，含量98.8%），紫堇堿對照品（批號17110821，CAS 號518-69-4，含量99.6%），均購于上海同田生物技術(shù)有限公司；去氫紫堇堿對照品（成都普瑞法科技開發(fā)有限公司，批號PRF8062141，CAS 號30045-16-0，含量97.8%）；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純；金佛止痛丸（廣州白云山中一藥業(yè)有限公司，批號分別為R01008，R01006，R01005，規(guī)格為每袋5 g）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Ultimate AQ -C18柱（250 mm × 4.6 mm，5μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗 脫（0～12.0 min 時16.0%A，12.0～23.0 min 時16.0%A →38.0%A，23.0～41.0 min 時38.0%A →55.0%A，41.0～60.0 min 時55.0%A → 78.0%A，60.0～70.0min時78.0%A→16.0%A）；流速：1.0mL/min；檢測波長：230 nm（0～23.0 min時檢測氧化芍藥苷和芍藥苷）［8-10］，420 nm（23.0～41.0 min 時檢測雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素和姜黃素）［11-15］，280 nm（41.0～70.0 min 時檢測延胡索乙素、去氫紫堇堿和紫堇堿）［16-18］；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10μL。

混合對照品溶液、供試品溶液、陰性對照品溶液在此色譜條件下的色譜圖見圖1。可見，金佛止痛丸中待測8 種成分色譜峰均可達(dá)到有效分離，分離度均大于1.5，理論板數(shù)均大于4 500，且陰性對照品溶液對金佛止痛丸中8種化學(xué)成分的同時測定無干擾。

2.2 溶液制備

混合對照品貯備液：分別取8 種對照品各適量，精密稱定，用稀乙醇制成質(zhì)量濃度分別為0.526，5.172，0.398，0.316，1.132，0.274，0.192，0.118 mg/mL 的混合對照品貯備液。

混合對照品溶液：精密量取混合對照品貯備液2.5 mL，用稀乙醇制成含氧化芍藥苷26.3 μg/ mL、芍藥苷258.6 μg/ mL、雙去甲氧基姜黃素19.9 μg/ mL、去甲氧基姜黃素15.8μg/mL、姜黃素56.6μg/mL、延胡索乙素13.7 μg/ mL、去氫紫堇堿9.6 μg/ mL、紫堇堿5.9μg/mL的混合對照品溶液。

供試品溶液：取金佛止痛丸樣品，研細(xì)，取1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇25 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流提取45 min，放冷，用稀乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，即得供試品溶液。

陰性對照品溶液：按2020 年版《中國藥典（一部）》中金佛止痛丸的工藝處方分別制備不含醋延胡索、不含白芍、不含郁金和姜黃的3 種陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：分別精密量取2.2項(xiàng)下混合對照品貯備液0.1，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mL，各置20 mL容量瓶中，用稀乙醇定容，搖勻，制成標(biāo)記為Ⅰ～Ⅵ的系列混合對照品溶液，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，以8 種待測成分的質(zhì)量濃度（X，μg/ mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果見表1。

精密度試驗(yàn)：取2.2 項(xiàng)下供試品溶液，重復(fù)進(jìn)樣測定6次，記錄色譜圖，并計算峰面積。結(jié)果見表1，表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批（批號為R01008）樣品6份，按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依法進(jìn)樣測定，記錄色譜圖及峰面積，按外標(biāo)法計算含量及RSD值。結(jié)果見表1，表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一批（批號為R01008）樣品，按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于0，3，6，12，18，24 h時進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，并計算峰面積的RSD值。結(jié)果見表1，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

加樣回收試驗(yàn)：取已知8種化學(xué)成分含量的樣品9份，每份0.5 g，精密稱定，分別精密加入混合對照品溶液（分別含氧化芍藥苷0.372 mg/mL、芍藥苷3.796 mg/mL、雙去甲氧基姜黃素0.308 mg/ mL、去甲氧基姜黃素0.226 mg/ mL、姜黃素0.674 mg/ mL、延胡索乙素0.188 mg/ mL、去氫紫堇堿0.152 mg/ mL、紫堇堿0.094 mg/mL）0.5，1.0，1.5 mL，各3份，按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，并計算加樣回收率。結(jié)果見表1。

表1 金佛止痛丸中8種成分含量測定方法學(xué)考察結(jié)果Tab.1 Results of content determination methodology of eight components in Jinfo Zhitong Pills

2.4 相對校正因子（RCF）測定

取線性關(guān)系考察項(xiàng)下系列混合對照品溶液Ⅰ～Ⅵ進(jìn)樣測定，記錄色譜圖及峰面積，以去甲氧基姜黃素為內(nèi)參物，按如下公式計算RCF。

式1）中，Ak為內(nèi)參物峰面積，Ws為其他成分質(zhì)量濃度，As為其他成分峰面積，Wk為內(nèi)參物質(zhì)量濃度。計算得其他7種成分的RCF，結(jié)果見表2。

表2 以去甲氧基姜黃素為內(nèi)參物的7種成分的相對校正因子Tab.2 RCFs of seven components with demethoxycurcumin as the reference substance

2.5 RCF 耐用性考察

色譜儀和色譜柱：精密吸取2.2項(xiàng)下混合對照品溶液適量，依法進(jìn)樣測定，記錄8 種成分的峰面積，考察UltiMate 3000 型、Agilent 1260 型高效液相色譜儀和Ultimate AQ -C18柱、Kromasil C18柱、Waters Symmetry C18柱對RCF的影響。結(jié)果在此色譜儀和色譜柱條件下，氧化芍藥苷、芍藥苷、雙去甲氧基姜黃素、姜黃素、延胡索乙素、去氫紫堇堿、紫堇堿的平均RCF分別為0.853 3，1.185 7，0.761 7，0.622 9，1.172 8，1.093 3，1.811 7，RSD分別為1.12%，1.21%，0.81%，1.44%，1.71%，1.32%，1.46%（n=6）。

柱溫：精密吸取2.2 項(xiàng)下混合對照品溶液適量，依法進(jìn)樣測定，記錄8 種成分的峰面積，考察不同柱溫（25，28，30，32，35 ℃）對RCF 的影響。結(jié)果在此柱溫條件下，氧化芍藥苷、芍藥苷、雙去甲氧基姜黃素、姜黃素、延胡索乙素、去氫紫堇堿、紫堇堿的平均RCF 分別為0.852 7，1.183 8，0.760 3，0.616 2，1.169 0，1.095 8，1.808 7，RSD分別為1.46%，1.19%，0.99%，1.20%，1.81%，1.37%，1.89%（n=5）。

流速：精密吸取2.2 項(xiàng)下混合對照品溶液適量，依法進(jìn)樣測定，記錄8 種成分的峰面積，考察不同流速（0.8，0.9，1.0，1.1，1.2 mL/ min）對RCF 的影響。結(jié)果在此流速下，氧化芍藥苷、芍藥苷、雙去甲氧基姜黃素、姜黃素、延胡索乙素、去氫紫堇堿、紫堇堿的平均RCF分 別0.852 3，1.184 7，0.758 4，0.617 2，1.175 1，1.094 2，1.805 3，RSD分別為1.20%，0.93%，1.23%，1.55%，1.64%，1.19%，1.34%（n=5）。

2.6 待測組分色譜峰的定位

以內(nèi)參物去甲氧基姜黃素色譜峰為基準(zhǔn)峰，考察在UltiMate 3000 型、Agilent 1260 型高效液相色譜儀和Ultimate AQ -C18柱、Kromasil C18柱、Waters Symmetry C18柱條件下，氧化芍藥苷、芍藥苷、雙去甲氧基姜黃素、姜黃素、延胡索乙素、去氫紫堇堿、紫堇堿色譜峰與去甲氧基姜黃素色譜峰的相對保留時間，并采用相對保留時間值法對色譜峰進(jìn)行定位。結(jié)果見表3。

表3 不同色譜儀和不同色譜柱對相對保留時間的影響Tab.3 Effects of different chromatographs and chromatographic columns on the relative retention time

2.7 QAMS 法與外標(biāo)（ESM）法測定結(jié)果比較

取3 批（批號分別為R01008，R01006，R01005）樣品，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依法進(jìn)樣測定，記錄氧化芍藥苷、芍藥苷、雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素、姜黃素、延胡索乙素、去氫紫堇堿、紫堇堿的峰面積，分別以ESM 法和QAMS 法計算各成分含量，采用SPSS 26.0 統(tǒng)計學(xué)軟件對2 種方法所得結(jié)果進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。結(jié)果見表4。

表4 金佛止痛丸中8種成分一測多評法和外標(biāo)法含量測定結(jié)果比較（n=3）Tab.4 Comparison of the content determination of eight compo?nents in Jinfo Zhitong Pills by the QAMS and the ESM（n=3）

3 討論

3.1 定量測定化學(xué)成分及內(nèi)參物的選擇

金佛止痛丸由醋延胡索、白芍、郁金、姜黃、三七、佛手、甘草7 味中藥材制成。方中，醋延胡索行氣止痛，為君藥；白芍柔肝和胃、養(yǎng)血調(diào)經(jīng)，三七祛瘀生新，共為臣藥；佛手疏肝理氣、和胃止痛，郁金行氣解郁、活血止痛，姜黃破血行氣、通經(jīng)止痛，共為佐藥；甘草補(bǔ)脾益氣、緩急止痛、調(diào)和諸藥，為使藥。諸藥合用，共奏行氣止痛、舒肝和胃、祛瘀生新之功效。中藥制劑在中醫(yī)理論指導(dǎo)下遵循以君藥所含成分為主，兼顧臣藥、佐藥、使藥所含成分［19-20］。本研究中選取方中君藥醋延胡索所含主要藥效成分延胡索乙素、去氫紫堇堿和紫堇堿，臣藥白芍所含代表性成分氧化芍藥苷和芍藥苷，以及佐藥郁金、姜黃共有活性成分雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素和姜黃素為定量研究指標(biāo)成分，同時選取性質(zhì)穩(wěn)定、對照品易得、檢測中出峰時間居中、含量較高的去甲氧基姜黃素為內(nèi)參物，以全面評價金佛止痛丸的整體質(zhì)量。

3.2 色譜條件選擇

試驗(yàn)中以水為流動相水相，以金佛止痛丸中定量測定成分氧化芍藥苷、芍藥苷、雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素、姜黃素、延胡索乙素、去氫紫堇堿和紫堇堿的分離效果為主要指標(biāo)，對有機(jī)相（甲醇、乙腈）進(jìn)行考察，結(jié)果乙腈優(yōu)于甲醇。遂以乙腈為有機(jī)相，對水相（0.1%冰醋酸溶液［11-12，16，18］、0.1%磷酸溶液［8-10，13，15，17］、0.1%甲酸溶液）進(jìn)行考察，結(jié)果乙腈-0.1%磷酸水溶液流動相體系對金佛止痛丸中8 種成分的分離效果最佳，色譜圖基線較平穩(wěn)。最終確定按2.1項(xiàng)下的流動相程序?qū)鸱鹬雇赐柚?種成分的含量進(jìn)行同時測定。

3.3 供試品溶液制備方法選擇

試驗(yàn)中以金佛止痛丸中8 種成分的綜合提取率為考察指標(biāo)，分別對提取溶劑（甲醇［11-12］、95%乙醇［15］、75%乙醇［13，16］、稀乙醇［8-10］）和提取方法（加熱回流［8，11，13，17］、超聲［9-10，15-16］）進(jìn)行考察，結(jié)果以稀乙醇為提取溶劑，加熱回流提取45 min時，8 種目標(biāo)成分的綜合提取率最佳。故選擇稀乙醇加熱回流提取45 min作為供試品處理方法。

3.4 方法評價

本研究中采用HPLC-QAMS法同時測定金佛止痛丸中8種成分的含量，建立了金佛止痛丸的多指標(biāo)質(zhì)量分析方法，有效地降低了檢驗(yàn)成本，且操作便捷、結(jié)果準(zhǔn)確，可用于金佛止痛丸的多指標(biāo)質(zhì)量控制。