干旱脅迫下外源褪黑素對小麥生長和光系統(tǒng)活性的影響

李春雨，陳春宇，毛浩田，張懷渝，陳洋爾

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,四川雅安 625014)

水資源短缺是制約農(nóng)業(yè)發(fā)展的全球性問題，世界范圍內(nèi)由干旱造成的小麥減產(chǎn)超過其他因素所導(dǎo)致的產(chǎn)量損失總和[1]，嚴(yán)重威脅著人類的糧食安全[2]。水是保證小麥正常生長發(fā)育的重要因素。我國也是全球最大的小麥生產(chǎn)國和消費(fèi)國，每年總產(chǎn)量約為1.3億t[3]。我國小麥的主產(chǎn)區(qū)秦嶺-淮河以北一帶存在不同程度的水資源短缺問題，給小麥生產(chǎn)造成了嚴(yán)重影響[4-5]。因此，探究如何提高小麥的抗旱性，充分發(fā)掘小麥的生產(chǎn)潛力，是植物抗逆研究的重要課題，對解決我國水資源短缺、保障我國的糧食安全及社會穩(wěn)定發(fā)展具有重大意義[6-7]。

多種植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)如甜菜堿[8-9]、水楊酸[10]及一氧化氮[11]能增強(qiáng)植物對干旱的耐受力，外施植物生長調(diào)節(jié)劑已成為增強(qiáng)作物抗旱性的重要手段之一[11]。褪黑素(melatonin)在植物抵御非生物脅迫中發(fā)揮著重要保護(hù)作用[12]，為一種天然的吲哚胺類激素，最早發(fā)現(xiàn)于牛的松果體[13]，隨后被證實(shí)廣泛存在于植物體中[14-15]。研究表明，褪黑素不僅可促進(jìn)植物及其根系的生長[16-17]，也可提高植物光合效率[18]。外源褪黑素可提高干旱脅迫下植物種子的萌發(fā)率，促進(jìn)根系生長，調(diào)節(jié)植物生長及光合能力[19-21]。褪黑素處理能減緩干旱脅迫對植株造成的氧化損傷，降低植物體內(nèi)的活性氧(ROS)，從而增強(qiáng)植物抵抗環(huán)境脅迫的能力[22-23]。褪黑素還可以通過調(diào)節(jié)植物激素水平減輕干旱對植物帶來的不利影響[24-26]。植物對于干旱適應(yīng)機(jī)制包括感知和信號分子傳遞組成的復(fù)雜調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)[27]，而褪黑素作為一種多功能信號分子，參與干旱脅迫下植物體內(nèi)的信號傳導(dǎo)，進(jìn)而對增強(qiáng)植物抗旱性起到積極作用[28]。

值得注意的是，干旱脅迫下，植物光系統(tǒng)Ⅱ(PS Ⅱ)容易受損，外源褪黑素可以通過多種方式對植物PS Ⅱ進(jìn)行保護(hù)[29-32]。研究發(fā)現(xiàn)，外源褪黑素可以在鹽脅迫下維持植物D1蛋白的活性[33]；在干旱脅迫下，外源褪黑素有助于清除ROS，防止PS Ⅱ蛋白受損[28]。而相較于PS Ⅱ，光系統(tǒng)I(PSⅠ)在環(huán)境脅迫下通常相對穩(wěn)定，但由于PSⅠ缺乏高效的修復(fù)機(jī)制，一旦受損對于植物的影響更加嚴(yán)重[34]。研究表明，干旱脅迫會導(dǎo)致植物PSⅠ受體側(cè)抑制，進(jìn)而使植物的光合效率大為降低[28]。龍舌蘭幼苗在受到干旱脅迫時，光合作用的調(diào)節(jié)主要依賴于PSⅠ的熱耗散和電子傳遞的增強(qiáng)[34]。干旱脅迫下，對于植物PSⅠ的保護(hù)至關(guān)重要，而目前關(guān)于外源褪黑素能否有效保護(hù)PSⅠ卻鮮有報道。因此，本研究以小麥為材料，利用聚乙二醇(PEG-6000)模擬干旱條件，通過測定與分析小麥生長過程中的生理指標(biāo)和PSⅠ的蛋白含量，以期深入探索褪黑素在干旱脅迫下對小麥生長和光PSⅠ的影響，為提高小麥抗旱能力提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與處理

褪黑素(melatonin)購自Sigma試劑公司。精選顆粒飽滿的小麥CN19種子，用1%的次氯酸鈉(NaClO)溶液消毒10 min后用蒸餾水洗凈，20 ℃黑暗條件下蒸餾水浸種24 h，發(fā)芽盒內(nèi) 20 ℃暗發(fā)芽48 h。挑選芽長約1 cm幼芽移植于石英砂盆栽中，每盆5株，置于人工氣候室中(光照250 μmol photons·m-2·s-1，光暗周期為 16 h/8 h，溫度為22 ± 1 ℃，相對濕度70%)。用1/2 Hoagland培養(yǎng)液和相應(yīng)濃度的褪黑素將材料預(yù)處理3 d后培養(yǎng)至三葉期，選取長勢一致、健康的植株進(jìn)行干旱脅迫處理，具體設(shè)置如表1，每處理設(shè)置3個重復(fù)，干旱脅迫48 h后取植株第二葉測定其光合等生理指標(biāo)。

表1 小麥褪黑素及干旱脅迫處理方式

1.2 測定指標(biāo)與方法

1.2.1 葉片相對含水量和植株地上部生物量測定

采用Tambussi等[35]的方法測定小麥葉片相對含水量(RWC)和植株地上部生物量。每重復(fù)隨機(jī)挑選6株小麥幼苗，沿根軸處剪開根及莖葉，取莖葉稱量鮮重作為植株地上部生物量。以下指標(biāo)測定取樣均為三葉期小麥幼苗的第二葉。稱取葉片鮮重(FW)后，將葉片置于蒸餾水2 h后稱量葉片飽和重(TW)，再將葉片烘干至恒重稱量葉片干重(DW)。RWC =(FW - DW)/(TW - DW)× 100%。

1.2.2 葉綠素含量、葉綠素a/b、類胡蘿卜素和花青素含量測定

按照舒 展等[36]的方法，用打孔器取1 cm2葉片，80%丙酮浸提，用分光光度計(Hitachi-U2000，Tokyo，Japan)測定A645及A663值，按Arnon等[37]方法計算提取液的葉綠素濃度。參照Dashek[38]的方法測定類胡蘿卜素含量?；ㄇ嗨睾康臏y定參考Pietrini等[39]的方法。

1.2.3 氣體交換參數(shù)測定

采用GFS-3000便攜式光合儀測定葉片的凈光合速率(Pn)、氣孔導(dǎo)度(Gs)、蒸騰速率(Tr)和胞間CO2濃度(Ci)。測定光照強(qiáng)度為700 μmol·m-2·s-1，CO2濃度為400 μmol·mol-1，溫度為25 ℃，每組處理重復(fù)5～10次[39]。

1.2.4 葉綠素?zé)晒鈪?shù)和P700參數(shù)測定

采用Ohad等[40]的方法測定葉綠素?zé)晒鈪?shù)，參照Klughamer和Schreiber[41]的方法測定P700參數(shù)。小麥植株暗適應(yīng)30 min，測定暗適應(yīng)初始熒光Fo、最大熒光Fm、遠(yuǎn)紅光適應(yīng)下的最大P700改變量Pm、光化光下的最大P700改變量Pm'和光化光下的還原態(tài)P700總量P700 red。按公式計算:PS Ⅱ最大光化學(xué)效率Fv/Fm=(Fm-Fo)/Fm，PSⅠ由供體側(cè)限制引起的非光化學(xué)能量耗散的量子產(chǎn)量ΦND= 1 - P700 red，PSⅠ由受體側(cè)限制引起的非光化學(xué)能量耗散的量子產(chǎn)量ΦNA=(Pm-Pm')/Pm，PSⅠ的實(shí)際光能轉(zhuǎn)換效率ΦPSI=1-ΦND-ΦNA。各參數(shù)均重復(fù)測定3次，取平均值。

1.2.5 蛋白免疫印跡分析

根據(jù)Chen等[42]的方法，于暗光中提取小麥葉片的類囊體膜蛋白，采用15%的十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離類囊體蛋白，將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上，將轉(zhuǎn)移后的PVDF膜進(jìn)行封閉、一抗(PsaD、Lhca1、Lhca2、Lhca3、Lhca4)孵育、二抗(辣根過氧化酶標(biāo)記)孵育，孵育結(jié)束后采用熒光檢測系統(tǒng)測定免疫印跡信號。使用Quantity One軟件定量分析類囊體蛋白含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2010軟件處理數(shù)據(jù)，并用SPSS 20.0軟件統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 褪黑素對干旱脅迫下小麥葉片相對含水量和植株地上部生物量的影響

干旱脅迫下，小麥葉片嚴(yán)重失水萎蔫且生長受到嚴(yán)重抑制(圖1)。干旱脅迫導(dǎo)致了小麥葉片相對含水量下降(圖2)。干旱脅迫下，5、25及100 μmol·L-1褪黑素預(yù)處理后小麥葉片相對含水量較D處理分別增加17.52%、24.62%和 15.62%，變化均顯著，表明三種濃度的褪黑素預(yù)處理均可明顯減緩干旱脅迫下小麥葉片相對含水量的下降，其中以25 μmol·L-1褪黑素預(yù)處理的緩解效果最明顯。

圖1 褪黑素對干旱脅迫下小麥表型的影響

圖柱上不同小寫字母表示處理間在0.05水平有顯著性差異。下同。

與CK相比，干旱脅迫導(dǎo)致小麥地上部生物量顯著下降。干旱脅迫下，5、25及100 μmol·L-1褪黑素預(yù)處理的地上部生物量較D處理分別增加20.47%、58.27%和48.82%。以上結(jié)果說明褪黑素預(yù)處理能夠提高干旱脅迫下小麥抗失水能力，有效緩解干旱脅迫對小麥生長的抑制作用，促進(jìn)小麥生長，其中以25 μmol·L-1褪黑素預(yù)處理效果最佳。

2.2 褪黑素對干旱脅迫下小麥葉片三種色素含量的影響

干旱脅迫使小麥葉片葉綠素含量顯著低于CK(圖3A)。干旱脅迫下，5 、25及100 μmol·L-1褪黑素預(yù)處理的小麥葉片葉綠素含量較D處理均顯著提高，增幅分別為8.11%、 22.63%和20.14%，但褪黑素預(yù)處理對葉綠素a/b值無顯著影響(圖3B)；5、25及100 μmol·L-1褪黑素預(yù)處理也顯著提高了小麥葉片類胡蘿卜素和花青素的含量，其中類胡蘿卜素含量較D處理分別增加11.00%、16.17%和26.25% (圖3C)，花青素含量分別相應(yīng)增加26.86%、52.30%和37.10%(圖3D)。這說明褪黑素能夠使干旱脅迫下小麥葉片光合色素含量保持較高的水平，有利于葉片光合作用，其中25 μmol·L-1褪黑素預(yù)處理效果最佳。

圖3 褪黑素對干旱脅迫下小麥葉綠素、葉綠素a/b、類胡蘿卜素和花青素的影響

2.3 褪黑素對干旱脅迫下小麥葉片氣體交換參數(shù)的影響

在正常條件下，不同濃度的褪黑素處理對小麥葉片凈光合速率(Pn)、蒸騰速率(Tr)、氣孔導(dǎo)度(Gs)、胞間CO2濃度(Ci)均無明顯影響(圖4)。干旱脅迫導(dǎo)致Pn、Tr、Gs、Ci均呈下降趨勢(圖4A、B、C、D)。干旱脅迫下，5 、25及100 μmol·L-1褪黑素預(yù)處理的小麥葉片Pn較D處理分別增加了44.13%、122.46%和54.94%，Gs分別增加16.21%、157.19%和33.58%，Ci分別增加了5.37%、30.18%和17.01%(圖4B)，而Tr無明顯改變(圖4C)。由此可見，褪黑素預(yù)處理能顯著提高干旱脅迫下小麥葉片的光合能力，其中25 μmol·L-1褪黑素預(yù)處理效果最明顯。

圖4 褪黑素對干旱脅迫下小麥葉片氣體交換參數(shù)的影響

2.4 褪黑素對干旱脅迫下小麥葉片PS Ⅱ活性的影響

正常條件下，褪黑素預(yù)處理后小麥葉片的最大熒光(Fm)和PS Ⅱ最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)沒有顯著變化(圖5)。而干旱脅迫下，褪黑素預(yù)處理可緩解干旱脅迫導(dǎo)致的Fm和Fv/Fm下降，5、25及100 μmol·L-1褪黑素預(yù)處理的Fm較D處理分別增加了16.42%、44.03%和38.81%，F(xiàn)v/Fm分別增加了4.92%、16.39%和11.48%，表明褪黑素預(yù)處理能減輕干旱脅迫對小麥PS Ⅱ的損傷。

圖5 褪黑素對干旱脅迫下小麥葉片F(xiàn)m和Fv/Fm影響

2.5 褪黑素對干旱脅迫下小麥葉片P700參數(shù)的影響

正常條件下，褪黑素預(yù)處理對小麥葉片的最大P700信號(Pm)及PSⅠ有效量子產(chǎn)量(ΦPSI)、供體側(cè)的氧化態(tài)(ΦND)和受體側(cè)的還原態(tài)(ΦNA)均無顯著影響(圖6)。干旱脅迫下，褪黑素預(yù)處理能夠顯著減緩干旱脅迫導(dǎo)致的Pm和ΦPSI下降，5、25及100 μmol·L-1褪黑素預(yù)處理的Pm分別較D處理分別增加了15.56%、73.33%和 44.44%(圖6A)，ΦPSI分別增加了21.74%、 30.43%和26.09%(圖6B)；而干旱脅迫下，25 和100 μmol·L-1褪黑素預(yù)處理的小麥葉片ΦND顯著增加；D處理的ΦNA較CK顯著上升，增幅為400.00%(圖6C)，而干旱脅迫下5 、25及100 μmol·L-1褪黑素預(yù)處理較D處理顯著降低了小麥葉片ΦNA，降幅分別為22.86%、65.71%和45.71%(圖6D)，但三者的ΦNA水平仍高于CK，說明干旱脅迫下褪黑素預(yù)處理可有效減輕干旱脅迫造成的PSⅠ損傷，增加其活性。

圖6 褪黑素對干旱脅迫下小麥葉片P700參數(shù)的影響

2.6 褪黑素對干旱下小麥PSⅠ蛋白含量的影響

從蛋白免疫印跡結(jié)果(圖7A和B)看，干旱脅迫顯著降低了小麥葉片PSⅠ的Lhca2蛋白含量，干旱脅迫下褪黑素預(yù)處理可顯著緩解Lhca2蛋白含量的降低，而對PsaD、Lhca1、Lhca3和Lhca4蛋白的含量無明顯影響。定量分析結(jié)果表明，褪黑素預(yù)處理可顯著緩解干旱脅迫下Lhca2蛋白的減少，其中以100 μmol·L-1褪黑素處理的小麥葉片Lhca2蛋白相對含量下降最少(圖7A和 E)。而正常及干旱脅迫下的小麥葉片PsaD、Lhca1、Lhca3和Lhca4蛋白的相對含量均無明顯變化(圖7C、D、F和H)。

A:光系統(tǒng)I蛋白免疫印記; B:類囊體膜蛋白考馬斯亮藍(lán)染色。

3 討 論

作物對干旱脅迫的響應(yīng)是一個十分復(fù)雜的過程，干旱脅迫影響植物的萌發(fā)和正常生長，不同作物品種對于干旱脅迫的響應(yīng)存在著顯著差異。植株的生物量和含水量是評價作物抗旱性的重要指標(biāo)[43-44]。植物的地上部生物量也可一定程度上反映植株的生長狀況，而植物組織的相對含水量可以反映植物體內(nèi)水分虧缺程度，體現(xiàn)植物的抗旱性[45-46]。外源褪黑素的施用可提高植物的抗逆能力，增強(qiáng)植物對干旱脅迫的耐受性[21,30-32]。本研究與前人的研究結(jié)果均顯示，干旱脅迫顯著抑制小麥在萌發(fā)期的生長，在苗期則會使小麥葉片的相對含水量和地上部生物量均呈現(xiàn)降低趨勢，而褪黑素的處理在一定程度上均促進(jìn)小麥的萌發(fā)及幼苗的生長，顯著減小了小麥的葉片相對含水量及地上部生物量下降幅度，明顯改善植株體內(nèi)的水分狀況，說明褪黑素預(yù)處理能有效增加小麥的抗旱性。

光合色素尤其是葉綠素在光合作用中對光能的吸收、傳遞及光化學(xué)反應(yīng)起著重要的作用，而類胡蘿卜素具有提高光合效率、抑制和清除自由基的作用。光合色素的含量通常直接影響著光合作用和光合產(chǎn)物的形成，最終影響作物的產(chǎn)量和品質(zhì)[47]。研究顯示，植物干旱缺水會增加葉綠體內(nèi)氧自由基含量的積累，大量的活性氧會引發(fā)葉綠素的破壞，使得葉綠素含量降低[48]，因此干旱脅迫會造成光合能力下降[49]。同時，光合速率的分析通常采用葉肉細(xì)胞間CO2濃度(Ci)作為指標(biāo)[50]，干旱脅迫會導(dǎo)致葉片氣孔收縮，進(jìn)而導(dǎo)致光合速率下降[51]。本研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素處理對正常條件下小麥葉片的葉綠素、類胡蘿卜素含量及氣孔活動基本無影響。而干旱脅迫下外源褪黑素處理則增加了小麥葉片的光合色素含量，并有效緩解了Pn、Gs的下降，且不同濃度褪黑素的促進(jìn)效果存在一定差異，其中以25 μmol·L-1褪黑素處理效果最佳，而褪黑素處理對Tr基本無影響。這說明褪黑素處理能夠提高干旱脅迫下植物光合色素含量，增加氣孔導(dǎo)度，這與褪黑素能夠增強(qiáng)植物逆境下的光合作用是一致的[21,30-31]。此外，本研究中干旱脅迫下經(jīng)褪黑素處理過的小麥葉片花青素含量顯著增加，而花青素具有清除活性氧的作用[52]，說明褪黑素能誘導(dǎo)干旱脅迫下花青素的快速積累，從而清除由干旱脅迫引起的活性氧積累，增強(qiáng)小麥的抗旱能力[53]。

植物葉綠素?zé)晒鈪?shù)是靈敏、無機(jī)械損傷研究和評價逆境下植物光合作用的重要參考指標(biāo)，可以直接反映植物的生長、病害及受脅迫情況[54-55]。本研究中，干旱脅迫下小麥的Fm和Fv/Fm值均降低，表明干旱脅迫降低了PS Ⅱ的原初光能轉(zhuǎn)化效率及潛在活性，進(jìn)而使PS Ⅱ的光化學(xué)活性受到抑制。褪黑素處理可有效緩解干旱脅迫下小麥Fm和Fv/Fm的下降，表明褪黑素能改善干旱脅迫下小麥葉片PS Ⅱ的能量轉(zhuǎn)化，減輕干旱脅迫對小麥PS Ⅱ的損傷，增強(qiáng)干旱脅迫下PS Ⅱ的光化學(xué)活性。根據(jù)前人研究，環(huán)境脅迫下，PS Ⅱ能夠進(jìn)行快速修復(fù)，而PSⅠ無修復(fù)機(jī)制，因此一旦PSⅠ發(fā)生損傷，植物的光合效率會明顯下降[56]。Pm是遠(yuǎn)紅光適應(yīng)后打開飽和脈沖測量的最大P700信號，類似于熒光測量中的Fm。本研究中，Pm與Fm的變化趨勢相似，說明無論是PSⅠ還是PS Ⅱ，在干旱脅迫下都明顯會受到破壞，而褪黑素處理能減輕植物光系統(tǒng)受損程度。

本研究通過測量小麥葉片ΦPSI、ΦND、ΦNA以及PSⅠ蛋白含量，以進(jìn)一步探討PSⅠ的光化學(xué)活性。結(jié)果顯示，褪黑素對正常環(huán)境條件下小麥的ΦPSI、ΦND、ΦNA基本無影響。干旱脅迫下，小麥ΦPSI水平的降低及ΦNA水平的上升說明干旱脅迫使小麥PSⅠ的受體側(cè)受到抑制，而PSⅠ受體側(cè)限制引起的非光化學(xué)能量耗散增加，這可能是因?yàn)楦珊得{迫抑制光合速率，從而導(dǎo)致PSⅠ受體側(cè)電子累積產(chǎn)生活性氧，造成PSⅠ損傷。而褪黑素可通過清除活性氧，降低ΦNA的水平，從而保護(hù)PSⅠ以提高干旱脅迫下小麥PSⅠ的實(shí)際光合效率，這與前人關(guān)于褪黑素的抗氧化研究結(jié)果是一致的[21]，但不同濃度的褪黑素的作用效果存在著較大差異。同時，褪黑素處理可提高干旱脅迫下ΦND的水平，表明干旱脅迫下褪黑素不僅能增強(qiáng)PS Ⅱ光化學(xué)活性，也可降低PSⅠ供體側(cè)限制引起的非光化學(xué)能量耗散。此外，干旱脅迫下PSⅠ的Lhca2蛋白含量明顯降低，而褪黑素處理可緩解Lhca2蛋白的下降，表明褪黑素對干旱脅迫下小麥PSⅠ的影響可能主要通過調(diào)節(jié)Lhca2蛋白的含量來發(fā)揮作用。

到目前為止，尚不清楚褪黑素是如何保護(hù)干旱脅迫下小麥PSⅠ。研究表明，褪黑素可以提高干旱脅迫下小麥PS Ⅱ的活性，但是逆境條件下PS Ⅱ的穩(wěn)定可能會導(dǎo)致PSⅠ過度激發(fā)，使PSⅠ受到氧化損傷[57]。褪黑素如何同時保護(hù)兩個光系統(tǒng)需要深入討論。對于PSⅠ的保護(hù)需要分析光系統(tǒng)之間吸收能量的分配，植物通過狀態(tài)轉(zhuǎn)換來實(shí)現(xiàn)光系統(tǒng)之間激發(fā)平衡[58-60]。狀態(tài)轉(zhuǎn)換主要取決于LHCⅡ蛋白的磷酸化以及其與結(jié)合的PSI-H蛋白[61-62]，褪黑素已被報道能夠影響多個蛋白激酶[21]，褪黑素和使LHCⅡ蛋白磷酸化的STN7蛋白激酶之間是否存在關(guān)系還需進(jìn)一步探究。PSⅠ受體側(cè)調(diào)節(jié)和供體側(cè)調(diào)節(jié)與環(huán)式電子傳遞密切相關(guān)[63]。Shi等[64]通過轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)推測褪黑素能夠提高植物PGR5蛋白含量，PGR5蛋白是環(huán)式電子傳遞過程中的關(guān)鍵蛋白，褪黑素對于干旱脅迫下小麥環(huán)式電子傳遞和PGR5蛋白表達(dá)水平的影響需要進(jìn)一步研究。綜上所述，褪黑素對小麥干旱脅迫下的生理機(jī)能及光合效能均有一定的促進(jìn)作用，具體機(jī)制需要進(jìn)一步深入 研究。