GPX4水平與急性冠狀動(dòng)脈綜合征病人臨床特征、危險(xiǎn)分層及其預(yù)后相關(guān)性研究

包炳蔚，丁絲雨，季春斐，姚卓亞，錢少環(huán)，路 橋，李 正，高大勝，史曉俊，王洪巨，李妙男

急性冠狀動(dòng)脈綜合征(ACS)是一組嚴(yán)重的心臟急性缺血綜合征[1-2]，其病情變化迅速，且對(duì)心肌產(chǎn)生不可逆轉(zhuǎn)的缺血損傷。雖然隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)水平的進(jìn)步，ACS的發(fā)病機(jī)制已逐漸明確[3-4]，治療方案也日趨完善，但仍有部分病人在接受了系統(tǒng)的藥物及介入治療后會(huì)出現(xiàn)不良心血管事件[1-2,5-6]。因此，積極探索心肌細(xì)胞死亡調(diào)控通路，保護(hù)心臟免受缺血相關(guān)損傷，將對(duì)臨床靶向防治ACS并改善其遠(yuǎn)期預(yù)后有重要的指導(dǎo)價(jià)值。

有研究[7]表明，抑制谷胱甘肽過氧化物酶4(GPX4)的功能將導(dǎo)致細(xì)胞膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化，并可誘導(dǎo)鐵死亡。FENG等[8]研究發(fā)現(xiàn)，鐵死亡抑制劑利普羅斯他汀-1通過增加GPX4活性，減少線粒體脂質(zhì)活性氧的生成，保護(hù)小鼠心肌細(xì)胞免受缺血再灌注損傷。我們推測(cè)ACS病人可能會(huì)因?yàn)楦咚降腉PX4抑制心肌細(xì)胞鐵死亡而獲益。但目前GPX4與ACS之間的相關(guān)性仍不明確，血漿GPX4水平與心肌缺血損傷之間的研究大多處于基礎(chǔ)研究階段。本研究采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)對(duì)404例病人的血漿GPX4水平進(jìn)行檢測(cè)，觀測(cè)血漿GPX4水平變化與ACS病人臨床特征、危險(xiǎn)分層及其預(yù)后之間的相關(guān)性，從而為更精確有效地防治ACS并改善其預(yù)后提供新的治療思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料 納入2018年11月至2019年6月因胸痛于我科住院治療并擬行冠狀動(dòng)脈造影檢查的病人404例。ACS組納入標(biāo)準(zhǔn)：依據(jù)中華醫(yī)學(xué)會(huì)相關(guān)指南[9-12]，根據(jù)病史、生化指標(biāo)、影像學(xué)檢查及冠脈造影結(jié)果分為不穩(wěn)定型心絞痛組(UAP組)261例和急性心肌梗死組(AMI組)55例。同時(shí)選取同期行冠狀動(dòng)脈造影并排除冠心病診斷的病人為對(duì)照組。排除標(biāo)準(zhǔn)：肝腎功能不全，急性腦血管疾病，感染性疾病，腫瘤等消耗性疾病，血液系統(tǒng)疾病，碘及造影劑過敏和病史資料收集不全的病人。

1.2 樣品收集 所有病人均于入院后次日清晨在空腹?fàn)顟B(tài)下接受肘靜脈血的采集，分別抽取5 mL置于肝素鈉抗凝試管中，送往我院檢驗(yàn)科進(jìn)行各項(xiàng)常規(guī)生化指標(biāo)檢測(cè)；5 mL置于EDTA抗凝試管中，送往我院心肺實(shí)驗(yàn)室，經(jīng)過離心留存血清，置于-80 ℃環(huán)境下保存，待樣本集齊后，采用ELASA檢測(cè)每個(gè)樣本中血漿GPX4的水平[13]。

1.3 冠狀動(dòng)脈造影 采用Judkins[14-15]法行冠狀動(dòng)脈造影，判斷造影結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)為美國(guó)ACC/AHA心血管疾病診治報(bào)告[16]，由經(jīng)驗(yàn)豐富的專業(yè)心內(nèi)科醫(yī)師操作完成。應(yīng)用Gensini評(píng)分[17]評(píng)估病人冠狀動(dòng)脈病變嚴(yán)重程度。

1.4 TIMIT危險(xiǎn)分層 采用心肌梗死溶栓治療臨床試驗(yàn)危險(xiǎn)評(píng)分(TIMI危險(xiǎn)評(píng)分)[18-19]對(duì)ACS組病人進(jìn)行危險(xiǎn)分層，UAP/NSTEMI和STEMI病人按不同評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算。

1.5 隨訪 采用門診及電話隨訪等形式，追蹤隨訪ACS組病人院外主要心血管不良事件(MACEs)[20]的發(fā)生情況，平均為期21個(gè)月。本研究包含的MACEs為：再發(fā)胸痛、心力衰竭、腦卒中、再發(fā)心梗、出血、再次血運(yùn)重建、支架內(nèi)血栓、支架內(nèi)再狹窄、死亡。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)、非參數(shù)秩和檢驗(yàn)、Kaplan-Meier法、ROC分析和Cox風(fēng)險(xiǎn)比例回歸分析。

2 結(jié)果

2.1 ACS組與對(duì)照組基線資料比較 ACS組在年齡、男性病人比例、合并高血壓、合并糖尿病、血肌酐、TG、低密度脂蛋白水平上高于對(duì)照組，而高密度脂蛋白水平低于對(duì)照組(P<0.05～P<0.01)(見表1)。

表1 AC組與對(duì)照組病人基線資料比較[M(P25,P75)]

分組n總膽固醇/(mmol/L)三酰甘油/(mmol/L)低密度脂蛋白膽固醇/(mmol/L)高密度脂蛋白膽固醇/(mmol/L)C反應(yīng)蛋白/(mg/L)D-二聚體/(mg/L)脂蛋白a/(mg/L)ACS組3164.02(3.86,4.17)1.74(1.60,1.88)2.26(2.16,2.35)0.96(0.92,1.00)5.46(3.55,7.37)0.57(0.39,0.74)363.68(327.29,400.08)對(duì)照組883.96(3.73,4.18)1.47(1.25,1.69)2.04(2.01,2.16)1.01(0.94,1.07)4.54(1.92,7.16)0.76(0.12,1.41)287.57(237.61,337.53)Zc—1.982.313.051.881.600.370.37P—>0.05<0.05<0.05<0.05>0.05>0.05>0.05

2.2 研究對(duì)象血漿GPX4水平比較 ACS組血漿GPX4水平低于對(duì)照組(P<0.05)。UAP組與AMI組血漿GPX4水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見表2)。

表2 不同病人血漿GPX4水平比較

2.3 血漿GPX4水平對(duì)ACS的診斷價(jià)值 ROC曲線顯示血漿CTPX4水平可以輔助ACS的診斷。ROC曲線下面積(AUC)為0.828(0.778～0.878)，其最佳截?cái)帱c(diǎn)為128.78 ng/mL，特異性為64.8%，敏感性為90.0%(P<0.05)(見圖1)。

2.4 不同TIMI危險(xiǎn)分級(jí)ACS病人基線資料的比較 根據(jù)病人TIMI危險(xiǎn)評(píng)分將ACS組病人分為低危組、中危組和高危組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低危組在年齡、合并高血壓、C反應(yīng)蛋白、D-二聚體水平均低于中危組及高危組，在合并糖尿病、Gensini評(píng)分水平低于高危組，在男性病人占比上高于高危組(P<0.05～P<0.01)。低危組血漿GPX4水平高于中危組和高危組(P<0.05)，高危組病人血漿GPX4水平與中危組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見表3)。

表3 TIMI危險(xiǎn)分層低危組、中危組和高危組病人基線資料比較[M(P25,P75)]

分組n低密度脂蛋白膽固醇/(mmol/L)高密度脂蛋白膽固醇/(mmol/L)C反應(yīng)蛋白/(mg/L)D-二聚體/(mg/L)脂蛋白a/(mg/L)Gensini評(píng)分GPX4/(ng/mL)低危組532.30(2.03,2.57)0.96(0.90,1.03)1.59(1.01,2.18) 0.26(0.16,0.37)363.68(327.29,400.08)23.75(16.70,30.80) 114.63(107.46,121.79) 中危組2272.14(2.02,2.27)0.95(0.92,0.98)5.91(3.42,8.41)? 0.57(0.34,0.79)?332.72(291.79,373.65)33.18(28.54,37.81) 101.61(99.01,104.20)?高危組362.41(2.07,2.74)1.06(0.69,1.43)8.38(1.23,15.54)?0.79(0.35,1.24)?378.36(248.47,508.25)52.44(37.23,67.65)?102.75(96.85,108.66)?Zc—3.683.539.9916.493.6713.7814.50P—>0.05>0.05<0.01<0.01>0.05<0.01<0.05

2.5 血漿GPX4水平對(duì)TIMI危險(xiǎn)分層中低危病人的診斷價(jià)值 ROC曲線顯示血漿GPX4水平可以輔助TIMI危險(xiǎn)分層中低危病人的診斷。AUC為0.665(0.577～0.754)，敏感度為37.7%，特異性為95.0%，最佳截?cái)嘀禐?27.06 ng/mL(P<0.05)(見圖2)。

2.6 MACEs組與非MACEs組血漿GPX4水平比較 本研究對(duì)ACS組病人進(jìn)行了平均21個(gè)月的門診或電話隨訪，其中4例(1.3%)失訪，共30例(9.5%)發(fā)生MACEs事件。根據(jù)隨訪結(jié)果中病人是否發(fā)生MACEs事件，將ACS組病人分為MACEs組30例和非MACEs組282例，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MACEs組病人GPX4水平為95.16(90.05，100.26)ng/mL,低于非MACEs組104.53(102.01，107.06)ng/mL(Zc=2.86,P<0.05)。

2.7 Kaplan-Meier生存分析 依據(jù)所有ACS病人測(cè)得GPX4數(shù)值的中位數(shù)將研究對(duì)象分為GPX4≥101.90 ng/mL組和GPX4<101.90 ng/mL組，繪制Kaplan-Meier曲線。在所有ACS病人中，4例失訪。GPX4≥101.90 ng/mL 158例，失訪2例，共10例發(fā)生MACEs事件，平均生存時(shí)間為620.06 d；GPX4<101.90 ng/mL的病人人數(shù)為158例，失訪2例，共20例發(fā)生MACEs事件，平均生存時(shí)間為607.23 d。K-M曲線顯示，血漿GPX4<101.90 ng/mL的ACS病人預(yù)期生存時(shí)間與GPX4≥101.90 ng/mL組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.70，P>0.05)(見圖3)。

2.8 Cox風(fēng)險(xiǎn)比例回歸分析 將血漿GPX4水平納入Cox風(fēng)險(xiǎn)比例回歸分析，結(jié)果顯示，B′為-0.03，SE為0.01，Waldχ2為6.99，OR(95%CI)為0.97(0.95～0.99)。隨著ACS病人血漿GPX4水平的升高，ACS病人發(fā)生MACEs事件的風(fēng)險(xiǎn)降低，表明血漿GPX4水平升高是MACEs事件發(fā)生的保護(hù)因素(P<0.05)。

3 討論

ACS在我國(guó)發(fā)病率持續(xù)升高，給社會(huì)帶來嚴(yán)重的醫(yī)療負(fù)擔(dān)[21]。并且由于心肌細(xì)胞是終末分化細(xì)胞，當(dāng)心臟受到缺血損傷時(shí)，心肌細(xì)胞受到的打擊將不可逆轉(zhuǎn)，導(dǎo)致心肌細(xì)胞數(shù)量上永久減少，從而引起ACS嚴(yán)重的臨床癥狀及不良的預(yù)后。因此，探索心肌細(xì)胞死亡的調(diào)控通路，抑制心肌細(xì)胞死亡，保護(hù)心臟免受缺血相關(guān)損傷，將對(duì)臨床靶向防治ACS并改善其遠(yuǎn)期預(yù)后起到重要的指導(dǎo)價(jià)值。

鐵死亡是來自哥倫比亞大學(xué)的研究人員DIXON等[22]于2012年正式提出的一種由小分子Erastin誘導(dǎo)的鐵依賴性的新型細(xì)胞死亡形式。這一過程的特點(diǎn)是大量的、依賴于鐵元素的脂質(zhì)活性氧(ROS)的積累[23-24]。形態(tài)學(xué)上，鐵死亡的主要變化在于線粒體的損傷，表現(xiàn)為線粒體外膜的破裂、線粒體膜的固縮以及線粒體嵴的減少或消失[25]。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)鐵代謝的穩(wěn)定被打破時(shí)，細(xì)胞產(chǎn)生過量的鐵離子(Fe2+)，F(xiàn)e2+在微酸環(huán)境下發(fā)生芬頓反應(yīng)(Fenton)生成大量ROS，隨著ROS在細(xì)胞內(nèi)的不斷堆積，逐步誘發(fā)細(xì)胞的鐵死亡[26-27]，這是目前已知的鐵死亡基礎(chǔ)啟動(dòng)機(jī)制。

GPX4是一種特殊的硒蛋白[28]，它可以將脂質(zhì)ROS還原為無毒的脂質(zhì)醇，限制了脂質(zhì)過氧化物在膜質(zhì)中的傳播，有效預(yù)防了細(xì)胞的氧化應(yīng)激，從而抑制細(xì)胞的鐵死亡進(jìn)程[29]。因?yàn)槠湓阼F死亡發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵作用機(jī)制，GPX4這一鐵死亡調(diào)控因子已成為研究熱門。來自武漢大學(xué)的李文遠(yuǎn)等[30]的研究證明，靶向抑制鐵死亡在保護(hù)心肌細(xì)胞對(duì)抗過量鐵及缺血再灌注損傷時(shí)發(fā)揮了重要的作用。因此，鐵死亡中的關(guān)鍵因子GPX4可能與心肌缺血性疾病ACS之間具有相關(guān)性。本研究發(fā)現(xiàn)，ACS病人的血漿GPX4水平比正常對(duì)照組病人明顯降低(P<0.05)，并且GPX4的ROC AUC為0.83(0.78～0.88)，其最佳截?cái)帱c(diǎn)為128.78 ng/mL，特異性為64.8%，敏感性為90.0%，提示GPX4對(duì)于ACS的診斷具有一定的參考價(jià)值。但在比較UAP組與AMI組病人血漿GPX4水平時(shí)，兩者的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能說明GPX4對(duì)反映ACS的診斷比較敏感，但對(duì)ACS中各種亞型的鑒別價(jià)值不大。TIMI危險(xiǎn)評(píng)分是臨床上針對(duì)于ACS病人預(yù)后的危險(xiǎn)評(píng)分[31]，用于ACS病人的危險(xiǎn)分層與預(yù)后預(yù)測(cè)時(shí)，操作方便，實(shí)用，有效。本研究發(fā)現(xiàn)，TIMI危險(xiǎn)分層低危組病人的血漿GPX4水平高于中危組和高危組(P<0.05)，并且ROC曲線顯示，血漿GPX4對(duì)TIMI危險(xiǎn)分層中病人是否處于低危狀態(tài)具有判別價(jià)值，其中AUC為0.665(0.578，0.754)，敏感度為37.7%，特異性為95.0%，最佳截?cái)嘀禐?27.06 ng/mL(P<0.05)，這表明GPX4對(duì)于臨床對(duì)ACS病人進(jìn)行TIMIT危險(xiǎn)分層具有輔助參考價(jià)值。然而，高危組和中危組病人血漿GPX4水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與本研究納入高危組病人數(shù)量較少有關(guān)，有待進(jìn)一步研究探討與完善。

本研究對(duì)總計(jì)316例ACS病人進(jìn)行了平均21個(gè)月的電話或門診隨訪，其中4例(1.3%)失訪，30例(9.6%)發(fā)生MACEs事件。我們發(fā)現(xiàn)MACEs組病人的血漿GPX4水平低于非MACEs組病人(P<0.05)；Cox回歸分析顯示，GPX4是避免ACS病人發(fā)生MACEs事件的保護(hù)因素，提示高水平的血漿GPX4水平降低了ACS病人發(fā)生MACEs事件的風(fēng)險(xiǎn)。通過檢測(cè)ACS病人的GPX4水平，可以有效地幫助臨床醫(yī)生判斷病人的遠(yuǎn)期預(yù)后，對(duì)改善病人院外生存率可能起到積極作用[32]。Kaplan-Meier曲線分析顯示血漿GPX4<101.90 ng/mL的病人發(fā)生MACEs事件的平均時(shí)間有比GPX4≥101.90 ng/mL的病人更早的趨勢(shì)，但Logrank檢驗(yàn)P>0.05，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與本研究納入病人人數(shù)較少、隨訪時(shí)間較短導(dǎo)致發(fā)生終點(diǎn)事件的人數(shù)過少有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，血漿GPX4水平對(duì)于ACS的診斷、TIMI危險(xiǎn)分層、遠(yuǎn)期預(yù)后的判斷均有參考價(jià)值。為在闡明GPX4在冠心病中的作用機(jī)制，并通過靶向干預(yù)鐵死亡在臨床上進(jìn)行ACS的防治，提供新的思路與參考依據(jù)。本研究為單中心回顧性研究，納入的樣本量較少，排除了嚴(yán)重的肝腎功能及心肺功能不全的病人，且隨訪時(shí)間較短，MACEs的發(fā)生率偏低，只是初步的經(jīng)驗(yàn)總結(jié)，有待后續(xù)研究深入探討。