外源水楊酸對高溫脅迫下小麥籽粒灌漿特性的影響

樊永惠，葛 婷，楊 詠，李宇星，武倩倩，秦博雅，楊文俊，黃正來

(1.安徽農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院/農(nóng)業(yè)部黃淮南部小麥生物學與遺傳育種重點實驗室，安徽合肥 230036；2.太湖縣江塘鄉(xiāng)農(nóng)業(yè)綜合服務中心，安徽太湖 246400)

小麥作為世界三大作物之一，在全球栽培總面積最大，分布范圍最廣，總產(chǎn)量最高，對保障糧食安全起到重要作用。全球氣候變暖使得小麥頻繁遭受高溫損害，特別是灌漿期高溫脅迫嚴重影響到小麥產(chǎn)量和品質(zhì)。研究表明，相較籽粒灌漿的適宜溫度(即18.0～22.0 ℃)每升高1 ℃，小麥減產(chǎn)5%～10%，當小麥生育后期最高溫度超過30 ℃，損失更大甚至絕收。

水楊酸(SA)是一種普遍存在于高等植物細胞內(nèi)的小分子酚類物質(zhì)，其在諸多植物內(nèi)發(fā)揮提升生物及非生物脅迫耐受性能的作用。前人研究大多集中在SA在抗寒、抗鹽堿以及抗病等方面的作用機理，對于SA抗熱的研究較少。粒重是決定小麥產(chǎn)量的重要因素之一。周秋峰等研究發(fā)現(xiàn)，高溫脅迫造成小麥的過氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)活性降低，小麥光合能力降低、植株衰老加速，供給籽粒合成的光合產(chǎn)物降低，導致小麥粒重和粒數(shù)減少，產(chǎn)量降低。而向妙蓮等研究發(fā)現(xiàn)，外源水楊酸可提高小麥超氧化物歧化酶(SOD)活性，減緩葉片脂質(zhì)過氧化作用，延緩葉片衰老，利于灌槳速率和粒重的提高。高溫脅迫下，外施SA可以提高小麥植株的耐熱性，并顯著影響植株內(nèi)源激素的變化。內(nèi)源激素是植物體內(nèi)產(chǎn)生的一類在低濃度即可對植物生長發(fā)育及環(huán)境應答等過程產(chǎn)生重要調(diào)控作用的代謝產(chǎn)物。薛建平等研究發(fā)現(xiàn)，在高溫脅迫下，內(nèi)源激素ABA、IAA和GA3對半夏倒苗起著重要的調(diào)控作用，外源噴施SA可延緩高溫脅迫下半夏的倒苗，提高產(chǎn)量。但外源SA對高溫脅迫下小麥內(nèi)源激素的影響迄今未見報道，且有關(guān)SA緩解小麥高溫脅迫的生理機制以及SA對灌漿期高溫脅迫下小麥籽粒灌漿特性的影響尚未完全明確。本研究選擇在抽穗期、開花期、花后5 d、花后10 d四個不同時期噴施SA(每個時期連續(xù)噴施4 d)，在花后15-19 d通過被動式增溫棚模擬高溫環(huán)境，分析不同處理對產(chǎn)量、籽粒灌漿特性的效應，以期為小麥耐高溫機理和抗高溫栽培技術(shù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

本試驗于2018-2020年在安徽農(nóng)業(yè)大學校內(nèi)試驗基地農(nóng)萃園(31.83°N、117.24°E)進行。土壤類型為黃棕壤土，2018-2019年度小麥播種前0～20 cm土層土壤pH=6.5，土壤有機質(zhì) 13.9 g·kg、速效氮86.2 mg·kg、速效磷13.4 mg·kg、速效鉀71.5 mg·kg。 2019-2020年度小麥播種前0～20 cm土層有機質(zhì)15.2 g·kg、速效氮90.6 mg·kg、速效磷16.5 mg·kg、速效鉀79.6 mg·kg。供試小麥品種為揚麥18(本地區(qū)大面積推廣品種)。采取大田盆栽方式，盆內(nèi)直徑25 cm，深度為30 cm，每盆裝7.5 kg篩土。種植時每盆施用復合肥6 g，復合肥中各養(yǎng)分的比例為N∶P∶K= 17∶17∶17。其中，氮肥分兩次施入，基追比為 5∶5，追肥于拔節(jié)期施入。播種日期為2018年11月7日和2019年11月4日。土壤經(jīng)水沉實后播種，每盆播種20粒，在三葉一心時，間苗至每盆8株。每個處理21盆，每個處理均設置三個重復。試驗盆周圍大田種植相同品種小麥，按照高產(chǎn)田塊要求進行田間管理。

水楊酸處理濃度為2016-2017年度預試驗中篩選出的噴施濃度0.1 mmol·L，在抽穗期(SAHG)、開花期(SAAG)、花后5 d(SA5G)、花后10 d(SA10G)分別對小麥進行葉面噴霧，每個時期連續(xù)噴施4 d，每天1次，每次噴施1 L·m。噴施至葉片正反兩面均濕潤為止(有一層小水珠欲落)。對照組(NN)噴施等量的蒸餾水。采用隨機區(qū)組試驗設計，所有噴施溶液均用1 mmol·LKOH調(diào)整pH值為6.0 ± 0.1，每100 mL溶液含有0.02 mL Tween-20。

于花后15 d通過被動式增溫棚進行高溫處理，連續(xù)處理5 d。為防止棚內(nèi)增溫幅度過高，每天正午將塑料薄膜上卷30 cm便于棚內(nèi)通風。用Elitech(RC-4)智能溫濕度記錄儀每10 min測1次，連續(xù)記錄小麥冠層空氣溫、濕度。處理結(jié)束后將盆移至自然環(huán)境下。2019年、2020年灌漿期高溫脅迫分別平均增溫5.7 ℃、6.0 ℃(圖1)。

圖1 試驗地冠層溫濕度變化(2018-2020年)

1.2 測定項目與方法

1.2.1 產(chǎn)量測定

成熟期每小區(qū)收獲6盆，自然風干(小麥籽粒含水率達到13%左右)后測籽粒產(chǎn)量，記錄每盆穗數(shù)、穗粒數(shù)。各處理全部收獲、風干后(含水率約13%)測千粒重，三次重復。

1.2.2 強、弱勢粒粒重測定

成熟期每處理取10穗?yún)⒖冀?東等方法將麥穗平均分為三部分，即上、中和下部小穗，每部分小穗基部第1、第2位籽粒計為強勢粒，第 3～5位籽粒計為弱勢粒。三次重復。

1.2.3 籽粒蔗糖、可溶性糖含量測定

取不同處理花后10、15、20、25、30、35 d籽粒，蔗糖含量采用間苯二酚法測定；可溶性糖含量采用蒽酮比色法測定。

1.2.4 籽粒蔗糖合成酶(SS)活性測定

取花后5、10、15、25 d籽粒，SS活性測定參考Rufty等的方法并略加改進。200 μL SS提取液中加 50 μL pH 7.5的 HEPES-NaOH 緩沖液、50 μL 10 mmol·LMgCl、100 μL 50 mmol·LUDPG、100 μL 50 mmol·L6-磷酸果糖，30 ℃反應30 min；加 200 μL 40% NaOH 溶液混勻，100 ℃保溫 10 min；加 2.0 mL30%鹽酸混勻，80 ℃保溫10 min；加1 mL 1%間苯二酚，混勻后80 ℃保溫10 min；冷卻后于480 nm下比色測生成磷酸蔗糖含量。用蔗糖生成量表示酶活性。

1.2.5 籽粒內(nèi)源激素含量測定

采用酶聯(lián)免疫法(ELISA)略作修改測定籽粒中吲哚乙酸(IAA)、脫落酸(ABA)和細胞分裂素(CTK)含量，具體步驟如下：

(1)樣品中激素的提?。喝?.5 g花后5、10、15、25 d籽粒，加2 mL提取液[80%(v/v)甲醇，內(nèi)含1 mmol·L二叔丁基對甲苯酚(BHT)]，在冰浴下研磨成勻漿，轉(zhuǎn)入10 mL離心管，再用3 mL提取液分次將研缽沖洗干凈，一并轉(zhuǎn)入試管中，搖勻。4℃下過夜提取，之后3 500 r·min離心8 min，取上清液，殘渣棄去。

(2)過柱：上清液過C-18固相萃取柱。具體步驟：80%甲醇(1 mL)平衡柱→上樣→收集樣品→移開樣品后用100%甲醇(5 mL)洗柱→100%乙醚(5 mL)洗柱→100%甲醇(5 mL)洗柱→循環(huán)。

(3)干燥：將過柱后的樣品轉(zhuǎn)入25 mL小燒杯中，真空濃縮干燥，除去提取液中的甲醇，用樣品稀釋液(100 mL pH 7.5 磷酸緩沖液中加0.1 mL Tween-20，0.1 g明膠)定容。

(4)測定：采用酶聯(lián)免疫試劑盒進行激素抗體反應，具體步驟參照試劑盒說明書進行，試劑盒購自中國農(nóng)業(yè)大學，激素含量使用xMark微孔板吸光度分光光度計(Bio-Rad,USA)測定。CTK含量為玉米素+玉米素核苷(Z+ZR)含量和異戊烯基腺嘌呤+異戊烯基腺嘌呤核苷(iP+iPR)含量的總和。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010進行數(shù)據(jù)處理并作圖，采用DPS對試驗數(shù)據(jù)進行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源SA對灌漿期高溫脅迫小麥產(chǎn)量和千粒重的影響

由圖2(A和B)可知，與NN相比，灌漿期高溫脅迫(NG)顯著降低了小麥的產(chǎn)量。不同階段噴施SA處理(SAHG、SAAG、SA5G和SA10G)的小麥產(chǎn)量均高于NG，這表明預噴施SA可降低灌漿期高溫脅迫造成的小麥產(chǎn)量損失，緩解效果以SAAG處理最好，其次依次為SA5G、SA10G、SAHG。由圖2(C和D)可知，與NN相比，灌漿期高溫脅迫顯著降低了小麥千粒重；SAHG、SAAG、SA5G和SA10G處理的小麥千粒重均高于NG，這表明灌漿期溫度過高會導致籽粒千粒重下降，預噴施SA可降低高溫脅迫導致的小麥千粒重降低程度。

NN:對照；NG:灌漿期高溫脅迫；SAHG:抽穗期噴施外源SA +灌漿期高溫脅迫；SAAG:開花期噴施外源SA +灌漿期高溫脅迫；SA5G:花后5 d噴施外源SA +灌漿期高溫脅迫；SA10G:花后10 d噴施外源SA +灌漿期高溫脅迫。圖柱上不同字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。

2.2 外源SA對灌漿期高溫脅迫小麥成熟期強弱勢粒粒重的影響

由表1可知，與NN相比，NG顯著降低了不同穗位的粒重，弱勢粒的下降幅度大于強勢粒，不同穗位粒重下降幅度表現(xiàn)為上部小穗>中部小穗>下部小穗。SAHG、SAAG、SA5G和SA10G處理下，小麥不同穗位強、弱勢粒粒重均高于NG，這表明預噴施SA可緩解高溫脅迫下小麥不同穗位強、弱勢粒粒重的損失。緩解效果以SAAG最好，其次依次為SA5G、SA10G、SAHG；在本試驗條件下，外源SA對高溫脅迫導致的上部小穗及弱勢粒粒重的降低緩解效果較好。

表1 不同處理下的小麥成熟期強弱勢粒粒重

2.3 外源SA對灌漿期高溫脅迫下小麥籽粒灌漿特性的影響

2.3.1 對粒重的影響

灌漿期高溫脅迫前，與NN相比，各處理條件下(SAHG、SAAG、和SA5G)的小麥籽粒干物質(zhì)積累量均顯著高于NN。由圖3可知，灌漿期高溫脅迫后，與NN相比，NG顯著降低了粒重，降低幅度在花后28 d時大于花后21 d。預噴施SA處理(SAHG、SAAG、SA5G和SA10G)的小麥粒重均顯著高于NG，這表明預噴施SA緩解了高溫脅迫下小麥粒重的減少，不同時期預噴施SA對灌漿期高溫脅迫小麥粒重的緩解效果表現(xiàn)為SAAG>SA5G>SA10G>SAHG。

相同時間圖柱上不同字母表示處理間在 0.05水平上差異顯著。下同。

2.3.2 對籽粒蔗糖含量和可溶性糖含量的影響

由圖4可知，灌漿期高溫脅迫前，各處理下(SAHG、SAAG、SA5G和SA10G)的小麥籽粒蔗糖含量和可溶性糖含量均高于NN處理。灌漿期高溫脅迫后，NG較NN相比顯著降低了小麥籽粒蔗糖含量和可溶性糖含量，預噴施SA處理(SAHG、SAAG、SA5G和SA10G)的小麥籽粒蔗糖含量和可溶性糖含量均高于NG，這表明預噴施SA對高溫脅迫下小麥籽粒蔗糖含量和可溶性糖含量的降低有所緩解，緩解效果以SAAG最好，其次依次為SA5G、SA10G、SAHG，即開花期預噴施SA對高溫脅迫的緩解效果最佳。

圖4 外源SA對小麥籽粒蔗糖含量和可溶性糖含量的影響

2.3.3 對籽粒蔗糖合成酶(SS)活性的影響

由圖5可知，小麥籽粒SS活性隨著生育進程的推進呈先升后降趨勢。灌漿期高溫脅迫前，與NN相比，SA處理下(SAHG、SAAG、SA5G和SA10G)的小麥籽粒SS活性均高于NN。與NN相比，NG顯著降低了小麥籽粒SS活性；在花后25d(SAAG、SA5G和SA10G)處理的小麥籽粒SS活性均顯著高于NG，SAHG處理與NG差異不顯著，這表明預噴施SA對高溫脅迫導致的小麥籽粒SS活性的降低有所緩解，緩解效果以SAAG效果最好，其次依次為SA5G、SA10G、SAHG，即開花期預噴施SA對高溫脅迫的緩解效果較佳。

圖5 外源SA對小麥籽粒蔗糖合成酶活性的影響

2.3.4 對籽粒吲哚乙酸含量的影響

由圖6可知，灌漿期高溫脅迫前，SAHG、SAAG、SA5G和SA10G處理的小麥籽粒IAA含量均高于NN。與NN相比，NG顯著降低了小麥籽粒IAA含量，SAHG、SAAG、SA5G和SA10G處理的小麥籽粒IAA含量均顯著高于NG，這表明預噴施SA緩解了高溫脅迫導致的小麥籽粒IAA含量的降低，緩解效果以開花期噴施SA效果較佳。說明外源SA可提高籽粒IAA含量，緩解高溫脅迫造成的IAA含量降低。

圖6 外源SA對小麥籽粒吲哚乙酸含量的影響

2.3.5 對籽粒脫落酸(ABA)含量的影響

由圖7可知，小麥籽粒ABA含量隨著生育進程的推進呈先升后降的趨勢。灌漿期高溫脅迫前，與NN相比，SA處理下(SAHG、SAAG、SA5G和SA10G)的小麥籽粒ABA含量均高于NN。與NN相比，NG顯著降低了小麥籽粒ABA含量；SA處理下(SAHG、SAAG、SA5G和SA10G)的ABA含量均顯著高于NG，這表明預噴施SA對高溫脅迫導致的小麥籽粒ABA含量的降低有所緩解，緩解效果以開花期預噴施較佳。

圖7 外源SA小麥籽粒脫落酸含量的影響

2.3.6 對籽粒細胞分裂素(CTK)含量的影響

由圖8可知，從花后5 d至花后25 d，小麥籽粒CTK含量呈先下降后上升趨勢，在花后15 d時CTK含量最大。灌漿期高溫脅迫前，SA處理下(SAHG、SAAG、SA5G和SA10G)的小麥籽粒CTK含量均高于NN。與NN相比，NG顯著降低了小麥籽粒CTK含量；不同SA處理下(SAAG、SA5G和SA10G)的小麥籽粒CTK含量均顯著高于NG，SAHG與NG間差異不顯著，這表明預噴施SA緩解了高溫脅迫下小麥籽粒CTK含量的降低， 緩解效果以開花期噴施SA效果較佳。

圖8 外源SA對小麥籽粒細胞分裂素含量的影響

3 討論與結(jié)論

3.1 外源SA對小麥產(chǎn)量的影響

隨著全球范圍內(nèi)氣候變暖，高溫逆境頻繁出現(xiàn)，對我國小麥產(chǎn)量造成嚴重威脅。灌漿期對小麥產(chǎn)量的形成至關(guān)重要，此時遭受高溫脅迫會使小麥產(chǎn)量減少；千粒重可以作為篩選小麥抗熱性的簡易指標。本試驗結(jié)果表明，灌漿期高溫脅迫顯著降低了小麥的穗粒數(shù)和千粒重，導致產(chǎn)量顯著下降；不同階段預噴施SA緩解了高溫導致的千粒重降低，從而小麥產(chǎn)量的降低也得到了緩解，以開花期噴施SA 效果最佳。

對小麥不同穗位強、弱勢粒粒重進行分析發(fā)現(xiàn)，高溫脅迫下，強勢粒相較于弱勢粒的降低幅度小，上部小穗粒重受高溫脅迫的影響最大。說明灌漿期高溫脅迫主要影響小麥上部小穗和弱勢粒的生長發(fā)育。中部小穗開花以及灌漿時間比下部和上部小穗更早，本試驗是在灌漿中期對小麥進行高溫脅迫，這可能試驗中高溫脅迫對中部小穗生長發(fā)育影響較小的主要原因。這與趙俊曄等強勢粒開花早，灌漿啟動更快，速度更快，弱勢粒與其相反，同時灌漿時間晚于強勢粒的觀點一致。本試驗結(jié)果表明，外源SA可以有效緩解高溫脅迫對小麥弱勢粒和上部小穗的生長發(fā)育負效應，從而緩解小麥產(chǎn)量的降低，開花期預噴施SA緩解效果最好。

3.2 外源SA對小麥籽粒灌漿特性的影響

灌漿特性包括灌漿時間與灌漿速率。李永庚等與Bhullar等認為，灌漿前期高溫脅迫致使穗粒數(shù)顯著減少，灌漿中期與后期高溫脅迫使粒重降低，最終導致減產(chǎn)。Shah等與Plaut等認為，開花后高溫脅迫使葉片光合速率下降，從而致使干物質(zhì)累積速度降低。這與本試驗結(jié)果一致。外源SA緩解了灌漿期高溫脅迫導致的小麥籽粒干物質(zhì)積累量的降低，以開花期噴施SA緩解效果最好。

非結(jié)構(gòu)性碳水化合物(如可溶性糖和淀粉)是植物新陳代謝的重要物質(zhì)，也是光合作用的直接產(chǎn)物，其在植物體內(nèi)的代謝直接影響植物生長和對外界環(huán)境的響應。小麥的光合產(chǎn)物主要以蔗糖的形式向外輸送。有研究表明，高溫脅迫會抑制植物器官內(nèi)光合產(chǎn)物向外輸出，導致籽粒汁液和韌皮部中蔗糖含量下降，致使灌漿強度以及粒重急速降低。本試驗結(jié)果表明，外源SA增加了籽粒中蔗糖和可溶性糖含量。蔗糖是光合產(chǎn)物運輸?shù)阶蚜Ｖ械淖畛跣问剑琒S是小麥籽粒催化淀粉合成反應的第一步關(guān)鍵酶，其活性反映了籽粒降解利用蔗糖的能力，在花后主要調(diào)節(jié)籽粒灌漿和淀粉積累，被認為是谷類作物“庫強”的重要指標之一。籽粒蔗糖含量與旗葉蔗糖含量極顯著正相關(guān)，說明旗葉光合產(chǎn)物(蔗糖)的供應對籽粒的蔗糖含量有顯著影響。本試驗結(jié)果顯示，外源SA提高了籽粒SS活性，說明在SA預處理下籽粒降解蔗糖的能力增強，防止蔗糖在籽粒中過多積累，從而保證庫中糖代謝的進行。緩解效果為開花期預噴施SA最好。

3.3 外源SA對小麥籽粒內(nèi)源激素含量的影響

內(nèi)源激素含量及其平衡是調(diào)控植物生長發(fā)育的重要因素。有研究認為，植物激素對小麥產(chǎn)量構(gòu)成因素的形成有調(diào)節(jié)作用。不同類型小麥品種籽粒發(fā)育過程中內(nèi)源激素含量及其比例變化存在差異。一般認為，內(nèi)源激素的含量與胚乳細胞的分裂和物質(zhì)的運輸有密切關(guān)系。研究表明，SA影響植物生長、誘導形態(tài)發(fā)生與其影響激素代謝之間有一定關(guān)系,可能是通過干擾一種或兩種主要激素如生長素實現(xiàn)的。劉 新等研究表明，水楊酸可以提高蠶豆幼苗中內(nèi)源細胞分裂素和生長素的含量。本研究結(jié)果顯示，正常生長條件下,小麥籽粒維持較高生理活性的時間比高溫脅迫條件下長，而外源SA提高了小麥籽粒ABA含量。唐 瑭等的研究指出，ABA對SS活性有重要的調(diào)節(jié)作用，籽粒灌漿進程中內(nèi)源激素通過調(diào)節(jié)SS活性變化來影響庫器官中蔗糖的代謝，從而調(diào)節(jié)水稻的灌漿充實。因此，經(jīng)過SA預處理的小麥可能是通過ABA調(diào)節(jié)籽粒中蔗糖淀粉代謝的關(guān)鍵酶(SS)活性，增大庫強，從而促進籽粒的灌漿。Berleth等的研究指出，IAA在一定濃度范圍內(nèi)能有效調(diào)節(jié)籽粒中H-ATP酶的活性，表明IAA調(diào)控著源器官中蔗糖向庫器官(籽粒胚乳細胞)的輸送。Yang等的研究指出，淀粉分支酶和異淀粉酶的活性受CTK調(diào)節(jié)，CTK、IAA可通過調(diào)節(jié)細胞發(fā)育相關(guān)酶的活性來調(diào)控籽粒胚乳細胞數(shù)目、體積及內(nèi)容充實物。在本研究中，外源SA提高了小麥籽粒IAA含量和CTK含量，這表明外源SA預處理有利于提高IAA和CTK對源庫間糖代謝平衡的調(diào)控能力，增強籽粒蔗糖的卸載和轉(zhuǎn)化能力及淀粉的合成，從而影響產(chǎn)量的形成。一般認為， 植物開花至成熟期間，CTK和脫落酸ABA對營養(yǎng)器官的衰老及其細胞內(nèi)含物的轉(zhuǎn)移、同化物的運輸分配、籽粒貯存性碳水化合物和蛋白質(zhì)的形成和積累均具有重要的調(diào)控作用。不同時期預噴施SA提高了小麥IAA、CTK和ABA的含量，其對源庫間糖代謝平衡的調(diào)控能力有所增強，從而提高了籽粒的灌漿充實度。