江西省山藥病原線蟲種類鑒定及地理分布

吳彩云, 范琳娟, 徐雪亮, 劉子榮, 喻吉生, 康宏波,胡平華, 涂年生, 彭德良, 姚英娟*

(1. 江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)應(yīng)用微生物研究所, 南昌 330200; 2. 江西省吉安市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所, 吉安 343119; 3. 江西省吉安市泰和縣塘洲鎮(zhèn)綜合執(zhí)法隊(duì), 吉安 343715; 4. 江西省吉安市永豐縣蔬菜產(chǎn)業(yè)發(fā)展中心, 吉安 331500; 5. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所, 北京 100193)

山藥為薯蕷科Dioscoreaceae薯蕷屬Dioscorea多年生草質(zhì)藤本作物,是江西省重要的蔬菜作物,綜合種植效益遠(yuǎn)高于其他經(jīng)濟(jì)作物,常年種植面積約1.3萬 hm2。江西省山藥品質(zhì)優(yōu)異,在國內(nèi)外享有盛譽(yù)[1-2]。然而,長期以來由于受到土地資源和種植習(xí)慣等因素的影響,大多數(shù)山藥田常年連作栽培,土壤環(huán)境逐漸惡化,山藥線蟲病發(fā)生日益加重,山藥的產(chǎn)量和品質(zhì)受到了極大影響,嚴(yán)重阻礙了江西省山藥的可持續(xù)發(fā)展[3-4]。姚英娟等[5]報(bào)道了江西省山藥線蟲病的田間發(fā)病率一般為30%～80%,嚴(yán)重的甚至達(dá)到100%,減產(chǎn)20%～50%,已成為制約江西省山藥產(chǎn)業(yè)的一大難題。目前,我國山藥的病原線蟲主要涉及2個屬6個種,分別是根結(jié)線蟲屬M(fèi)eloidogyne的爪哇根結(jié)線蟲M.javanica[6]、南方根結(jié)線蟲M.incognita和花生根結(jié)線蟲M.arenaria[7],以及短體線蟲屬Pratylenchus的穿刺短體線蟲P.penetrans[8]、薯蕷短體線蟲P.dioscoreae[9]和咖啡短體線蟲P.coffeae[10-11]。南方根結(jié)線蟲和爪哇根結(jié)線蟲主要分布在河南、山東等山藥產(chǎn)地;穿刺短體線蟲主要分布在山東省;咖啡短體線蟲主要分布在江蘇、山東、安徽、河南等山藥產(chǎn)地[10]。然而,關(guān)于江西省山藥病原線蟲卻鮮有報(bào)道,僅有賀哲等[12]報(bào)道了瑞昌山藥短體線蟲病的病原為咖啡短體線蟲,江西省其他地區(qū)山藥線蟲病的病原種類和發(fā)生情況等均未見報(bào)道。

本研究于2019年-2020年對江西省山藥主要種植區(qū)的線蟲病進(jìn)行采樣調(diào)查并對病原進(jìn)行形態(tài)和分子鑒定,明確江西省山藥線蟲病主要病原線蟲種類及地理分布,為進(jìn)一步研究山藥線蟲病的發(fā)生規(guī)律及科學(xué)防治奠定理論基礎(chǔ),為江西省山藥產(chǎn)業(yè)線蟲病綜合防控和可持續(xù)發(fā)展提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試樣品:2019年1月至2020年12月,在各山藥種植地采用五點(diǎn)取樣法隨機(jī)采集江西省7市27縣(市)的共計(jì)157份山藥塊莖樣品,標(biāo)記后帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行線蟲分離。

主要試劑及儀器:10×PCR Buffer(Mg2+free)、蛋白酶K、PremixTaqTM、DNA凝膠回收試劑盒,日本TaKaRa公司;pEASY-T1 Cloning Kit,北京全式金公司。Bio-rad T100 PCR擴(kuò)增儀(Bio-rad),SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱(上海博訊);光學(xué)顯微鏡(Nikon);DYCP-31DN電泳儀(北京六一);Tanon 2500凝膠成像系統(tǒng)(Tanon)。

1.2 線蟲分離與形態(tài)學(xué)觀察

采用貝爾曼漏斗法分離線蟲。將單層廚房用紙均勻鋪于漏斗中,切取山藥塊莖約250 g置漏斗中,加入200 mL無菌水,25℃靜置24 h后,接取線蟲液約10 mL鏡檢。從線蟲液中挑取單條病原線蟲,60℃殺死分離到的線蟲后,在顯微鏡下觀察線蟲的形態(tài)特征,依據(jù)劉維志[13]的《植物線蟲志》和謝輝[14]的《植物線蟲分類學(xué)》進(jìn)行屬的鑒定,分別統(tǒng)計(jì)各屬線蟲的數(shù)量。山藥塊莖樣品的采集地點(diǎn)和地理信息見表1。

表1 江西省山藥線蟲樣品的采集信息和形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果Table 1 Geographic information and genus identification of nematode populations collected from yam fields in Jiangxi province

續(xù)表1 Table 1(Continued)

1.3 線蟲的分子鑒定

單條線蟲的DNA提取方法參見王江嶺等[15]。以單條線蟲DNA為模板,采用引物對TW81(5′-GTTTCCGTAGGTGAACCTGC-3′)和AB28(5′-ATATGCTTAAGTTCAGCGGGT-3′)擴(kuò)增rDNA-ITS區(qū)片段,退火溫度為55℃[16]。采用引物對D2A(5′-ACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTG-3′)和D3B(5′-TCGGAAGGAACCAGCTACTA-3′) 擴(kuò)增rDNA 28S D2-D3區(qū)片段,退火溫度為55℃[17]。對于根結(jié)線蟲屬種類的分子鑒定,同時采用引物對NAD5F2(5′-TATTTTTTGTTTGAGATATATTAG-3′)和NAD5R1(5′-CGTGAATCTTGATTTT-

CCATTTTT-3′)擴(kuò)增mtDNA的Nad5基因片段,退火溫度為45℃[18]。PCR反應(yīng)體系:DNA模板為3 μL,10 μmol/L的上、下游引物各1 μL,2×PremixTaqTM12.5 μL,滅菌ddH2O補(bǔ)足至25 μL。擴(kuò)增條件為:94℃預(yù)變性4 min;94℃變性30 s,55℃/45℃退火30 s,72℃延伸1 min(根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物大小確定),32個循環(huán);72℃再延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后,使用DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行純化,用pEASY-T1 Cloning Kit克隆后送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序。采用DNAstar軟件進(jìn)行序列拼接,對所測序列進(jìn)行同源性分析,并提交GenBank獲得序列號。

1.4 系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建和地理分布分析

從GenBank下載相關(guān)線蟲種類的rDNA-ITS和rDNA 28S D2-D3同源序列并進(jìn)行序列的相似性分析。采用MEGAX軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,以大豆孢囊線蟲Heteroderaglycines作為外群。通過統(tǒng)計(jì)分析明確江西省各地區(qū)采集山藥樣品的線蟲種類發(fā)生情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 江西省山藥線蟲種類的形態(tài)鑒定結(jié)果

從江西省7市27縣(市)共采集山藥塊莖樣品157份,分別采自‘永豐淮山’‘竹篙薯’‘瑞昌山藥’‘腳板薯’等山藥品種,其中62份有線蟲侵染,不同的山藥種類均有不同程度的受害情況。山藥塊莖上分離到的線蟲經(jīng)鏡檢發(fā)現(xiàn),病原線蟲為短體線蟲屬Pratylenchus和根結(jié)線蟲屬M(fèi)eloidogyne線蟲。短體線蟲侵染的塊莖表面有近圓形或不規(guī)則稍凹陷的褐色病斑,感病嚴(yán)重的塊莖病斑上有很多龜裂狀的縱向裂紋。切開病莖,縱切面有深褐色或黃褐色的黏腐糊狀病組織,嚴(yán)重時,塊莖腐爛并散發(fā)腐臭氣味。根結(jié)線蟲侵染的塊莖表面呈暗褐色,多數(shù)塊莖畸形。在線蟲侵入點(diǎn)附近腫脹,凸起,形成許多大小不一的根結(jié),發(fā)病嚴(yán)重的塊莖產(chǎn)生疙瘩,表皮腐爛。

2.2 分子鑒定結(jié)果

為進(jìn)一步確定線蟲的種類,從物種水平準(zhǔn)確區(qū)分開,本研究對表1中發(fā)病率高的地區(qū)中共11份線蟲樣品進(jìn)行了分子鑒定。種群編號為THTZCT-2、THTZH-2、YFZXF-1、THTZQS-1、THKZCWJ-2、YFMT-2、YFSCJ-2、YFXWJ-2、THTZZJ的病原線蟲ITS序列擴(kuò)增產(chǎn)物大小為1 035～1 041 bp,rDNA 28S D2-D3區(qū)序列擴(kuò)增產(chǎn)物大小為759～782 bp。序列經(jīng)克隆測序后,于NCBI中BLAST同源性檢索為咖啡短體線蟲P.coffea,GenBank登錄號詳見表2。編號為JJMHL-2的病原線蟲ITS序列擴(kuò)增產(chǎn)物為558 bp,rDNA 28S D2-D3區(qū)序列擴(kuò)增產(chǎn)物大小為759 bp,BLAST同源性檢索為南方根結(jié)線蟲M.incognita。編號為RCFZ-1的病原線蟲ITS序列擴(kuò)增產(chǎn)物為557 bp,BLAST檢索發(fā)現(xiàn)與埃塞俄比亞根結(jié)線蟲M.ethiopic(KY882495)的序列相似性最高,為92.13%。rDNA 28S D2-D3區(qū)序列擴(kuò)增產(chǎn)物大小為760 bp,BLAST檢索與南方根結(jié)線蟲M.incognita多個序列相似性高達(dá)99.21%。為了進(jìn)一步確定該線蟲種類,對該線蟲的Nad5基因擴(kuò)增并測序,BLAST檢索為南方根結(jié)線蟲。部分山藥樣品中病原線蟲PCR檢測結(jié)果見圖1。

圖1 山藥樣品中病原線蟲PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoresis of PCR product from genes of pathogenic nematode in yam samples

表2 山藥樣品中線蟲分子鑒定結(jié)果Table 2 Molecular identification results of nematodes in yam samples

2.3 病原線蟲種群系統(tǒng)發(fā)育樹分析

將測定的序列與不同地區(qū)的短體線蟲和根結(jié)線蟲種群的序列進(jìn)行比對后構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖2),選擇大豆孢囊線蟲H.glycines作為外群?；贗TS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果顯示,山藥樣品中分離的短體線蟲屬線蟲(種群編號為THTZCT-2、THTZH-2、YFZXF-1、THTZQS-1、THKZCWJ-2、YFMT-2、YFSCJ-2、YFXWJ-2、THTZZJ)與咖啡短體線蟲聚為1個分支,樣品中分離的根結(jié)線蟲屬線蟲(種群編號為RCFZ-1和JJMHL-2)與南方根結(jié)線蟲聚為1個分支。此外,基于rDNA 28S D2-D3序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹也得到一致的結(jié)果。

圖2 基于rDNA-ITS序列和rDNA 28S D2-D3區(qū)序列的病原線蟲系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of pathogenic nematodes based on rDNA-ITS sequences and rDNA 28S D2-D3 sequences

2.4 江西省山藥線蟲的種類和地理分布

對江西省157份山藥塊莖樣品的線蟲發(fā)生情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,吉安市、九江市、宜春市、贛州市和撫州市山藥主產(chǎn)區(qū)均存在線蟲危害情況,萍鄉(xiāng)市和南昌市山藥樣品中未檢測到病原線蟲(表3)。在62份線蟲侵染樣品中,短體線蟲屬侵染樣品有45份(含根結(jié)線蟲屬與短體線蟲屬復(fù)合侵染的山藥樣品8份),占總山藥線蟲侵染樣品數(shù)的72.6%;根結(jié)線蟲屬侵染樣品有27份(含兩類線蟲復(fù)合侵染的山藥樣品8份),占總山藥線蟲樣品數(shù)的43.5%。在吉安市62份山藥樣品中,短體線蟲屬單一侵染樣品有27份,根結(jié)線蟲屬單一侵染樣品有7份,短體線蟲屬線蟲和根結(jié)線蟲屬線蟲復(fù)合侵染的山藥樣品有3份,咖啡短體線蟲為優(yōu)勢種群。對吉安市的山藥樣品進(jìn)一步分析,發(fā)現(xiàn)永豐縣和泰和縣的線蟲發(fā)病率較高,其中永豐縣的山藥線蟲侵染率為66.7%,泰和縣的山藥線蟲侵染率高達(dá)88.9%,而在遂川縣、吉水縣、吉安縣、萬安縣的山藥樣品中均未發(fā)現(xiàn)病原線蟲。

表3 江西省采集山藥樣品線蟲侵染的發(fā)生情況Table 3 The occurrence of nematode infection in yam collected in Jiangxi province

咖啡短體線蟲是江西省山藥主產(chǎn)區(qū)的優(yōu)勢種群,在吉安市、九江市、撫州市和贛州市等地均廣泛分布,其中吉安市永豐縣和泰和縣兩地危害最為嚴(yán)重。南方根結(jié)線蟲雖不是優(yōu)勢種群,但在江西省大部分地區(qū)都有零星發(fā)生。此外,樣品中也存在單一種群侵染和復(fù)合種群侵染的情況。

3 討論

線蟲病的危害是目前山藥種植中的一個重要問題,嚴(yán)重制約山藥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。而要實(shí)現(xiàn)對山藥線蟲病的治理,首先必須對其線蟲種類進(jìn)行鑒定,明確其在山藥主產(chǎn)區(qū)的分布,才能有的放矢制定治理策略。

利用形態(tài)學(xué)特征及分子生物學(xué)鑒定相結(jié)合的方法對病原線蟲種類鑒定是國內(nèi)外研究者常采用的研究方法,其準(zhǔn)確性和可靠性較高[19-20]。本文對江西省各地的山藥種植區(qū)進(jìn)行取樣,共取得山藥塊莖樣品157份,分別采自‘永豐淮山’‘竹篙薯’‘瑞昌山藥’‘腳板薯’等山藥品種。通過病原線蟲分離,形態(tài)學(xué)觀察共獲得62份病原線蟲侵染的樣品,且不同的山藥種類均有不同程度的受害情況。通過分子生物學(xué)技術(shù)對病原線蟲進(jìn)行種類鑒定,明確了病原線蟲種類為咖啡短體線蟲和南方根結(jié)線蟲。將咖啡短體線蟲的rDNA-ITS序列和28S序列進(jìn)行同源性分析,發(fā)現(xiàn)同源性結(jié)果與采樣地理來源之間沒有明顯關(guān)系。其中采自吉安市泰和縣塘洲鎮(zhèn)的短體線蟲(編號為THTZQS-1),其rDNA-ITS序列和28S序列突變/插入率均比其他地區(qū)的線蟲要高,采用高保真酶得到的序列也是如此。此現(xiàn)象產(chǎn)生原因是否與田間環(huán)境有關(guān),需要進(jìn)一步研究。

本研究通過對江西省山藥主產(chǎn)區(qū)7市27縣的山藥進(jìn)行取樣,明確了病原線蟲為咖啡短體線蟲和南方根結(jié)線蟲,咖啡短體線蟲在江西大多地區(qū)都有廣泛分布,為江西省山藥主產(chǎn)區(qū)的優(yōu)勢種群。南方根結(jié)線蟲主要在九江、宜春等地分布較多。值得注意的是,江西山藥主產(chǎn)區(qū)中,以吉安市永豐縣和泰和縣兩地的山藥線蟲危害最為嚴(yán)重,山藥線蟲侵染率分別為66.7%和88.9%,且線蟲種類多為咖啡短體線蟲。這可能與當(dāng)?shù)胤N植品種單一、種植年限長、種植習(xí)慣和山藥的常年連作等有關(guān)。有研究表明,農(nóng)戶的一些錯誤種植習(xí)慣,如施肥不當(dāng),會引發(fā)土壤鹽漬化和理化性狀改變;連作導(dǎo)致土壤養(yǎng)分分布不均衡,土壤線蟲和有害微生物增多且頑固,土壤微生物間的拮抗作用削弱,均會加重土傳線蟲病的發(fā)生[21-23]。

綜上所述,本研究表明江西省山藥病原線蟲主要為咖啡短體線蟲和南方根結(jié)線蟲?？Х榷腆w線蟲在江西省大部分地區(qū)都有廣泛分布,是江西省山藥主產(chǎn)區(qū)的優(yōu)勢種群,且以吉安市永豐縣和泰和縣兩地的線蟲危害最為嚴(yán)重。南方根結(jié)線蟲明顯較咖啡短體線蟲少,雖不是優(yōu)勢種群,但是分布也比較廣泛。本研究基本明確了江西省山藥種植區(qū)引起線蟲病的線蟲種類和地理分布情況,為山藥線蟲病的防治提供了理論指導(dǎo)。