網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法確定黃芪對(duì)咳嗽變異性哮喘的藥理機(jī)制及臨床療效驗(yàn)證

夏清青 祁佳 張宇鋒 江衛(wèi)龍△

(1.江陰市中醫(yī)院；南京中醫(yī)藥大學(xué)江陰附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，江蘇 江陰 214400;2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院藥劑科，上海 200092)

咳嗽變異性哮喘(cough variant asthma,CVA)是以持續(xù)氣道慢性炎癥以及氣道高反應(yīng)性為主要病理生理特點(diǎn)，臨床表現(xiàn)為以慢性咳嗽，可伴或不伴有喘息為主要特點(diǎn)，慢性咳嗽時(shí)常是其唯一的癥狀，其發(fā)病機(jī)理與哮喘相同[1]。CVA在祖國(guó)醫(yī)學(xué)多被稱為“風(fēng)咳”、“哮咳”、“頑咳”、“咳喘”、“頓嗆”等病癥，近年來(lái)中醫(yī)藥在治療CVA顯現(xiàn)出比較積極的作用[2- 3]。黃芪作為傳統(tǒng)中藥，有補(bǔ)中益氣、益衛(wèi)固表、利水消腫等作用，目前已有臨床研究[4-5]表明黃芪治療CVA臨床療效顯著。目前針對(duì)黃芪治療CVA的研究多以研究單一化合物為主，局限于針對(duì)某個(gè)靶基因來(lái)探討其作用機(jī)制，然而黃芪成分多樣、復(fù)雜，單一研究缺乏全面性、整體性。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)主張綜合網(wǎng)絡(luò)分析，與中藥多成分、多靶點(diǎn)、多通路的特點(diǎn)相符合，符合中醫(yī)的整體觀及辨證觀，目前已廣泛用于中藥的研究[6-7]。本研究運(yùn)用中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的技術(shù)與方法，首次對(duì)黃芪治療CVA的藥理作用機(jī)制進(jìn)行確定，通過(guò)構(gòu)建 “中藥-化合物-靶基因-疾病”的多層次網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)行綜合網(wǎng)絡(luò)分析，最終從整體角度探討黃芪治療CVA的作用機(jī)制，并結(jié)合其作用機(jī)制進(jìn)一步通過(guò)臨床研究進(jìn)行臨床療效驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1“中藥-化合物-靶基因-疾病”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 利用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)(http://tcmspw.com/tcmsp.php)獲取黃芪的主要化合物，通過(guò)設(shè)定生物利用度(oral bioavailability,OB)、類藥性(drug-likeness,DL)等條件，篩選出候選化合物及其相應(yīng)的靶基因[8]。在UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.uniprot.org/)檢索靶基因?qū)?yīng)的基因編碼，并校正為官方名稱。在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.genecards. org/)以“cough variant asthma”為檢索詞，搜索出與CVA相關(guān)的疾病靶基因。將黃芪候選化合物的靶基因與CVA相關(guān)的疾病靶基因取交集，得到黃芪治療CVA的目標(biāo)靶基因。使用Cytoscape3.6.0軟件構(gòu)建“中藥-化合物-靶基因-疾病”網(wǎng)絡(luò)，并對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，節(jié)點(diǎn)(node)代表黃芪、化合物、靶基因以及疾病，邊(edge)表示了它們之間的聯(lián)系，根據(jù)節(jié)點(diǎn)連接度值篩選出黃芪治療CVA的關(guān)鍵化合物。

1.2蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和關(guān)鍵靶基因的篩選 把得到的黃芪治療CVA的目標(biāo)靶基因所對(duì)應(yīng)的基因編碼導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org/)，限定研究物種為“Homo sapiens”，構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(protein-protein interaction network，PPI network)，得到黃芪作用于CVA的PPI網(wǎng)絡(luò)。應(yīng)用Cytoscape3.6.0軟件分析篩選出黃芪治療CVA的關(guān)鍵靶基因。

1.3研究對(duì)象及治療方法 收集我院2017年1月至2018年12月肺病科門(mén)診治療的CVA患者80例，納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合《咳嗽的診斷與治療指南》中CVA的診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]；(2)支氣管舒張?jiān)囼?yàn)陽(yáng)性者；(3)入組前均未采取中藥治療；(4)對(duì)本次研究知情并同意者。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他嚴(yán)重支氣管或肺部疾病者；(2)合并嚴(yán)重肝腎功能不全者；(3)妊娠期或哺乳期女性；(4)對(duì)本研究中使用藥物過(guò)敏者。將患者隨機(jī)分為對(duì)照組和治療組各40例。對(duì)照組給予布地奈德福莫特羅粉吸入劑(AstraZeneca AB，批準(zhǔn)文號(hào)H20140458)吸入治療，1吸/次(4.5 μg福莫特羅和160 μg布地奈德)，2次/d。治療組在對(duì)照組的基礎(chǔ)上加用中藥黃芪(顆粒劑，江蘇江陰天江藥業(yè)有限公司)口服治療，開(kāi)水沖服，每次10 g/1袋，2次/d。兩組均連續(xù)使用28 d后觀察臨床療效。另取我院治未病中心的40名健康體檢者作為正常組。

1.4療效判定及誘導(dǎo)痰檢測(cè) 制定咳嗽癥狀評(píng)分表，治療后咳嗽癥狀評(píng)分≤1分定義為痊愈；治療后咳嗽癥狀評(píng)分較治療前減少≥3分定義為顯效；治療后咳嗽癥狀評(píng)分較治療前減少<3分定義為有效；治療后咳嗽癥狀評(píng)分較治療前無(wú)減少或反而增加定義為無(wú)效。對(duì)所有患者治療前后進(jìn)行評(píng)分。愈顯率=[(痊愈人數(shù)+顯效人數(shù))/總?cè)藬?shù)]×100%。參照既往方法[4,10]制備誘導(dǎo)痰。按測(cè)試盒說(shuō)明書(shū)嚴(yán)格操作，采用ELISA法測(cè)定誘導(dǎo)痰IL-6水平。

2 結(jié) 果

2.1“中藥-化合物-靶基因-疾病”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和分析 通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)檢索黃芪的主要化合物，獲得黃芪的化合物共87個(gè)，設(shè)定OB≥30%、DL≥0.18，篩選出黃芪的候選化合物共20個(gè)，候選化合物的基本信息見(jiàn)表1。在TCMSP中獲得20個(gè)候選化合物的對(duì)應(yīng)靶基因，并在UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)，物種限定為Homo sapiens，轉(zhuǎn)換為對(duì)應(yīng)的基因編碼，最終獲得97個(gè)靶基因及對(duì)應(yīng)基因編碼，其中其中編號(hào)為：MOL000374、MOL000398、MOL000438、MOL000439的化合物未搜索到靶基因。從GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索到CVA相關(guān)疾病靶基因2231個(gè)。將97個(gè)黃芪化合物靶基因與2231個(gè)CVA相關(guān)疾病靶基因取交集，得到62個(gè)交集基因，即為黃芪治療CVA的目標(biāo)靶基因，對(duì)應(yīng)15個(gè)有效化合物，借助Cytocsape3.6.0軟件構(gòu)建“中藥-化合物-靶基因-疾病”網(wǎng)絡(luò)，網(wǎng)絡(luò)中有79個(gè)節(jié)點(diǎn)(化合物節(jié)點(diǎn)15個(gè)，靶基因節(jié)點(diǎn)62個(gè)，中藥黃芪節(jié)點(diǎn)1個(gè)，疾病節(jié)點(diǎn)1個(gè))和219條邊，見(jiàn)圖1。圖中度值最高的化合物為槲皮素(度值：52)、山奈酚(度值：23)、7-O-甲基異丙醇胺(度值：13)、芒柄花黃素(度值：10)、3,9-二-O-甲基尼森香碗豆紫檀酚(度值：10)。這些度值較高的化合物可被認(rèn)為是黃芪治療CVA的關(guān)鍵化合物。

表1 候選化合物的基本信息

圖1 中藥-化合物-靶基因-疾病網(wǎng)絡(luò)

2.2PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和關(guān)鍵靶基因的篩選 為了進(jìn)一步研究黃芪治療CVA的作用機(jī)制，將62個(gè)黃芪治療CVA的目標(biāo)靶基因通過(guò)STRING數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析，獲取PPI網(wǎng)絡(luò)，選取互作分?jǐn)?shù)(interaction score)≥0.4，網(wǎng)絡(luò)中有61個(gè)靶基因可以發(fā)生蛋白相互作用(有1個(gè)靶點(diǎn)未發(fā)生蛋白相互作用)，500條邊代表了它們之間相互作用，見(jiàn)圖2。圖中度值最高的靶基因?yàn)镮L-6白細(xì)胞介素6(度值：40)、CASP3胱天蛋白酶3(度值：38)、EGFR表皮生長(zhǎng)因子受體(度值：38)、VEGFA血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(度值：38)、MAPK8絲裂原活化蛋白激酶8(度值：36)等(圖3)，推測(cè)這些靶基因可能是黃芪治療CVA的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

圖2 黃芪治療CVA靶基因的PPI網(wǎng)絡(luò)

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)中黃芪治療CVA的關(guān)鍵靶點(diǎn)

2.3臨床療效 兩組按照咳嗽癥狀評(píng)分表進(jìn)行評(píng)分，得出痊愈、顯效、有效、無(wú)效例數(shù)結(jié)果，分別為，治療組痊愈20例、顯效15例、有效4例、無(wú)效1例；對(duì)照組痊愈14例、顯效13例、有效10例、無(wú)效3例。治療組臨床治療愈顯率為87.5%，明顯高于對(duì)照組的67.5%(χ2=4.530,P=0.033)。

2.4黃芪對(duì)CVA患者誘導(dǎo)痰IL-6水平的影響 治療前，正常組誘導(dǎo)痰IL-6水平為(12.20±3.46)，治療組為(44.67±6.40)，對(duì)照組為(44.30±6.54)，均高于正常組(t=28.226、27.439，P均=0.000)；治療后，治療組誘導(dǎo)痰IL-6水平為(23.66±4.31)，對(duì)照組為(34.75±5.22)，兩組誘導(dǎo)痰IL-6水平均低于治療前(t=17.221、7.218，P均=0.000)；且治療后治療組誘導(dǎo)痰IL-6水平低于對(duì)照組(t=10.361，P=0.000)。

3 討 論

CVA與哮喘有著相同的發(fā)病機(jī)制，其臨床表現(xiàn)以慢性咳嗽為主[1,11]。中醫(yī)認(rèn)為為風(fēng)邪導(dǎo)致傷津化燥，累及肺絡(luò)，引起慢性咳嗽，臨床辨治多以辛溫去邪、補(bǔ)肺益氣等為主要原則[12]。黃芪有補(bǔ)中益氣、益衛(wèi)固表、利水消腫等作用，已有諸多研究[4,5,13]表明黃芪治療CVA臨床療效顯著。黃芪成分復(fù)雜，含有化合物較多，現(xiàn)有研究多局限于針對(duì)某個(gè)化合物來(lái)解釋黃芪的作用機(jī)制，缺乏宏觀整體。目前網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)被廣泛用于中藥的研究，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)主張整體網(wǎng)絡(luò)、分組分析的研究方法，與中藥成分多樣、靶點(diǎn)豐富、通路繁多的特點(diǎn)相契合，通過(guò)網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)的連接和關(guān)系分析，實(shí)現(xiàn)分子作用的網(wǎng)絡(luò)整體分析，深度研究中藥與機(jī)體的相互作用[14,15]。

研究[16-17]顯示，黃芪治療CVA發(fā)揮作用的關(guān)鍵化合物有槲皮素、山奈酚、7-O-甲基異丙醇胺、芒柄花黃素、3,9-二-O-甲基尼森香碗豆紫檀酚等。已有研究[18]報(bào)道，槲皮素可抑制哮喘模型大鼠IL-5和IL-6的表達(dá)來(lái)治療哮喘；槲皮素對(duì)卵清蛋白誘導(dǎo)的支氣管哮喘模型小鼠具有明顯的保護(hù)作用。山奈酚可抑制過(guò)敏性哮喘小鼠氣道上皮細(xì)胞嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和氣道炎癥。芒柄花黃素可能改善上皮細(xì)胞間E-cadheirn蛋白的表達(dá)以及分布，來(lái)抑制Th2型過(guò)敏性疾病[19]。本研究結(jié)果與已有的化合物研究相符合，說(shuō)明黃芪治療CVA是由多種化合物多種成分共同發(fā)揮作用的。獲取PPI網(wǎng)絡(luò)分析顯示，黃芪治療CVA是由多靶點(diǎn)共同發(fā)揮作用的。IL-6、CASP3、EGFR、VEGFA、MAPK8，這些靶點(diǎn)可能是黃芪治療CVA的關(guān)鍵靶點(diǎn)。這些靶點(diǎn)與CVA的發(fā)病機(jī)理密切相關(guān)，已有研究[20]表明調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞亞群在CVA發(fā)病機(jī)制中起著主要作用，主要機(jī)制為體內(nèi)活性的致炎因子IL-6等被調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子抑制。

我們進(jìn)一步通過(guò)臨床研究，驗(yàn)證黃芪治療CVA的臨床療效，臨床研究顯示加用黃芪治療CVA與治療前以及對(duì)照組比較，患者誘導(dǎo)痰IL-6水平降低明顯，說(shuō)明調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞亞群調(diào)節(jié)紊亂參與CVA的致病過(guò)程，與PPI網(wǎng)絡(luò)中IL-6靶點(diǎn)可能是黃芪治療CVA的關(guān)鍵靶點(diǎn)相符合，提示黃芪可以通過(guò)作用IL-6基因，調(diào)節(jié)CVA患者免疫狀態(tài)，進(jìn)而發(fā)揮作用。臨床療效驗(yàn)證方面顯示，加用黃芪治療CVA的愈顯率明顯優(yōu)于對(duì)照組，直接從臨床層面進(jìn)行了驗(yàn)證。

本研究尚存在一些不足，如通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)搜集數(shù)據(jù)的全面與否及化合物篩選標(biāo)準(zhǔn)尚不能做到完全準(zhǔn)確。此外，本研究臨床研究樣本較少，尚未考慮中藥劑量、劑型及用法對(duì)治療結(jié)果的影響。然而，本研究借助相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫(kù)和軟件，從中醫(yī)整體觀及辨證觀出發(fā)，與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析方法相結(jié)合，構(gòu)建多層次網(wǎng)絡(luò)，對(duì)網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)的連接和關(guān)系進(jìn)行分析，系統(tǒng)整體的對(duì)黃芪治療CVA的作用機(jī)制進(jìn)行確定，并從臨床療效等方面進(jìn)行驗(yàn)證，為黃芪治療CVA作用機(jī)制提供新方向，更好的為今后的實(shí)驗(yàn)及臨床研究提供依據(jù)及思路。