單細(xì)胞測序技術(shù)在乳腺癌研究中的應(yīng)用進(jìn)展

劉 強(qiáng)，方 儀，王靖

國家癌癥中心，國家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院乳腺外科，北京 100021

癌癥嚴(yán)重威脅人類健康，影響人類壽命，世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)最新研究報告［1］顯示，女性乳腺癌發(fā)病率已超過肺癌，2020年新發(fā)病例約230萬例，占全部新發(fā)癌癥病例的11.7%。乳腺癌是一種起源于乳腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞的高度異質(zhì)性的疾病，腫瘤之間、腫瘤內(nèi)部及患有癌癥的個體間存在高度異質(zhì)性，這些因素共同導(dǎo)致疾病進(jìn)展和耐藥性產(chǎn)生。近年來，全基因組測序等高通量測序技術(shù)的進(jìn)步使我們能夠以前所未有的深度分析腫瘤，尤其是近年來興起的單細(xì)胞測序技術(shù)，包括單細(xì)胞RNA測序（single-cell RNA sequencing，scRNA-seq）、單細(xì)胞DNA測序（single-cell DNA-sequencing，scDNA-seq）、高通量測序分析轉(zhuǎn)座酶可及染色質(zhì)（assay for transposase-accessible chromatin with high-throughput sequencing，scATAC-seq）及單細(xì)胞T細(xì)胞受體測序（single-cell T cell receptor sequencing，scTCR-seq）等。其中scRNA-seq是在單個細(xì)胞水平對mRNA進(jìn)行高通量測序的一項新技術(shù)，針對單個細(xì)胞研究其整體水平的基因表達(dá)情況。scDNA-seq是利用優(yōu)化的二代測序技術(shù)檢測來自單細(xì)胞的DNA信息，提供細(xì)胞層面的遺傳圖譜，以更好地了解單細(xì)胞在微環(huán)境中的功能，scATAC-seq能在基因組水平上幫助我們了解細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程，揭示不同調(diào)控因子位點(diǎn)，從表觀遺傳學(xué)的角度來解析基因信息。scATACseq在開放染色質(zhì)圖譜繪制、細(xì)胞分化發(fā)育、疾病的致病機(jī)制、腫瘤微環(huán)境及生物標(biāo)志物研究等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。scTCR-seq技術(shù)則通過對大量T細(xì)胞進(jìn)行TCR測序分析，有助于理解TCR免疫組庫的多樣性、TCR介導(dǎo)的抗原特異性識別及適應(yīng)性免疫的相關(guān)機(jī)制。

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)是一種可以對單個細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析的新技術(shù)，近年來，單細(xì)胞測序技術(shù)進(jìn)一步的更新迭代使其得以用更低的成本獲得更高的準(zhǔn)確度及靈敏度。通過分析復(fù)雜組織中的單個細(xì)胞，相比傳統(tǒng)的組織測序技術(shù)，單細(xì)胞測序技術(shù)在研究細(xì)胞群體的異質(zhì)性以及探索與腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移相關(guān)的細(xì)胞類型方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢。為確保有足夠的RNA量用于后續(xù)分析，傳統(tǒng)的RNA測序技術(shù)是對從混雜組織或較大的細(xì)胞群體中提取出的混合RNA進(jìn)行測序，因此不可避免地局限于僅能獲得混合細(xì)胞群體中的基因表達(dá)平均值，而無法捕獲細(xì)胞群體間的轉(zhuǎn)錄組異質(zhì)性，限制了我們真正了解具體細(xì)胞類型中的基因表達(dá)信息［2］。近年來不斷發(fā)展的單細(xì)胞測序技術(shù)已經(jīng)能夠分離單細(xì)胞，在單細(xì)胞水平上建庫測序，捕獲單個細(xì)胞的基因表達(dá)信息。2009年，Tang等［3］首次報道了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，最初的單細(xì)胞測序只能對10～100個細(xì)胞進(jìn)行研究，隨著技術(shù)的不斷完善，現(xiàn)階段人們已經(jīng)能夠在單個項目中對成千上萬個單細(xì)胞進(jìn)行測序［4-6］。

在乳腺癌研究領(lǐng)域，通過將具有不同分子分型的乳腺癌細(xì)胞進(jìn)行聚類，以鑒定出可能與不良預(yù)后和耐藥性相關(guān)的不同群體。在乳腺癌微環(huán)境研究方面，可以通過鑒定與免疫逃逸相關(guān)的免疫細(xì)胞亞群，以期發(fā)現(xiàn)新的潛在免疫治療靶點(diǎn)；單細(xì)胞測序技術(shù)的發(fā)展還使腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞與細(xì)胞通訊研究、單細(xì)胞水平的調(diào)節(jié)狀態(tài)研究成為可能?？傊瑔渭?xì)胞測序技術(shù)的迅猛發(fā)展使人們能夠進(jìn)一步了解實(shí)體腫瘤中細(xì)胞的異質(zhì)性，并具有闡明腫瘤發(fā)展、轉(zhuǎn)移的復(fù)雜機(jī)制的巨大潛力，為確立乳腺腫瘤精準(zhǔn)治療策略提供新的思路。

1 乳腺癌單細(xì)胞圖譜類研究進(jìn)展

傳統(tǒng)基因組和基因表達(dá)譜所展示的是患者乳腺癌組織的特征，而腫瘤內(nèi)部存在高度異質(zhì)性，極有可能會影響療效，因此，深入到單細(xì)胞層面的基因組及基因表達(dá)研究顯得尤其必要。近年來，基于單細(xì)胞測序技術(shù)的基因表達(dá)圖譜研究開始在單細(xì)胞水平上呈現(xiàn)乳腺癌的基因表達(dá)圖譜。2017年，Chung等［7］應(yīng)用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序分析了來自包含4種乳腺癌亞型的11例原發(fā)性乳腺癌患者的515個細(xì)胞的基因組圖譜，根據(jù)scRNA-seq數(shù)據(jù)推斷拷貝數(shù)變異將癌細(xì)胞與非癌細(xì)胞區(qū)分，結(jié)果表明，癌細(xì)胞在腫瘤內(nèi)既有共同的特征，也顯示出乳腺癌亞型和關(guān)鍵腫瘤相關(guān)通路的瘤內(nèi)異質(zhì)性，大多數(shù)的非癌細(xì)胞是免疫細(xì)胞，包括3個不同的分群，分別是T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞簇。淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞都表現(xiàn)出免疫抑制特征：具有調(diào)節(jié)或耗竭表型的T細(xì)胞和具有M2表型的巨噬細(xì)胞，該研究提示乳腺癌轉(zhuǎn)錄組具有廣泛的瘤內(nèi)異質(zhì)性，這種異質(zhì)性包括腫瘤細(xì)胞及周圍環(huán)境中的其他間質(zhì)細(xì)胞。乳腺癌起源于乳腺上皮細(xì)胞，它們獲得遺傳改變，導(dǎo)致隨后的組織穩(wěn)態(tài)喪失，2018年Nguyen等［8］繪制了人類乳腺上皮的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜，該研究應(yīng)用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)描繪了來源于7名女性的共25790個正常乳腺上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組圖譜，經(jīng)過聚類分析，定義了3類細(xì)胞：分泌性Luminal細(xì)胞、激素反應(yīng)性Luminal細(xì)胞和基底細(xì)胞，通過擬時序分析，重建了連接這3類細(xì)胞的分化路徑，該研究系統(tǒng)描述了乳腺上皮細(xì)胞的特征圖譜，有助于進(jìn)一步理解乳腺癌細(xì)胞的譜系分化。近年來，腫瘤免疫治療的發(fā)展如火如荼，但由于腫瘤異質(zhì)性的存在，導(dǎo)致不同疾病或同一疾病不同患者，應(yīng)用免疫抑制劑治療的臨床效果各不相同，因此全面理解乳腺癌微環(huán)境中的免疫細(xì)胞圖譜至關(guān)重要。2018年，Azizi等［9］收集了4種具有代表性的來自8例未接受過治療的原發(fā)性乳腺癌患者腫瘤組織，包括雌激素受體（estrogen receptor，ER）陽性乳腺癌、孕激素受體（progesterone receptor，PR）陽性乳腺癌、人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）陽性乳腺癌、三陰性乳腺癌（triplenegative breast cancer，TNBC）癌組織、癌旁組織和由乳腺成形術(shù)得到的正常乳腺組織，對收集的共計47016個CD45+細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序，并對這些組織中的免疫細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞活化及分化狀態(tài)鑒定，提供了一個全面的乳腺腫瘤內(nèi)的免疫細(xì)胞圖譜，揭示了乳腺腫瘤內(nèi)的免疫細(xì)胞分群情況，鑒定出83個不同的免疫細(xì)胞簇，包括38個T細(xì)胞簇、27個髓系細(xì)胞簇、9個B細(xì)胞簇和9個自然殺傷（natural killer，NK）細(xì)胞簇，揭示了適應(yīng)性免疫和固有免疫系統(tǒng)免疫細(xì)胞的多樣性，這種巨大的變化與細(xì)胞所處的組織微環(huán)境有關(guān)。近日，一項屬于乳腺癌細(xì)胞圖譜（Breast Cancer Cell Atlas）計劃的研究［6］從5例原發(fā)性TNBC病例中采集了24271個細(xì)胞，利用scRNAseq對其開展分析，確定了4個基質(zhì)細(xì)胞群，包括2個與癌癥相關(guān)的成纖維細(xì)胞亞群，以及2個血管周樣基質(zhì)細(xì)胞亞群，作者還通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路預(yù)測，發(fā)現(xiàn)了基質(zhì)細(xì)胞與免疫細(xì)胞間存在廣泛的相互作用。乳腺癌單細(xì)胞圖譜類研究仍在迅猛發(fā)展，將為人類從單細(xì)胞水平探索乳腺癌異質(zhì)性及其真實(shí)的微環(huán)境動態(tài)演變提供借鑒。

2 單細(xì)胞測序技術(shù)應(yīng)用于乳腺癌微環(huán)境研究

乳腺癌微環(huán)境具有高度的異質(zhì)性，主要由腫瘤細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞等構(gòu)成，乳腺癌微環(huán)境中的多種細(xì)胞都可能是異質(zhì)性的來源，然而傳統(tǒng)轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對微環(huán)境的異質(zhì)性束手無策，單細(xì)胞測序技術(shù)的發(fā)展使得乳腺癌微環(huán)境研究成為可能，近年來已經(jīng)有多個乳腺癌微環(huán)境相關(guān)的研究成果發(fā)表。腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（cancer-associated fibroblast，CAF）是腫瘤微環(huán)境的主要組成部分，但由于顯著的異質(zhì)性及技術(shù)的局限性，關(guān)于CAF在腫瘤發(fā)生、發(fā)展和治療反應(yīng)中的作用尚不清楚。Bartoschek等［10］分析了來自乳腺癌小鼠模型中的768個間質(zhì)細(xì)胞的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，并在轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)水平上驗(yàn)證了CAF的空間分離來源于3個不同的CAF亞群：血管周圍微環(huán)境、乳腺脂肪墊和轉(zhuǎn)化的上皮，發(fā)現(xiàn)每個CAF亞群的基因譜與獨(dú)特的功能相關(guān)，并且在臨床隊列中具有獨(dú)立的預(yù)后能力，該研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌微環(huán)境中的CAF存在異質(zhì)性，不同的CAF亞型參與不同的功能及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，使得未來針對標(biāo)志物驅(qū)動的靶向乳腺癌微環(huán)境中的CAF治療及藥物開發(fā)成為可能。單細(xì)胞測序技術(shù)的進(jìn)展使得人們突破原有體外研究的局限性，可以比較在真實(shí)腫瘤微環(huán)境中的某一類細(xì)胞與正常組織微環(huán)境中某一類細(xì)胞的基因表達(dá)譜差異，以更精準(zhǔn)的方式研究潛在影響疾病發(fā)生、發(fā)展的細(xì)胞亞型、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及分子靶點(diǎn)。例如，Sebastian等［11］的研究首先采用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)在動物模型中研究了TNBC的CAF的異質(zhì)性，鑒定了6種CAF亞型，對正常乳腺組織及胰腺組織的CAF進(jìn)行單細(xì)胞測序并與TNBC中的CAF分群進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)其中有2個CAF亞群也存在于正常組織中，提示有一部分CAF細(xì)胞亞群對于維持乳腺組織正常微環(huán)境穩(wěn)態(tài)具有重要作用。

乳腺癌微環(huán)境中的腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（tumor infiltrating lymphocyte，TIL）的數(shù)量是提高患者生存率的一個強(qiáng)有力的預(yù)后因素，特別是在TNBC和HER2過表達(dá)的乳腺癌中，雖然T細(xì)胞是主要的TIL群體，但T細(xì)胞亞群的定量和定性差異與患者預(yù)后的關(guān)系仍不清楚。Savas等［12］通過對從乳腺癌組織中分離出的6311個T細(xì)胞進(jìn)行scRNA-seq，發(fā)現(xiàn)浸潤T細(xì)胞存在顯著的異質(zhì)性，表明含有大量TIL的乳腺癌組織中含有CD8+T細(xì)胞，其具有組織駐留記憶T細(xì)胞分化的特征，并且這些CD8+組織駐留記憶T細(xì)胞表達(dá)高水平的免疫檢查點(diǎn)分子和效應(yīng)蛋白。最近Hollern等［13］通過創(chuàng)建新的乳腺腫瘤模型，聯(lián)合scRNA-seq與傳統(tǒng)轉(zhuǎn)錄組測序，發(fā)現(xiàn)腫瘤基因突變數(shù)量和特定免疫細(xì)胞，與免疫檢查點(diǎn)抑制劑的療效密切相關(guān)，此外，該研究還利用敏感和耐藥小鼠模型經(jīng)過或未經(jīng)過免疫治療的腫瘤，建立了scRNA-seq和批量信使RNA測序的大型數(shù)據(jù)庫，通過該方法，發(fā)現(xiàn)免疫檢查點(diǎn)治療可以誘導(dǎo)B淋巴細(xì)胞激活濾泡輔助型T淋巴細(xì)胞，從而促進(jìn)其抗腫瘤作用。該研究還表明，B淋巴細(xì)胞分泌抗體并且激活T淋巴細(xì)胞是免疫治療效果的關(guān)鍵，并且為免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療找出了新的生物標(biāo)志物。此外，單細(xì)胞測序技術(shù)還開始用于乳腺癌微環(huán)境中的細(xì)胞與細(xì)胞通訊研究，例如，Kumar等［14］提出了一種利用scRNA-seq來描繪微環(huán)境中所有細(xì)胞類型之間配體-受體相互作用的方法。

3 單細(xì)胞測序技術(shù)應(yīng)用于乳腺癌耐藥研究

原發(fā)性Luminal型乳腺癌是由非突變ERα驅(qū)動，所有術(shù)后患者會采取輔助內(nèi)分泌治療，這一治療策略可顯著延遲臨床復(fù)發(fā)，但卻不能完全消除復(fù)發(fā)，每年約有3%的患者復(fù)發(fā)，因此不可避免地導(dǎo)致腫瘤進(jìn)一步的發(fā)展、轉(zhuǎn)移。2018年，Hong等［15］使用活細(xì)胞成像、單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序和機(jī)器學(xué)習(xí)分析ERα陽性乳腺癌的表型異質(zhì)性和可塑性，并利用這些信息在體外和體內(nèi)鑒定了一種罕見的細(xì)胞類型，這些細(xì)胞表現(xiàn)出獨(dú)特的轉(zhuǎn)錄特征，具有休眠及混合上皮和間質(zhì)特征，在循環(huán)腫瘤細(xì)胞群中占主導(dǎo)地位。TNBC是一種侵襲性的乳腺癌亞型，常對新輔助化療（neoadjuvant chemotherapy，NAC）耐藥，但仍未確定其耐藥性是由罕見的已經(jīng)存在的克隆選擇引起的，2018年Kim等［5］通過scDNA-seq、scRNA-seq及外顯子組測序?qū)?0例處于治療過程中的TNBC患者的大量細(xì)胞進(jìn)行了分析，首先采用深度外顯子組測序確定了10例NAC導(dǎo)致克隆消失的患者和10例治療后克隆持續(xù)存在的患者，通過DNA測序分析了900個單細(xì)胞，RNA測序分析了6862個細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)化療中出現(xiàn)的拷貝數(shù)突變是預(yù)先存在且適應(yīng)性選擇的，而表達(dá)譜是通過轉(zhuǎn)錄重編程獲得的，揭示了TNBC患者在接受NAC時腫瘤細(xì)胞的基因組和表型進(jìn)化，他們表現(xiàn)出兩種截然不同的克隆動態(tài)，即消退或持續(xù)，在克隆性消退患者中，NAC消除了腫瘤細(xì)胞，只留下正常細(xì)胞類型，而克隆性持續(xù)患者則攜帶更多數(shù)量的殘留腫瘤細(xì)胞，其基因型和表型在NAC反應(yīng)中發(fā)生改變。Impassion130研究［16］結(jié)果表明，免疫治療可以改善晚期程序性死亡［蛋白］配體-1（programmed death ligand-1，PD-L1）陽性TNBC患者的預(yù)后，采用單細(xì)胞測序技術(shù)比較了治療應(yīng)答及治療后疾病進(jìn)展患者接受免疫治療聯(lián)合化療前后近4000多個細(xì)胞的變化情況，scRNA-seq分析顯示，治療應(yīng)答及治療后疾病進(jìn)展患者在免疫治療聯(lián)合化療前后，腫瘤免疫浸潤細(xì)胞存在顯著的基線異質(zhì)性，在治療應(yīng)答患者中，程序性死亡［蛋白］-1（programmed death-1，PD-1）高表達(dá)的T細(xì)胞在治療后顯著減少，并且存在組織駐留記憶T細(xì)胞，而治療后疾病進(jìn)展患者則表現(xiàn)出普遍和持續(xù)的髓系成分。

4 單細(xì)胞測序技術(shù)應(yīng)用于乳腺癌異質(zhì)性及克隆演化研究

異質(zhì)性是惡性腫瘤的內(nèi)在特征，即使在單個腫瘤中，細(xì)胞群體也表現(xiàn)出不同惡性程度及對治療的反應(yīng)情況［17］。近年來，單細(xì)胞測序技術(shù)逐漸被應(yīng)用到乳腺癌異質(zhì)性研究中，例如，2018年，Karaayvaz等［4］對6例原發(fā)性TNBC患者的1500多個細(xì)胞進(jìn)行了scRNA-seq（Smartseq2），發(fā)現(xiàn)每個腫瘤內(nèi)基因表達(dá)程序的細(xì)胞間異質(zhì)性是可變的，并且在很大程度上與推斷的基因組拷貝數(shù)變異的克隆性相關(guān)，表明基因型驅(qū)動了單個亞群的基因表達(dá)的表型，基因表達(dá)譜的聚類分析確定了多個腫瘤共享的不同惡性細(xì)胞亞群，包括與多個耐藥和轉(zhuǎn)移特征相關(guān)的單個亞群，并且功能上以通過激活鞘糖脂代謝和相關(guān)的先天免疫通路為特征，該研究在單細(xì)胞層面揭示了TNBC的功能異質(zhì)性及其與基因組進(jìn)化的關(guān)系。

單細(xì)胞測序技術(shù)使研究者得以單獨(dú)對某一個細(xì)胞亞群的功能狀態(tài)進(jìn)行分析，從而避免其他細(xì)胞的干擾。Gao等［18］應(yīng)用納米網(wǎng)格單核RNA測序方法比較了乳腺癌細(xì)胞系中485個單核與424個單細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組，結(jié)果顯示出高度一致的基因水平和豐度，分析來自乳腺腫瘤組織樣品的416個細(xì)胞核和來自正常乳腺組織的380個細(xì)胞核，揭示了癌細(xì)胞表型的異質(zhì)性，包括血管生成、增殖和干性，以及一個具有許多過表達(dá)癌基因的亞群（19%）。循環(huán)腫瘤細(xì)胞是存在于腫瘤患者血液中的一類細(xì)胞，目前認(rèn)為循環(huán)腫瘤細(xì)胞與腫瘤播散轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，2012年，Powell等［19］使用一種基于微流控的單細(xì)胞測序技術(shù)，87個癌癥相關(guān)基因和參考基因的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄譜顯示出單個循環(huán)腫瘤細(xì)胞之間的異質(zhì)性，根據(jù)31個高表達(dá)基因?qū)⑺鼈兎殖?個主要亞組，相反，來自7個乳腺癌細(xì)胞系的單細(xì)胞卻根據(jù)樣本分化抑制因子（inhibitor of differentiation，ID）和ER狀態(tài)緊密的聚類，這項工作顯示出循環(huán)腫瘤細(xì)胞與其他乳腺癌細(xì)胞系的異質(zhì)性。Chen等［20］通過對一類侵襲、遷移能力強(qiáng)的細(xì)胞進(jìn)行scRNA-seq分析，發(fā)現(xiàn)與乳腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因。循環(huán)腫瘤細(xì)胞簇是存在于腫瘤患者血液中的細(xì)胞群，雖然相對含量少，但比單個循環(huán)腫瘤細(xì)胞有23～50倍的轉(zhuǎn)移侵襲能力。2014年，Aceto等［21］應(yīng)用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)比較了乳腺癌患者血液中配對的循環(huán)腫瘤細(xì)胞簇與循環(huán)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組差異，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞黏附成分珠蛋白的高度差異表達(dá)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)循環(huán)腫瘤細(xì)胞簇來源于多個原發(fā)腫瘤細(xì)胞之間以珠蛋白黏附連接聚集。

在克隆演化研究方面，Wang等［22］應(yīng)用全基因組單核拷貝數(shù)分析及外顯子單細(xì)胞測序方法比較正常及來源于ER陽性乳腺癌和TNBC的單核，發(fā)現(xiàn)非整倍體重排發(fā)生于腫瘤進(jìn)化的早期，并隨著腫瘤的克隆擴(kuò)展而保持高度穩(wěn)定，相反，點(diǎn)突變進(jìn)化逐漸產(chǎn)生廣泛的克隆多樣性。為直接驗(yàn)證基于群體的突變簇推斷和克隆基因型，Eirew等［23］在乳腺癌小鼠移植瘤模型中應(yīng)用單細(xì)胞測序技術(shù)揭示了基因組克隆的擴(kuò)增模式。Demeulemeester等［24］應(yīng)用單細(xì)胞測序技術(shù)，對6例乳腺癌患者的骨髓提取物的63個單細(xì)胞進(jìn)行了基因組測序，對分離的細(xì)胞的基因組圖景進(jìn)行分析，追溯乳腺癌患者播散腫瘤細(xì)胞的來源，研究表明，非轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者的骨髓中存在拷貝數(shù)變異陽性細(xì)胞的異質(zhì)細(xì)胞群體，其中只有一部分來自觀察的腫瘤譜系，提示可以借助單細(xì)胞測序技術(shù)研究播散腫瘤細(xì)胞，為揭示腫瘤轉(zhuǎn)移過程提供更多參考。2015年，Lawson等［25］開發(fā)了一種基于高靈敏度熒光激活細(xì)胞分選（fluorescenceactivated cell sorting，F(xiàn)ACS）的檢測方法用于鑒定和分離轉(zhuǎn)移細(xì)胞，從單細(xì)胞水平揭示了早期轉(zhuǎn)移細(xì)胞具有獨(dú)特的干性基因表達(dá)特征。2020年，Brechbuhl等［26］采用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)提取13例乳腺癌轉(zhuǎn)移患者及1例原發(fā)乳腺癌患者血液中的1707個循環(huán)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序，鑒定了2個循環(huán)腫瘤細(xì)胞亞群。一項最新研究中，Davis等［27］在動物模型中分離出匹配的轉(zhuǎn)移和原發(fā)腫瘤細(xì)胞，利用Illumina平臺構(gòu)建單細(xì)胞庫，對來自9只患者來源異種移植（patientderived xenograft，PDX）小鼠和3個腫瘤模型的共1707個腫瘤和轉(zhuǎn)移細(xì)胞進(jìn)行測序，揭示了乳腺癌轉(zhuǎn)移的轉(zhuǎn)錄多樣性和生物能量轉(zhuǎn)移，表明氧化磷酸化在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中具有重要作用。

5 乳腺癌單細(xì)胞測序公共數(shù)據(jù)的挖掘

2013年，單細(xì)胞測序被Nature雜志評為年度技術(shù)，被認(rèn)為將對生命科學(xué)界和醫(yī)學(xué)界帶來重要改變。隨著二代測序（next-generation sequencing，NGS）技術(shù)成本下降，單細(xì)胞測序得到了更多發(fā)展。各項大型單細(xì)胞測序計劃正在全球范圍內(nèi)廣泛開展，大量單細(xì)胞測序數(shù)據(jù)累積在公共數(shù)據(jù)庫中。例如，人類細(xì)胞圖譜計劃是一項可與“人類基因組計劃”相媲美的大型國際合作項目，致力于建立一個健康人體所包含的所有細(xì)胞的參考圖譜，目前已收錄33個組織、289位供體、4500000個單細(xì)胞的測序數(shù)據(jù)，并在持續(xù)更新中。乳腺癌相關(guān)單細(xì)胞測序數(shù)據(jù)也已有較多積累，但目前仍然沒有專門收集乳腺癌相關(guān)單細(xì)胞測序數(shù)據(jù)的二次數(shù)據(jù)庫，而是分別存儲在各個獨(dú)立的公共數(shù)據(jù)庫中，本文將存儲單細(xì)胞測序數(shù)據(jù)的相關(guān)公共數(shù)據(jù)庫進(jìn)行整理，詳見表1。持續(xù)積累的海量的單細(xì)胞公共數(shù)據(jù)中隱藏著尚待發(fā)掘的寶貴信息，筆者建議應(yīng)該重視對公共數(shù)據(jù)的充分挖掘和利用，目前已有一些研究團(tuán)隊注意到這部分寶貴的數(shù)據(jù)資源。例如，近期Bao等［28］通過整合挖掘TNBC的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)及傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來闡釋腫瘤的異質(zhì)性，并且闡明了M2型腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞在TNBC中的浸潤和侵襲性，該研究所使用的TNBC單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)下載于GEO數(shù)據(jù)庫［29］，傳統(tǒng)轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)下載于UCSC Xena數(shù)據(jù)庫［30］，該研究提示單細(xì)胞測序數(shù)據(jù)挖掘可考慮與傳統(tǒng)測序數(shù)據(jù)進(jìn)行有效整合，同時建議也應(yīng)該考慮單純的數(shù)據(jù)挖掘與濕實(shí)驗(yàn)相結(jié)合。在數(shù)據(jù)挖掘方面，目前尚無專門針對乳腺癌的相關(guān)單細(xì)胞數(shù)據(jù)庫，在數(shù)據(jù)搜集與檢索方面可能會耗費(fèi)大量時間，建議盡快建立專門的乳腺癌單細(xì)胞數(shù)據(jù)庫，實(shí)現(xiàn)專庫專用，降低乳腺癌研究社群挖掘乳腺癌單細(xì)胞數(shù)據(jù)庫的門檻。

表1 scRNA-seq數(shù)據(jù)庫資源匯總Tab.1 scRNA-seq database resources

6 單細(xì)胞測序技術(shù)應(yīng)用于腫瘤研究的挑戰(zhàn)及思考

近年來，人們逐漸意識到單細(xì)胞水平的分析正在改變我們對疾病的理解方式，人們開始理解腫瘤組織、細(xì)胞群體的復(fù)雜性和異質(zhì)性，而傳統(tǒng)的混合組織測序分析不足以完全表征生物學(xué)的復(fù)雜性。單細(xì)胞基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的進(jìn)步將促進(jìn)腫瘤的臨床研究、診斷、預(yù)后預(yù)測和治療的發(fā)展。然而，在單細(xì)胞研究廣泛開展的大背景下，我們也不得不去思考單細(xì)胞技術(shù)應(yīng)用于腫瘤研究的局限性。首先，目前單細(xì)胞分析的常規(guī)方法仍然存在一定缺陷，一方面，在單細(xì)胞的分離和捕獲過程中，單細(xì)胞的活性和完整性可能受到影響，從而導(dǎo)致下游分析中顯示的細(xì)胞功能可能已經(jīng)不同于其在體內(nèi)環(huán)境下的功能狀態(tài)；另一方面，目前單細(xì)胞捕獲的效率不足可能會影響后續(xù)對于組織或細(xì)胞群真實(shí)微環(huán)境的判斷［35］。其次，單細(xì)胞基因組學(xué)能夠在單個實(shí)驗(yàn)中測量成千上萬個單細(xì)胞的基因組信息，其產(chǎn)生的高維大數(shù)據(jù)的分析處理及生物學(xué)意義解析是一個極大的挑戰(zhàn)，一方面對于無生物信息學(xué)或數(shù)據(jù)科學(xué)背景的醫(yī)學(xué)科學(xué)家、臨床醫(yī)師、生物科學(xué)家而言，要完成這些高維數(shù)據(jù)的分析可能會面臨很大困難，這就阻礙了單細(xì)胞測序技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用；另一方面，對于無生物醫(yī)學(xué)知識、臨床醫(yī)學(xué)背景的生物信息學(xué)專家、數(shù)據(jù)科學(xué)家而言，在闡釋解析這些復(fù)雜數(shù)據(jù)背后的生物學(xué)或臨床意義時，可能也會面臨困難。因此，筆者建議應(yīng)該加強(qiáng)生物醫(yī)學(xué)專家與生物信息學(xué)專家的團(tuán)隊合作及溝通，促進(jìn)對于單細(xì)胞大數(shù)據(jù)的理解與挖掘，發(fā)揮出單細(xì)胞分析應(yīng)用于闡明腫瘤發(fā)生、發(fā)展、診斷、治療及預(yù)后預(yù)測方面的巨大潛力。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。