5-FU節(jié)拍化療策略優(yōu)化及調(diào)節(jié)胃癌免疫微環(huán)境的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究

蔣金玲，周塵飛，2，奚文崎，施敏，耿梅，趙麗琴，蔡劬，蔣勁松，張俊，2

1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院腫瘤科，上海 200025；

2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院無錫分院腫瘤科，江蘇 無錫 214021

全球近半數(shù)的新發(fā)胃癌患者和死亡病例在中國，盡管經(jīng)過多年努力，其發(fā)病率略有下降，但中國胃癌整體療效仍未得到明顯改善。究其原因可能在于：①早期診斷率低，大多數(shù)患者確診時已處于晚期，喪失了手術(shù)根治機(jī)會［1］；② 長療程、大劑量的細(xì)胞毒性藥物治療導(dǎo)致的不良反應(yīng)難以耐受，并由此導(dǎo)致治療中斷、治療減量和治療延遲［2］；③亟待建立更為有效的全程管理的多學(xué)科綜合治療模式；④ 在不斷研發(fā)新藥的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步優(yōu)化現(xiàn)有細(xì)胞毒性藥物的臨床應(yīng)用模式，以保障療效和減少毒性。化療仍是目前大多數(shù)進(jìn)展期胃癌患者的主要治療手段，常規(guī)的胃癌化療給藥模式是大劑量、間隔給藥，采用此類模式的主要原因是藥物毒性使患者難以接受持續(xù)性治療，而化療間歇期可能也給腫瘤細(xì)胞帶來喘息機(jī)會并導(dǎo)致耐藥。世界衛(wèi)生組織已將惡性腫瘤定義為慢性疾病，但目前的大劑量、間隔性給予化療藥物的模式，顯然已不適應(yīng)“慢性疾病”的治療需求。

節(jié)拍化療是通過相對低劑量、高頻度、持續(xù)應(yīng)用細(xì)胞毒藥物的給藥方式，使藥物能夠長時間維持在相對較低、有效的血藥濃度，以達(dá)到延長疾病控制時間，同時降低不良反應(yīng)的目的。經(jīng)20余年的反復(fù)探索與改進(jìn)，多個臨床研究已證實(shí)其在腫瘤治療中的作用，且因其給藥方便（口服為主）、不良反應(yīng)輕、療效不減及不易耐藥等優(yōu)點(diǎn)，逐漸成為老年腫瘤患者或晚期腫瘤患者維持治療的首選［3］。已有研究［4-6］證實(shí)，節(jié)拍化療主要通過抗血管生成發(fā)揮抑瘤效應(yīng)，本課題組前期通過胃癌［7］和結(jié)腸癌［8］裸小鼠模型也驗(yàn)證了這一理論。就臨床實(shí)踐而言，針對不同瘤種、不同作用機(jī)制藥物的節(jié)拍化療給藥模式等，以及除抑制腫瘤增殖及調(diào)控血管生成外，節(jié)拍給藥抑制腫瘤的其他作用機(jī)制尚有待深入研究。有鑒于此，本研究通過建立胃癌裸小鼠模型，以5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）為研究藥物，以優(yōu)化節(jié)拍化療的不同給藥頻率和模式為目的，采用多種分子生物學(xué)技術(shù)手段，探索5-FU對裸小鼠胃癌的最佳節(jié)拍化療模式及相關(guān)作用機(jī)制，進(jìn)而探索最佳的胃癌節(jié)拍化療模式，為進(jìn)一步推動節(jié)拍化療的臨床實(shí)踐提供支持?jǐn)?shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

人SGC-7901胃癌細(xì)胞系購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫，使用含10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)；4～6周齡雌性BALB/c裸小鼠12只［無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級］，體重18～20 g，購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院上海實(shí)驗(yàn)動物中心，動物實(shí)驗(yàn)經(jīng)過上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院倫理委員會批準(zhǔn)；5-FU（0.25 g/10 mL）購自上海旭東海普藥業(yè)有限公司；酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒購自美國R&D公司；CD117、Flk-1及Sca-1單抗購自美國eBioscience公司；膠原酶、脫氧核糖核酸酶Ⅰ和透明質(zhì)酸酶購自美國Sigma公司；B細(xì)胞（CD45+CD11b+）、自然殺傷（natural killer，NK）細(xì)胞（CD49B+NK1.1+）、腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumor-associated macrophage，TAM）（F4_80+CD86+、F4_80+CD206+）和髓源性抑制細(xì)胞（myeloid-derived suppressor cell，MDSC）（Ly6C+Ly6G+）流式細(xì)胞術(shù)檢測抗體購自美國BD公司；CD11c、CD163抗體購自英國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 胃癌裸小鼠移植瘤模型建立

將處于對數(shù)生長期的SGC-7901胃癌細(xì)胞株調(diào)整至（2～3）h 107/mL的濃度，于每只BALB/c裸小鼠的右前肢腋下皮下接種0.2 mL。

待移植瘤體積達(dá)到約200 mm3時，將12只裸小鼠隨機(jī)分成4組：最大耐受劑量（maximum tolerated dose，MTD）組（52.5 mg/kg，每周給藥2次，連續(xù)2周，停1周）、每日節(jié)拍化療（daily metronomic chemotherapy，MET-qd）組（10 mg/kg，每天1次，連續(xù)6周）、隔日節(jié)拍化療（every other day metronomic chemotherapy，MET-qod）組（20 mg/kg，隔日1次，連續(xù)6周）和每周2次節(jié)拍化療（twice-weekly metronomic chemotherapy，MET-biw）組（30 mg/kg，隔2 d給藥1次，連續(xù)6周）。以每21天為1個療程，共2個療程。具體實(shí)驗(yàn)分組及給藥方法見圖1。開始用藥后每周測量裸小鼠體重、腫瘤最大徑（a）和與之相垂直的橫徑（b），腫瘤體積按照公式V（mm3）=1/2ab2計(jì)算，繪制腫瘤生長曲線。

圖1 裸小鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)分組及給藥模式圖Fig.1 Experimental groups and administration methods of xenograft tumor in BALB/c nude mice

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測

外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞（circulating endothelial progenitors，CEP）數(shù)量檢測：6周后處死裸小鼠，眼眶取血，每只取100 μL外周全血，按照實(shí)驗(yàn)分組，每只裸小鼠均取100μL外周全血至流式管中，加入相應(yīng)量的CD117、Flk-1、Sca-1單抗，MTD組加入混合血清，再加入同型陰性對照抗體，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測各組CEP數(shù)。

脾臟和瘤體內(nèi)浸潤的免疫細(xì)胞檢測：6周后處死裸小鼠，取脾臟及瘤體，用生理鹽水沖凈后，分別加入膠原酶、脫氧核糖核酸酶Ⅰ和透明質(zhì)酸酶，在搖床上37 ℃消化1～2 h，70 mm過濾器過濾消化液，制備成單細(xì)胞懸液，加入B細(xì)胞（CD45+CD11b+）、NK細(xì)胞（CD49B+NK1.1+）、TAM（F4_80+CD86+、F4_80+CD206+）和MDSC（Ly6C+Ly6G+）相對應(yīng)的抗體，上流式細(xì)胞儀檢測各組相應(yīng)的免疫細(xì)胞量。

1.2.4 ELISA檢測

收集裸小鼠外周血，12000×g離心10 min后留取血漿，按ELISA操作說明書，分別檢測各組血漿標(biāo)本的血管生成相關(guān)因子 ［血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和血小板源性生長因子（platelet derived growth factor，PDGF）］、M1型TAM細(xì)胞因子 ［白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-12］和M2型TAM細(xì)胞因子（IL-10）等。

1.2.5 免疫組織化學(xué)染色

①蘇華、徐新宇：《英國藥業(yè)反壟斷執(zhí)法經(jīng)驗(yàn)借鑒(二):輝瑞案的再思考》，載《中國價(jià)格監(jiān)管與反壟斷》2017年第1期。

用藥6周后處死裸小鼠，將剝離的瘤體組織常溫下以10%中性甲醛溶液固定24 h，常溫石蠟包埋后4 μm連續(xù)切片，使用CD11c（1∶100）和CD163（1∶200）一抗溫育，在光學(xué)顯微鏡下每張玻片隨機(jī)選取5個視野拍照。使用Image-Pro軟件對染色強(qiáng)度及密度進(jìn)行半定量分析（表 1）。

表1 免疫組織化學(xué)染色半定量分析法Tab.1 Immunohistochemical staining for semi-quantitative analysis

1.2.6 不良反應(yīng)評價(jià)

一般狀況：用藥后每周觀察裸小鼠飲食、活力、精神狀態(tài)并測量體重。

血液學(xué)毒性：6周后處死裸小鼠時眼眶取血，行血細(xì)胞計(jì)數(shù)。

臟器毒性：6周后處死裸小鼠，留取肺、肝、心和腎臟組織進(jìn)行H-E染色，由2名病理科醫(yī)師獨(dú)立進(jìn)行切片、讀片和評判。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，描述性數(shù)據(jù)采用xfs表示，組間差異比較采用單因素方差分析（ANOVA），兩兩比較平均次數(shù)采用Tamhane’sT2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 低劑量5-FU MET-qod可達(dá)最佳抑瘤效應(yīng)

在各用藥組中，MET-qod 組裸小鼠移植瘤從給藥第5 周開始，生長速度明顯慢于MTD組［（1211.57f 132.47）mm3vs（1402.29f 105.33）mm3，P=0.041］，至第6周時兩組差距進(jìn)一步增大［（1567.30f 157.28）mm3vs（1789.81f 116.75）mm3，P=0.036）］，且兩組瘤重差異明顯［（1.09f 0.25）gvs（1.62f 0.13）g，P=0.038，圖2］。其他各組之間，無論是腫瘤生長趨勢還是瘤重均未見明顯差異。

圖2 低劑量5-FU MET-qod節(jié)拍化療抑制裸小鼠移植瘤生長Fig.2 Low dose 5-FU MET-qod metronomic chemotherapy inhibits the growth of xenograft tumors in BALB/c nude mice

2.2 5-FU節(jié)拍化療通過減少腫瘤血管生成抑制腫瘤

為探索5-FU不同節(jié)拍化療模式對腫瘤血管生成的影響，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測各藥物處理組裸小鼠外周血CEP。與MTD組（45.3f 4.3%）相比，節(jié)拍化療可顯著減低外周血C E P（P＜0.001），但3種節(jié)拍化療模式間則無顯著差異（MET-qd組為14.8f 3.8%，MET-qod組為19.9f 6.2%，MET-biw組為17.8f 3.9%，圖3A、3B）。進(jìn)一步通過ELISA檢測外周血VEGF和PDGF濃度，結(jié)果顯示，節(jié)拍化療組VEGF濃度明顯低于MTD組（228.36f 9.97 pg/mL，P＜0.001，圖3C、3D），但MET-qod組的VEGF濃度（63.39f 4.21pg/mL）下降并不顯著；MTD組與MET-qod組的PDGF濃度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。以上結(jié)果提示，抑制血管生成參與了5-FU節(jié)拍化療的抗腫瘤效應(yīng)。

圖3 血管生成參與5-FU節(jié)拍化療的抗腫瘤作用Fig.3 Angiogenesis participates in the antitumor effect of 5-FU metronome chemotherapy

2.3 TAM極化參與5-FU節(jié)拍化療的抗腫瘤作用

為探索節(jié)拍化療對腫瘤免疫微環(huán)境的影響，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測裸小鼠脾臟和移植瘤體內(nèi)浸潤的免疫細(xì)胞。結(jié)果顯示，與MTD組相比，MET-qod組脾臟和瘤體內(nèi)浸潤的TAM極化（M1∶M2）差異明顯，抑制腫瘤生長的M1型TAM的比例明顯升高（脾臟：1.78f 0.21vs1.19f 0.07；瘤體：0.57f 0.11vs0.14f 0.09；P＜0.001，圖4A、4B）。各組間的B細(xì)胞、NK細(xì)胞和MDSC等其他免疫細(xì)胞數(shù)量無顯著差異。

外周血TAM極化相關(guān)趨化因子檢測結(jié)果顯示，MET-qod組的M1型TAM細(xì)胞因子IL-12明顯高于MTD組（45.62f 0.95vs35.55f 1.50，P=0.031），而M2型TAM細(xì)胞因子IL-10數(shù)量則明顯減少（12.56f 1.52vs32.03f 0.89，P＜0.001，圖4C、4D）。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，MET-qod組裸小鼠移植瘤內(nèi)M1型TAM標(biāo)志物CD11c的表達(dá)明顯增多，而M2型TAM標(biāo)志物CD163的表達(dá)較其它組減少（圖4E）。以上結(jié)果提示，MET-qod組瘤體內(nèi)浸潤的TAM以抑癌的M1型為主，可協(xié)同5-FU的抑制腫瘤生長效應(yīng)。

圖4 TAM的極化參與5-FU節(jié)拍化療的抗腫瘤效應(yīng)Fig.4 Polarization of TAM is involved in the antitumor effect of 5-FU metronomic chemotherapy

2.4 接受5-FU節(jié)拍化療裸小鼠耐受性良好

為評估不同藥物處理方式對裸小鼠的毒性，在處死裸小鼠時同步收集肺、肝、心、腎和外周血進(jìn)行H-E染色和細(xì)胞計(jì)數(shù)，結(jié)合裸小鼠體重動態(tài)監(jiān)測，結(jié)果顯示，各組裸小鼠體重變化無明顯差異（圖5A）。節(jié)拍化療組的血液學(xué)毒性明顯輕于MTD組（圖5B），白細(xì)胞計(jì)數(shù)在MTD和MET-qod組中分別為（6.3f 0.89）h 103/μL和（21.7f 1.21）h 103/μL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），血小板計(jì)數(shù)分別為（304f 11.5）h 103/μL和（1044f 12.87）h 103/μL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。H-E染色發(fā)現(xiàn)MTD組裸小鼠肺組織表現(xiàn)為慢性炎癥和間質(zhì)增厚（圖5C），而節(jié)拍化療模式處理各組裸小鼠的肝、心和腎臟組織無明顯改變，且組間無差異（圖5D～5F）。

圖5 5-FU節(jié)拍化療裸小鼠耐受性良好Fig.5 5-FU metronomic chemotherapy was well tolerated in mice

3 討論

本課題組前期研究［7］結(jié)果顯示，氟尿嘧啶類藥物節(jié)拍化療可通過抗腫瘤血管生成抑制胃癌細(xì)胞體內(nèi)外的增殖。本研究再次驗(yàn)證了以上現(xiàn)象，除抑制腫瘤血管生成參與5-FU節(jié)拍化療的抗腫瘤作用外，免疫激活也作為重要環(huán)節(jié)參與其中。隨著免疫治療的快速發(fā)展，已有若干研究證實(shí)節(jié)拍化療與免疫細(xì)胞之間的相互作用。Ghiringhelli等［9］報(bào)道，單劑量環(huán)磷酰胺節(jié)拍化療可導(dǎo)致CD4/CD25調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的耗損。在3LL細(xì)胞的Lewis腫瘤模型中，低劑量紫杉醇通過下調(diào)Bcl-2選擇性抑制調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量和功能，而不影響效應(yīng)T細(xì)胞［10］。環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)生化性復(fù)發(fā)前列腺癌患者的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞減少和前列腺特異性抗原（prostate-specific antigen，PSA）特異性T細(xì)胞活化［11］。奧沙利鉑節(jié)拍化療通過誘導(dǎo)鈣網(wǎng)蛋白的表達(dá)和HMGB1的釋放刺激結(jié)腸癌細(xì)胞的免疫原性細(xì)胞死亡［12］。節(jié)拍療法靶向PARP-1調(diào)節(jié)MDSC的抑制功能，增強(qiáng)程序性死亡［蛋白］-1（programmed death-1，PD-1）抗體免疫治療結(jié)腸癌［13］。低劑量環(huán)磷酰胺可消耗惡性胸膜間皮瘤患者循環(huán)na?ve T細(xì)胞，激活調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，協(xié)同以樹突狀細(xì)胞為基礎(chǔ)的免疫治療［14］。

本研究建立胃癌裸小鼠皮下移植瘤模型，通過流式細(xì)胞術(shù)、ELISA和免疫組織化學(xué)等，發(fā)現(xiàn)TAM的極化參與了5-FU MET-qod節(jié)拍化療的抗腫瘤作用。與MTD組相比，MET-qod組裸小鼠無論是外周還是瘤體內(nèi)殺傷腫瘤細(xì)胞的M1型TAM比例均明顯升高。目前關(guān)于節(jié)拍化療與TAM在腫瘤中的研究較少，僅在三陰性乳腺癌小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，新型唑來膦酸脂質(zhì)體可消耗瘤體內(nèi)TAM，從而提高其抗腫瘤作用［15］。本研究結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了TAM參與節(jié)拍化療的抗腫瘤作用機(jī)制。

5-FU屬于抗代謝類化療藥物，半衰期極短，因此經(jīng)典給藥方法是長時間靜脈持續(xù)輸注，主要不良反應(yīng)為胃腸道反應(yīng)和骨髓抑制。本研究發(fā)現(xiàn)，5-FU節(jié)拍化療組小鼠體重?zé)o明顯降低，且血液學(xué)毒性明顯低于MTD組。H-E染色發(fā)現(xiàn)，MTD組裸小鼠肺間質(zhì)增厚，呈慢性炎癥表現(xiàn)，而節(jié)拍化療組裸小鼠的重要臟器功能均無明顯改變。以上結(jié)果提示，在給藥總劑量相同的情況下，改變給藥策略可在保證療效的前提下顯著減輕不良反應(yīng)，若可轉(zhuǎn)化應(yīng)用于臨床，有望更好地保護(hù)癌癥患者的重要臟器功能。

改良傳統(tǒng)化療藥物的給藥模式，是在目前胃癌等實(shí)體瘤的有效藥物數(shù)量有限前提下的有益探索，以克服耐藥、減輕不良反應(yīng)。節(jié)拍化療是在不延長治療間隔時間的情況下，以相對較低且毒性較小的劑量、較高頻次來給予化療藥物［16］。目前，節(jié)拍化療在胃癌中顯示出良好的應(yīng)用前景。對老年晚期胃癌患者采用口服氟尿嘧啶類藥物（卡培他濱）節(jié)拍化療（1000 mg/d，第1～28天，每5周1次）耐受性良好，且有效率不低于傳統(tǒng)MTD給藥［17］。每周紫杉醇節(jié)拍化療（80～100 mg/m2）可使晚期或復(fù)發(fā)的胃食管惡性腫瘤患者生存獲益［18］。低劑量卡培他濱節(jié)拍給藥（1100 mg/m2/d）聯(lián)合阿柏西普對于難治性胃癌患者較MTD卡培他濱聯(lián)合阿柏西普的客觀緩解率明顯增加（15.4%vs7.7%）［19］。

節(jié)拍化療現(xiàn)已成為晚期或難治性腫瘤的有效治療策略。當(dāng)腫瘤治療進(jìn)入精準(zhǔn)治療時代，節(jié)拍化療如何實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)治療尚有待探索。就氟尿嘧啶等時間依賴性藥物而言，有效藥物濃度的暴露時間遠(yuǎn)比根據(jù)體表面積或體重計(jì)算出的劑量重要，而目前如何精準(zhǔn)把握節(jié)拍化療的給藥節(jié)拍尚處于探索階段?；谝陨吓R床治療難點(diǎn)，本研究對胃癌移植瘤裸小鼠模型采用相同總劑量、不同5-FU節(jié)拍給藥模式，初步探索不同治療模式的抗腫瘤作用。結(jié)果顯示，在給藥劑量相同的情況下，改變給藥節(jié)拍可達(dá)到最佳抗腫瘤效應(yīng)，5-FU METqod模式可明顯抑制裸小鼠胃癌移植瘤生長。

癌細(xì)胞的生長具有周期性，因此臨床給藥充分利用其周期性特點(diǎn)擇時（每2～3周）給藥可以達(dá)到最佳抗腫瘤作用。節(jié)拍化療的抗腫瘤作用并不是針對癌細(xì)胞，而是針對血管內(nèi)皮細(xì)胞和（或）免疫間質(zhì)細(xì)胞，因此其給藥節(jié)拍與常規(guī)給藥截然不同。目前節(jié)拍化療給藥節(jié)拍的確定尚缺少相關(guān)研究。本研究在裸小鼠胃癌移植瘤模型上發(fā)現(xiàn)，低劑量5-FU MET-qod具有最佳的抑瘤作用，但其抑制血管的效應(yīng)并不是最強(qiáng)，可能與該給藥節(jié)拍能更好地抑制TAM由M1向M2的轉(zhuǎn)化有關(guān)。

綜上所述，5-FU MET-qod可達(dá)到最佳的抑制胃癌裸小鼠移植瘤生長的作用，且耐受性良好，其作用機(jī)制一方面通過抗腫瘤血管生成，另一方面通過調(diào)節(jié)TAM的極化。上述結(jié)果可能有助于設(shè)計(jì)相關(guān)臨床研究，以探索氟尿嘧啶類藥物的最佳抗腫瘤給藥模式，提升胃癌總體療效，以及進(jìn)一步提高患者的生活質(zhì)量。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。