冬小麥品種(系)品質(zhì)相關(guān)基因的分子標(biāo)記檢測

昝香存，?，摤摚n留鵬，高 崇，趙明忠，董海濱，齊學(xué)禮，王永霞，胡 琳

(河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物分子育種研究院/河南省小麥生物學(xué)重點實驗室/河南省麥類種質(zhì)資源創(chuàng)新與改良重點實驗室，河南鄭州 450002)

面條是中國傳統(tǒng)主食之一，其品質(zhì)主要受冬小麥蛋白質(zhì)含量、面筋強度、面粉色澤、多酚氧化酶(PPO)活性、淀粉特性以及1BL·1RS易位的影響。其中，小麥的面筋強度主要受高分子量谷蛋白亞基、1B/1R易位等因素的影響。位點上的5+10亞基以及位點上的7+8亞基對面筋強度影響較大，利用Dx5和By8標(biāo)記可準(zhǔn)確快速地檢測小麥品種中是否含有5+l0和7+8優(yōu)質(zhì)亞基。1BL·1RS易位在中國小麥育種中廣泛應(yīng)用，但1BL·1RS易位易導(dǎo)致面筋強度減弱，對面條加工品質(zhì)的負(fù)面效應(yīng)明顯，利用H2O分子標(biāo)記可快速、準(zhǔn)確地檢測1BL·1RS易位的存在。

黃色素含量和PPO活性是影響面制品色澤及其穩(wěn)定性的主要因素。其中，黃色素含量受多個基因位點的調(diào)控，其中位于第七部分同源群上的QTL效應(yīng)最大。He等開發(fā)了黃色素含量基因標(biāo)記YP7A和YP7B，利用前者可有效區(qū)分小麥7A染色體上基因的等位變異(與高黃色素含量相關(guān))和(與低黃色素含量相關(guān))，利用后者可有效區(qū)分小麥7B染色體上位點的等位變異(與中等黃色素含量相關(guān))和(與低黃色素含量相關(guān))、(與高黃色素含量相關(guān))。蘆 靜等研究發(fā)現(xiàn)，用YP7A標(biāo)記檢測出的等位變異和與黃色素含量顯著相關(guān)，而用YP7B標(biāo)記檢測出的等位變異和與黃色素含量沒有表現(xiàn)出顯著相關(guān)，因而，YP7A標(biāo)記可作為黃色素含量的輔助選擇標(biāo)記。PPO活性是引起面制品顏色褐變的主要因素，其受環(huán)境和基因型的共同影響，但基因型是其主要的影響因素。控制PPO活性的主效基因位于2AL和2DL染色體上，位于2AL染色體上基因的效應(yīng)明顯大于位于2DL染色體上的基因。利用Sun等開發(fā)的共顯性STS標(biāo)記PPO18可有效區(qū)分2AL染色體上基因的等位變異和。

分子標(biāo)記輔助選擇是品質(zhì)遺傳改良的有效途徑。胡鳳靈等利用、、、、 1BL·1RS、和基因的特異性分子標(biāo)記對221份中國冬小麥品種(系)進行檢測，明確了高分子量麥谷蛋白亞基(HMW-GS)、低分子量麥谷蛋白亞基(LMW-GS)相關(guān)基因的等位變異以及1BL·1RS易位的分布頻率。胡鳳靈等和楊芳萍等利用分子標(biāo)記YP7A分別檢測了基因的等位變異在冬小麥品種(系)中的分布頻率。肖永貴等利用基因的功能標(biāo)記PPO18、PPO29和PPO16檢測311份中國冬小麥品種，發(fā)現(xiàn)中國冬麥區(qū)低PPO活性基因和的分布頻率相對較高，分別為58.2%和59.8%。定期利用分子標(biāo)記檢測育成品種(系)中品質(zhì)相關(guān)基因的分布情況，可為品質(zhì)育種研究和親本選配提供有價值的信息，加快小麥品質(zhì)改良的步伐。本研究利用Dx5、By8、YP7A、PPO18和H2O特異性分子標(biāo)記，對2010年以來中國冬小麥主產(chǎn)省份育成的266份小麥品種(系)進行檢測，了解10年來育成小麥品種(系)的面筋強度、PPO活性、黃色素含量及1BL·1RS易位相關(guān)基因的分布情況，以期為優(yōu)質(zhì)面條小麥新品種選育和選配具有優(yōu)質(zhì)基因或聚合一定優(yōu)質(zhì)基因的親本提供重要信息。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料共266份，其中河南166份、安徽15份、江蘇16份、陜西14份、山東23份、河北20份，北京12份(表1)，于2019年秋種植在河南省農(nóng)科院試驗基地。供試材料大部分為2010年以后審定的品種(系)，少部分為正在參加各類區(qū)域試驗的新品系及自主選育的高代品系。

表1 266份冬小麥品種(系)品質(zhì)相關(guān)基因的分子標(biāo)記檢測結(jié)果Table 1 Identification of quality-related genes in 266 winter wheat cultivars(lines) using molecular markers

(續(xù)表2 Continued table 2)

(續(xù)表2 Continued table 2)

1.2 基因組DNA的提取

于小麥越冬期進行田間葉片取樣。用CTAB法提取植株葉片的基因組DNA。用NanoDrop紫外分光光度計檢測DNA的濃度，稀釋為40～60 ng·μL后，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 分子標(biāo)記的檢測

Dx5、By8、H2O、YP7A和PPO18標(biāo)記的引物序列及其他相關(guān)信息見表2。PCR反應(yīng)體系均為10 μL，包括上、下游引物(20 mmol·L)各0.2 μL，PCR Mix 5 μL，DNA模板(50 ng·μL)1 μL，用ddHO補足至10 μL。Dx5、By8、H2O、PPO18和YP7A標(biāo)記的PCR擴增程序參考相應(yīng)的文獻(xiàn)。所有引物均由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。PCR產(chǎn)物經(jīng)2.0%瓊脂糖凝膠電泳后，利用凝膠成像系統(tǒng)拍照分析。

表2 檢測目標(biāo)基因等位變異所用的標(biāo)記及其引物信息Table 1 Markers and primers information for detecting alleles of the target genes

2 結(jié)果與分析

2.1 Dx5基因的分子標(biāo)記檢測結(jié)果

用標(biāo)記Dx5對供試材料的基因進行檢測，部分材料的檢測結(jié)果如圖1A所示。266份材料中，有85份可擴增出450 bp的特異性片段，說明這85份材料中含有基因，分布頻率為 32.0%(表1和表3)。基因在不同小麥主產(chǎn)省份品種(系)中的分布頻率存在較大差異，分布頻率從高到低依次為山東(60.9%)>河北 (45.0%)>江蘇(37.5%)>陜西(28.6%)>河南 (27.7%)>北京(25.0%)>安徽(20.0%)(表3)。

2.2 By8基因的分子標(biāo)記檢測結(jié)果

用標(biāo)記By8對供試材料的基因進行檢測，部分材料的檢測結(jié)果如圖1B所示。266份材料中，有77份材料可以擴增出527 bp的特異性片段，說明這77份材料含有基因，分布頻率為28.9%。基因在不同小麥主產(chǎn)省份品種(系)中的分布頻率從高到低依次為山東(65.2%)>河北 (45.0%)>江蘇(31.3%)>北京 (25.0%)>陜西 (21.4%)>河南(24.1%)>安徽(13.3%)(表3)。

2.3 1BL·1RS易位的分子標(biāo)記檢測結(jié)果

用標(biāo)記H2O對供試材料的1BL·1RS易位進行檢測，部分材料的檢測結(jié)果如圖1C所示。266份材料中，有122份材料可擴增出1 598 bp的特征條帶，說明這122份材料含有1BL·1RS易位，分布頻率為45.9%，而其他144份材料不含1BL·1RS易位。1BL·1RS易位在不同小麥主產(chǎn)省份品種(系)中的分布頻率不同，分布頻率從高到低依次為江蘇(81.3%)>河南(57.2%)>陜西(35.7%)>安徽(20.0%)>河北(15.0%)>山東(8.7%)>北京(8.3%)(表3)。

2.4 Ppo-A1基因的分子標(biāo)記檢測結(jié)果

用共顯性標(biāo)記PPO18對供試材料的基因進行檢測，部分材料的檢測結(jié)果如圖1D所示。266份材料中，有144份材料可擴增出685 bp的特征條帶，說明這144份材料含有高PPO活性等位基因，分布頻率為54.1%；有122份材料可擴增出876 bp的特征條帶，說明這122份材料含有低PPO活性等位基因，分布頻率為45.9%。和等位基因在不同小麥主產(chǎn)省份品種(系)中的分布頻率存在較大差異，其中，的分布頻率從高到低依次為山東(95.7%)>北京(83.3%)>河北(75.0%)>陜西(42.9%)>江蘇 (37.5%)>安徽(40.0)>河南(34.3%)，在不同小麥主產(chǎn)省份的分布頻率高低排序則相反(表3)。

A：標(biāo)記Dx5的PCR擴增結(jié)果；B：標(biāo)記By8的PCR擴增結(jié)果；C：標(biāo)記H2O的PCR擴增結(jié)果；D：標(biāo)記PPO18的PCR擴增結(jié)果。M：DL2000；1：徐麥15158；2：囤麥259；3：鄭麥1833；4：新麥45；5：西農(nóng)529；6：洛麥40；7：偉隆169；8：鄭麥0943；9：鄭麥379；10：華麥2801；11：豐德存麥21；12：石優(yōu)4399；13：濟麥38。圖2同。

2.5 Psy-A1基因的分子標(biāo)記檢測結(jié)果

用共顯性標(biāo)記YP7A對供試材料的基因進行檢測，部分材料的檢測結(jié)果如圖2所示。266份材料中，有203份材料可擴增出194 bp的特征條帶，說明這203份材料含有高黃色素含量等位基因，分布頻率為76.3%；有63份材料可擴增出231 bp的特征條帶，說明這63份材料含有低黃色素含量等位基因，分布頻率為23.7%。和等位基因在不同小麥主產(chǎn)省份品種(系)中的分布頻率存在較大差異， 其中，的分布頻率從高到低依次為山東(100.0%)>北京(83.3%)>河北 (80.0%)>河南(77.1%)>安徽(66.7)>江蘇 (56.3%)>陜西(50.0%)，在不同小麥主產(chǎn)省份品種(系)中的分布頻率高低排序則相反(表3)。

表3 品質(zhì)相關(guān)基因等位變異和1B/1R易位在不同小麥主產(chǎn)省份的分布頻率Table 3 Distribution frequencies of alleles and 1B/1R translocation of quality-related genes in major wheat producing provinces

圖2 標(biāo)記YP7A對部分小麥品種(系)的PCR檢測結(jié)果

2.6 聚合優(yōu)質(zhì)等位基因材料的分布

由表4可知，在266份材料中，聚合多種優(yōu)質(zhì)基因的品種(系)較少，其中攜帶///基因組合且不含1BL·1RS易位的材料僅有2份，分布頻率為0.8%，分別為藁優(yōu)5766和鄭石9170；攜帶///基因組合且不含1BL·1RS易位的材料有23份，分布頻率為8.7%。其中，來自河南的有8份，來自山東的有8份，來自河北和北京的分別有6份；攜帶//基因組合但含1BL·1RS易位的材料有12份，分布頻率為4.5%。

表4 聚合品質(zhì)性狀優(yōu)異等位基因的小麥品種(系)Table 4 Cultivars(lines) with excellent gene combinations for quality traits

3 討 論

3.1 Dx5、 By8基因和1BL·1RS易位在品質(zhì)育種中的應(yīng)用

面筋強度是影響面條品質(zhì)的主要因素之一。和對面筋強度的貢獻(xiàn)比較大。本研究檢測的266份小麥品種(系)中，和的分布頻率分別為32.3%和28.9%，與胡鳳靈等的研究結(jié)果相比，的分布頻率稍有上升，的分布頻率略有下降。和在不同小麥主產(chǎn)省份品種(系)中的分布頻率差異均較大，在山東、河北品種(系)中的分布頻率相對較高，分別為60.9%和65.2%、45.0%和45.0%，說明近10年來山東和河北在小麥品質(zhì)育種中注重優(yōu)質(zhì)亞基基因和的應(yīng)用和 選擇。

1BL·1RS易位對面筋強度有負(fù)面影響，但1BL·1RS易位系在抗病、豐產(chǎn)、耐旱以及花后葉片保持綠色等方面具有明顯的優(yōu)勢，備受育種家的青睞。因此，1BL·1RS易位在中國乃至世界范圍內(nèi)被廣泛利用。本研究檢測的266份小麥品種(系)中，含有1BL·1RS易位的品種(系)占供試材料的 45.9%，與前人的研究結(jié)果相比，呈增加趨勢，說明近10年來 1BL·1RS易位系在中國小麥育種中仍被廣泛應(yīng)用。本研究結(jié)果表明， 1BL·1RS易位品種(系)在不同小麥主產(chǎn)省份品種(系)中的分布頻率存在較大差異，其中江蘇和河南的材料中1BL·1RS易位的分布頻率較高，而在河北、山東和北京的材料中分布頻率較低，這可能與本研究收集的材料有關(guān)，也可能與育種家選用的親本材料或在選育過程中注重的選擇目標(biāo)有關(guān)。對于河南來說，1BL·1RS易位出現(xiàn)的頻率較高，其主要原因可能是河南為中國糧食生產(chǎn)核心區(qū)，是國家的糧倉，承擔(dān)著保障國家糧食安全的重?fù)?dān)，在產(chǎn)量壓力選擇下，1BL·1RS易位系作為育種親本應(yīng)用較多，并在后代選擇中注重抗病性、豐產(chǎn)性和抗逆性的綜合考慮，所以在河南選育的小麥品種(系)中，1BL·1RS易位系出現(xiàn)的頻率較高。

在未來小麥品質(zhì)改良方面，選育強筋小麥品種時一方面可選用不含1BL·1RS易位的親本材料，另一方面應(yīng)從改良1BL·1RS易位系的品質(zhì)入手。本研究篩選出12份聚合//基因的易位系材料，這為1BL·1RS易位系的品質(zhì)改良提供了研究材料。

3.2 YP7A、PPO18標(biāo)記在品質(zhì)育種中的應(yīng)用

面制品色澤是面條小麥育種的主要目標(biāo)之一。用基因特異性標(biāo)記能快速鑒定品質(zhì)性狀的基因型，為育種提供簡單易行的鑒定方法。本研究利用YP7A標(biāo)記檢測基因在266份冬小麥品種(系)中的等位變異，結(jié)果表明，含有和的品種(系)分別占供試材料的75.9%和24.1%，這與楊芳萍等的研究結(jié)果一致，均為的分布頻率遠(yuǎn)高于。和在不同小麥主產(chǎn)省份品種(系)中的分布頻率差異較大，其中和在陜西品種(系)中的分布頻率均為50.0%，這與張影全等的研究結(jié)果一致；在北京品種(系)中的分布頻率為83.3%，與楊芳萍等的研究結(jié)果(75.0%)相比，呈增長趨勢；此外，在山東和河北品種(系)中的分布頻率也很高，尤其是山東23份材料中全部含有。原因可能與育種家選用的親本材料基因型有關(guān)，也可能與人們對營養(yǎng)品質(zhì)的需求增加，導(dǎo)致育種家對的定向選擇有關(guān)。

小麥籽粒PPO催化褐變反應(yīng)，導(dǎo)致面條感官品質(zhì)和營養(yǎng)價值下降，選育低PPO活性小麥品種(系)也是面條小麥品質(zhì)改良的重要目標(biāo)之一。本研究用PPO18標(biāo)記對供試材料進行檢測，發(fā)現(xiàn)266份材料中含有的品種(系)占全部供試材料的45.5%，這與王黎明等的結(jié)果 (48.5%)基本一致，而與肖永貴等(58.2%)和胡鳳靈等(53.8%)的研究結(jié)果相比，的分布頻率有所降低。出現(xiàn)這種差異的原因可能在于供試材料的來源及構(gòu)成不同。本研究還發(fā)現(xiàn)，和在不同小麥主產(chǎn)省份品種(系)中的分布頻率存在明顯差異，與低PPO活性相關(guān)的在山東、北京和河北品種(系)的分布頻率較高，而河南和江蘇品種(系)的分布頻率較低，這與育種家所選用的親本材料有關(guān)，以及長期選擇過程中對小麥品種PPO活性選擇的重視程度不同，導(dǎo)致不同省份之間存在較大的差異，因此，河南和江蘇小麥育種工作者應(yīng)加大低PPO活性小麥品種(系)選擇的力度。

4 結(jié) 論

明確了近10年來小麥主要生產(chǎn)省份新育成品種(系)中、、、基因和1BL·1RS易位的分布情況，并分別篩選到2和23份含有///和///基因組合且均不含 1BL·1RS易位的材料，可作為優(yōu)質(zhì)面條小麥育種的親本材料；篩選到12份含有//基因組合且含有1BL·1RS易位的材料，可作為1BL·1RS易位系品質(zhì)改良的研究 材料。