載單寧酸鐵及二氫卟吩納米粒用于光聲成像及殺傷視網(wǎng)膜母細胞瘤Y79細胞

黃 通，王志剛，杜之渝

(1.重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院眼科，重慶 400010；2.重慶醫(yī)科大學生物醫(yī)學工程學院超聲醫(yī)學工程重點實驗室，3.超聲分子影像學重慶市醫(yī)學重點實驗室，重慶 400010)

視網(wǎng)膜母細胞瘤(retinoblastoma, RB)是低齡兒童最常見眼內(nèi)惡性腫瘤[1-2],存活率較低，且就診患兒多已屬中晚期，僅能通過摘除眼球甚至剜除眼眶內(nèi)容物進行治療[3]。納米材料現(xiàn)已廣泛用于治療各類腫瘤[4]。單寧酸(tannic acid, TA)是源于植被的天然多酚類物質(zhì)，可在水溶液中與FeⅢ配位而迅速形成金屬多酚網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)單寧酸鐵FeⅢTA[5]，后者具有極佳的光聲(photoacoustic, PA)效應(yīng)，能產(chǎn)生穩(wěn)定的PA信號[6]。聚乳酸-羥基乙酸共聚物[poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA]生物相容性優(yōu)異[7]，可包裹第二代光敏劑二氫卟吩e6(chlorin e6, Ce6)，用于熒光標記觀察Y79細胞攝取納米粒[8]。本研究嘗試制備載FeⅢTA/Ce6的新型PLGA納米粒，觀察其用于PA成像及體外殺傷Y79細胞的效果。

1 材料與方法

1.1 主要材料及設(shè)備

1.1.1 材料 雄性裸鼠(北京華阜康生物科技股份有限公司)；人源性RB Y79細胞系(上海佰曄生物科技中心)，人視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium, RPE)細胞(美國ATCC)；PLGA(分子量12 000，乳酸/羥基乙酸聚合比50∶50，山東濟南岱罡生物科技有限公司)，Ce6(美侖生物技術(shù)有限公司)，六水合氯化鐵(FeCl3·6H2O，賽默飛世爾科技有限公司)，單寧酸(tannic acid, TA，美國Sigma-Aldrich公司)，二氯甲烷、異丙醇(重慶川東化工集團)，聚乙烯醇[poly(vinyl alcohol), PVA，美國Sigma-Aldrich公司]，鈣黃綠素(calcein, C-AM)/碘化丙啶(propidium iodide, PI)[日本東仁化學科技(上海)有限公司]，南美胎牛血清(以色列Biological Industries)。

1.1.2 設(shè)備 Sonics&Materials聲振儀，紫外分光光度計UV2600(日本Shimadzu)，磁力攪拌器(上海力辰邦西儀器科技有限公司)，納米粒度儀(美國Brookhaven)；透射電鏡Tecnai G2 F20，掃描電鏡Apreo S HiVac(美國賽默飛)，808 nm激光儀(FC808-2W-MM，西安中川光電科技有限公司)，熱紅外成像儀(Fotric 226，美國Fotric公司)，激光共聚焦顯微鏡(日本Nikon)；PA成像儀(Vevo LAZR，加拿大Visual Sonics公司)，電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀720ES(inductively coupled plasma optical emission spectrometer, ICP-OES，安捷倫科技有限公司)。

1.2 培養(yǎng)Y79細胞 將Y79細胞接種于由RMPI 1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基、20%胎牛血清及1%青霉素-鏈霉素組成的培養(yǎng)基中，置于37℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)。

1.3 制備FeⅢTA/PLGA/Ce6納米粒 采用雙乳化法，將50 mg PLGA溶于2 ml二氯甲烷(CH2Cl2)，加入0.5 ml Ce6溶液(溶于甲醇，5 mg/ml)后置于超聲清洗儀中5 min，使其完全溶解；加入200 μl超純水，以聲振儀振蕩3 min進行第1次乳化，再加入8 ml 4% PVA溶液振蕩3 min進行第2次乳化；加入10 ml 2%異丙醇溶液，以磁力攪拌器攪拌6 h；離心5 min(10 000 r/min)，并以超純水清洗3次，得到PLGA/Ce6納米粒。

取1 ml PLGA/Ce6納米粒(0.5 mg/ml)，依次加入5 μl TA溶液(40 mg/ml)及5 μl FeCl3溶液(10 mg/ml)，置于渦旋儀15 s充分混合均勻，之后離心、洗滌3次，得到FeⅢTA/PLGA/Ce6納米粒，儲存于4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 檢測FeⅢTA/PLGA/Ce6納米?；咎匦?以透射電鏡及掃描電鏡觀察FeⅢTA/PLGA/Ce6納米粒，并以粒度儀檢測粒徑及電位大??；采用紫外分光光度計及ICP-OES分別測量Ce6和FeⅢTA包封率及載藥量。

1.5 檢測FeⅢTA/PLGA/Ce6納米粒體外羥基自由基(·OH) 實驗組：將20 μg亞甲基藍(methylene blue, MB)、1×10-3mol/L H2O2及0.5 mg FeⅢTA/PLGA/Ce6溶于1 ml pH 5.5的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline, PBS)；對照組：將20 μg MB、1×10-3mol/L H2O2溶于1 ml pH 5.5的PBS。將樣品置于搖床并避光，振蕩反應(yīng)15 min(37℃，100 r/min)，以酶標儀檢測其降解程度。

1.6 檢測FeⅢTA/PLGA/Ce6納米粒體外光熱效應(yīng) 分別將PBS及不同濃度(2.00、1.65、1.30、0.95、0.60及0.25 mg/ml)FeⅢTA/PLGA/Ce6 納米粒各200 μl置于96孔板，以808 nm激光(2 W/cm2)輻照10 min，同時采用熱紅外成像儀檢測樣品溫度；取1.65 mg/ml FeⅢTA/PLGA/Ce6納米粒200 μl置于96孔板，以808 nm激光輻照直至溫度達55℃后，關(guān)閉激光冷卻至室溫；重復(fù)進行5次。檢測納米粒光熱穩(wěn)定性，并計算光熱轉(zhuǎn)換效率。

1.7 檢測FeⅢTA/PLGA/Ce6納米粒PA信號 將不同濃度(0.2、0.4、0.6、0.8及1.0 mg/ml)FeⅢTA/PLGA/Ce6納米粒置于凝膠模型中，以PA成像儀檢測其PA信號。將1×106個Y79細胞重懸于100 μl PBS中接種于裸鼠右大腿根部，待腫瘤生長至80 mm3后取5 mg/ml FeⅢTA/PLGA/Ce6納米粒200 μl，經(jīng)尾靜脈注射至荷瘤裸鼠體內(nèi)；分別于注射納米粒前及2、4、6、12 h后采集PA圖像。

1.8 檢測FeⅢTA/PLGA/Ce6納米粒于Y79細胞內(nèi)產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species, ROS)水平 按5×105個/孔將Y79細胞置于12孔板中，分為激光組、FeⅢTA/PLGA/Ce6組、FeⅢTA/PLGA/Ce6+激光組及空白對照組。對FeⅢTA/PLGA/Ce6組及FeⅢTA/PLGA/Ce6+激光組加入1 ml FeⅢTA/PLGA/Ce6納米粒(0.5 mg/ml)孵育12 h，對激光組及空白對照組不做處理；離心后去除廢液，加入ROS熒光探針DCFH-DA染料(DCFH-DA∶培養(yǎng)基為1∶1 000)，避光置于37℃、5% CO2孵箱中孵育20 min；再以808 nm(2 W/cm2)激光輻照激光組及FeⅢTA/PLGA/Ce6納米粒+激光組5 min，對FeⅢTA/PLGA/Ce6組及空白對照組不做處理；離心去除DCFH-DA染料，加入200 μl PBS重懸后避光并送檢。

1.9 檢測FeⅢTA/PLGA/Ce6納米粒體外安全性 按5 000個/孔將RPE細胞置于96孔板中孵育12 h，以PBS清洗3次；分別加入不同濃度(0.062 5、0.125、0.25、0.5、1及2 mg/ml)FeⅢTA/PLGA/Ce6納米粒(重懸于完全培養(yǎng)基)，共孵育24 h，以PBS清洗細胞3次；每孔加入100 μl含10% CCK-8的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，避光孵育45 min。

1.10 流式細胞術(shù)Y79細胞吞噬實驗 按5×105個/孔將Y79細胞置于24孔板中，分別于0.5、1、2、3、4及5 h后于4個孔中加入100 μl FeⅢTA/PLGA/Ce6納米粒(0.5 mg/ml)，之后離心去除廢液，加入200 μl PBS重懸，避光并送檢。

1.11 檢測Y79細胞凋亡 按5×105個/孔將Y79細胞置于12孔板中，對FeⅢTA/PLGA/Ce6組及FeⅢTA/PLGA/Ce6+激光組加入1 ml FeⅢTA/PLGA/Ce6納米粒(0.5 mg/ml)共孵育12 h，之后以808 nm (2 W/cm2)激光輻照激光組及FeⅢTA/PLGA/Ce6納米粒+激光組5 min；對空白對照組不做任何處理。

1.11.1 流式細胞術(shù) 離心去除廢液后加入200 μl PBS并送檢。

1.11.2 激光共聚焦 離心去除廢液后加入200 μl C-AM/PI染色液重懸，避光置于37℃、5% CO2孵箱中孵育15 min；加入PBS，離心去除染料，于共聚焦顯微鏡下觀察。

1.12 統(tǒng)計學分析 采用GraphPad Prism 8.0統(tǒng)計分析軟件。以±s表示符合正態(tài)分布的計量資料，以單因素方差分析行多組間比較，采用LSD-t檢驗進行兩組間比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 納米?；咎匦?透射電鏡示FeⅢTA呈殼狀結(jié)構(gòu)，PLGA及Ce6呈核狀結(jié)構(gòu)，F(xiàn)eⅢTA/PLGA/Ce6納米粒呈較規(guī)則圓形(圖1A)。掃描電鏡示所制納米粒分散性良好(圖1B)，Zeta電位為(-28.32±3.35)mV，粒徑為(297.02±9.59)nm；Ce6包封率為(74.99±2.57)%，載藥量為(4.16±0.15)%；FeⅢTA包封率為(4.92±0.35)%，載藥量為(0.021 88±0.001 57)%(圖1C)。

2.2 納米粒體外·OH 實驗組在664 nm處的特征吸收峰顯著降低，即FeⅢTA/PLGA/Ce6納米粒消耗了MB并成功產(chǎn)生·OH。見圖2。

2.3 納米粒體外光熱效應(yīng) 加入FeⅢTA/PLGA/Ce6納米粒的濃度越高，經(jīng)808 nm激光輻照后樣品升溫幅度越大，且于激光輻照6 min后趨于平穩(wěn)；輻射PBS后溫度未見明顯升高(圖3A、3B)。FeⅢTA/PLGA/Ce6納米粒光熱穩(wěn)定性優(yōu)異(圖3C)，光熱轉(zhuǎn)換率為24.70%(圖3D)。

2.4 納米粒PA信號 體外FeⅢTA/PLGA/Ce6納米粒PA信號強度隨濃度增加而加強，二者呈線性相關(guān)(R2=0.979 5)。將FeⅢTA/PLGA/Ce6納米粒注入荷瘤小鼠后， PA信號隨時間延長而增強(圖4)。

2.5 納米粒于Y79細胞內(nèi)產(chǎn)生ROS水平 激光組、FeⅢTA/PLGA/Ce6組、FeⅢTA/PLGA/Ce6+激光組及空白對照組ROS產(chǎn)量百分比分別為28.01%、55.41%、42.74%及26.57%，見圖5。

2.6 納米粒體外安全性 0.0625、0.125、0.25、0.5、1及2 mg/ml FeⅢTA/PLGA/Ce6納米粒對RPE細胞均無明顯細胞毒性，其中細胞存活率依次為(96.90±0.60)%、(94.84±0.80)%、(93.51±0.96)%、(92.40±0.34)%、(91.14±0.50)%及(87.79±0.49)%。

2.7 Y79細胞吞噬實驗 于Y79細胞中加入FeⅢTA/PLGA/Ce6納米粒后，隨時間延長(0.5、1、2、3、4、5 h)，熒光強度逐漸增強(13.06%、59.98%、79.41%、88.57%、94.86%、99.72%)；見圖6。

2.8 Y79細胞凋亡

2.8.1 流式細胞術(shù) 激光組 [(5.88±2.25)%，圖6A]、FeⅢTA/PLGA/Ce6組[(10.73±1.92)%，圖6B]、FeⅢTA/PLGA/Ce6+激光組[(41.58±5.24)%，圖6C]及空白對照組[(3.40±1.29)%，圖6D]Y79細胞凋亡率差異具有統(tǒng)計學意義(F=99.69，P<0.000 1)；激光組與空白對照組差異無統(tǒng)計學意義(t=1.658，P=0.173)，其余兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。見圖7。

2.8.2 激光共聚焦 激光共聚焦顯微鏡示激光組及空白對照組Y79細胞凋亡均較少，F(xiàn)eⅢTA/PLGA/Ce6組凋亡較多，F(xiàn)eⅢTA/PLGA/Ce6+激光組凋亡最多。見圖8。

3 討論

ROS包括·OH、單線態(tài)氧(singlet oxygen,1O2)及過氧化氫(hydrogen peroxide, H2O2)等，在腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment, TME)中可通過擾亂氧化還原穩(wěn)態(tài)平衡而誘導(dǎo)癌細胞死亡。H2O2是最豐富、最穩(wěn)定的非自由基 ROS[9]。金屬離子介導(dǎo)化學動力療法(chemodynamic therapy, CDT)因特異性高、不良反應(yīng)少[10]而逐漸受到關(guān)注。FeⅢTA納米涂層可在腫瘤弱酸性微環(huán)境中分解， FeⅢ被還原成FeⅡ，繼而通過與H2O2的Fenton反應(yīng)產(chǎn)生對腫瘤細胞劇毒的·OH以誘導(dǎo)其凋亡[11]。已有研究[12]證實，F(xiàn)eⅢTA具有優(yōu)異的光熱轉(zhuǎn)換效率、生物相容性及良好的治療腫瘤效果。

CDT既不需要光源，亦不受局部氧含量影響[13]，但受限于腫瘤內(nèi)H2O2含量；光熱治療(photothermal therapy, PTT)[14]用于RB可彌補CDT的不足。PTT指搭載光熱材料的納米制劑經(jīng)局部激光照射(近紅外光)可使實體瘤內(nèi)溫度升高[15]，以特異性殺傷局部腫瘤組織[16]。納米技術(shù)的不斷發(fā)展，使PTT展現(xiàn)出巨大臨床應(yīng)用潛能。PA成像為新興醫(yī)學成像方法，具有高分辨率及高圖像對比度等優(yōu)點[17]。本課題組前期研究[18]制備的載FeⅢTA和紫杉醇的納米粒可用于RB，但化療藥物毒副作用大，且易產(chǎn)生耐藥性。本研究采用FeⅢ和TA于PLGA/Ce6表面形成致密的FeⅢTA納米涂層，成功制備的FeⅢTA/PLGA/Ce6納米粒的基本特性良好；經(jīng)808 nm激光輻照后的溫度均隨濃度而呈線性增加，體外PA信號與納料粒濃度呈正相關(guān)，且在體PA成像效果顯著，與時間呈正相關(guān)；經(jīng)DCFH-DA探針檢測到該納米粒于Y79細胞內(nèi)產(chǎn)生大量ROS，通過MB檢測證明其為·OH，提示FeⅢTA/PLGA/Ce6納米粒通過CDT途徑產(chǎn)生ROS而殺死Y79細胞，協(xié)同808 nm激光可進一步提高對Y79細胞的殺傷效果；將該納米粒與RPE細胞共孵育24 h后，RPE細胞存活率仍較高，表明其對正常眼內(nèi)組織RPE無明顯細胞毒性。

綜上，本研究成功制備的FeⅢTA/PLGA/Ce6納米粒 PA成像效果較好，用于光熱治療聯(lián)合化學動力療法可有效殺傷Y79細胞；但該納米粒對腫瘤組織無明顯靶向性，有待加以改進。