菟絲子黃酮對大鼠種植窗期子宮內(nèi)膜容受性的影響

李瑩，陳建玲，吳佩蔚，黃亞哲，張帥，張丹

（1.南陽市中心醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，河南南陽 473400；2.鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)部，河南鄭州 450000）

子宮內(nèi)膜容受性指的是子宮內(nèi)膜對胚胎的接受能力，即允許胚胎粘附其上種植的特定節(jié)段，受時(shí)空嚴(yán)格控制。人的生殖內(nèi)分泌周期中，子宮內(nèi)膜僅有一個允許胚胎植入的敏感時(shí)期，為排卵后6~10 d，即種植窗期，此時(shí)子宮內(nèi)膜對胚胎的接受性最高。據(jù)Craciunas等[1]報(bào)道，體外受精-胚胎移植著床失敗的案例中大約有2/3是因子宮內(nèi)膜容受性不佳。故改善種植窗期子宮內(nèi)膜容受性是提高妊娠成功率的關(guān)鍵。近年來，中藥被用于改善個體種植窗期子宮內(nèi)膜容受性及促進(jìn)胚胎著床的研究增多，并取得一定進(jìn)展，其中，菟絲子作為中醫(yī)治療不孕類疾病的常用藥，備受矚目[2-3]。菟絲子，為旋花科植物菟絲子Cuscuta chinensisLam.的種子，味辛、甘，性平，入肝、腎經(jīng)，可補(bǔ)腎益精，養(yǎng)肝明目，安胎，主治腰膝酸痛、胎動不安、先兆流產(chǎn)等病癥?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，菟絲子有改善機(jī)體分泌、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫、增強(qiáng)性功能等作用[4]。菟絲子黃酮為菟絲子的主要有效成分之一，對雄性、雌性鼠生殖內(nèi)分泌均有調(diào)節(jié)作用[5-6]。故本研究選用菟絲子黃酮作為實(shí)驗(yàn)用藥，觀察其對子宮內(nèi)膜容受性的作用及其可能機(jī)制，為研發(fā)不孕癥治療藥物提供科學(xué)依據(jù)，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物SPF級成年未孕雌性SD大鼠50只，6~7周齡，體質(zhì)量220~220 g；SPF級健康成年雄性SD大鼠30只，6~7周齡，體質(zhì)量260~220 g。大鼠均購自北京斯貝福生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2019-0010。將雄性、雌性大鼠分籠飼養(yǎng)，自然光照，室內(nèi)溫度24~26℃，相對濕度40%~60%，自由攝食飲水。本實(shí)驗(yàn)操作均符合一般動物實(shí)驗(yàn)倫理學(xué)規(guī)定。

1.2 藥物、試劑與儀器菟絲子黃酮（純度＞98%），上海譜振生物科技有限公司生產(chǎn)，批號：171113134412；阿司匹林，拜耳醫(yī)藥保健有限公司生產(chǎn)，批號：國藥準(zhǔn)字J20130078。兔抗大鼠CD34一抗（北京百奧萊博科技有限公司）；雌二醇（E2）、孕酮（P）酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）試劑盒（上海臻科生物科技有限公司）；兔抗大鼠白血病抑制因子（LIF）、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）、磷酸化STAT3（p-STAT3）、GAPDH等一抗（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗（上海古朵生物科技有限公司）；STAT3抑制劑Stattic（純度99.9%，上海澤葉生物科技有限公司）。Bio-Rad680酶標(biāo)儀（美國伯樂公司）。

1.3 造模、分組與給藥對50只雌性大鼠進(jìn)行陰道涂片，觀察2個動情周期，取周期比較穩(wěn)定、正常且被判定為動情前期的雌性大鼠進(jìn)行編號，在實(shí)驗(yàn)當(dāng)日下午6點(diǎn)以雌雄2∶1比例合籠過夜，次日上午8點(diǎn)檢查陰栓。取有陰栓的40只雌性大鼠建立胚胎著床障礙模型[7]，在其妊娠第1、2天按體質(zhì)量皮下注射米非司酮溶液（米非司酮片溶于芝麻油，濃度為6.25 mg/mL）2.5 mg/kg，每日1次。剩余10只大鼠設(shè)為正常組，在妊娠第1、2天皮下注射芝麻油0.4 mL/kg，每日1次。造模成功標(biāo)準(zhǔn)[8]：①每日陰道脫落細(xì)胞涂片檢查顯示大鼠動情周期紊亂、延長甚至停滯；②抽查卵巢病理切片可見以原始卵泡、初級生長卵泡為主，刺激生長卵泡與成熟卵泡減少，提示排卵障礙；③大鼠出現(xiàn)拱背、蜷縮，活動減少，反應(yīng)遲鈍，出現(xiàn)脫毛、便溏等腎虛癥狀。

造模成功后，將建模大鼠隨機(jī)分為模型組、Stattic+中藥組、中藥組、陽性對照組，每組各10只。在妊娠第1~5天灌胃給藥：Stattic+中藥組先后給予Stattic混懸液（用生理鹽水溶解）3.75 mg/kg、菟絲子黃酮混懸液（用生理鹽水溶解）530.1 mg/kg[9]灌胃；中藥組給予530.1 mg/kg菟絲子黃酮混懸液灌胃；陽性對照組給予阿司匹林混懸液（用羧甲基纖維素鈉溶解）4.8 mg/kg灌胃；正常組和模型組給予等體積生理鹽水（4 mL/kg）灌胃。每日1次。

1.4 觀察指標(biāo)與方法

1.4.1 觀察大鼠種植窗期一般情況 在妊娠第5天，觀察大鼠一般情況，包括眼球神采、眼瞼、皮毛、體型、活動靈敏度、飲食及清潔度。

1.4.2 ELISA法檢測大鼠血清E2、P水平 戊巴比妥鈉麻醉后腹主動脈采血，-20℃冰箱內(nèi)保存。取腹主動脈血5 mL，于4℃、3 000 r/min離心15 min，離心半徑10 cm，取上清。具體操作步驟嚴(yán)格按照E2、P ELISA試劑盒說明書進(jìn)行。用酶標(biāo)儀在450 nm波長處測量吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算血清E2、P濃度。

1.4.3 觀察大鼠胚泡著床情況 脫頸處死大鼠，取出雙側(cè)子宮，計(jì)數(shù)胚泡著床大鼠數(shù)、著床胚泡數(shù)目，計(jì)算胚泡著床率。公式：胚泡著床率=著床胚泡數(shù)目/胚泡著床大鼠數(shù)。

1.4.4 HE染色法觀察大鼠子宮內(nèi)膜病理組織形態(tài) 摘取子宮清洗后刮取子宮內(nèi)膜，4%多聚甲醛溶液固定24 h，取出逐級乙醇脫水，二甲苯透明40 min，在子宮中段同一切面垂直石蠟包埋，制成4μm厚的切片。梯度乙醇脫蠟至水，蘇木素染色5 min，1%鹽酸酒精分化3 s，伊紅染色3 min。再梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，室溫晾干后鏡下觀察。

1.4.5 免疫組織化學(xué)染色法計(jì)測大鼠子宮內(nèi)膜微血管密度（MVD）取子宮內(nèi)膜石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，0.3%H2O2去離子水37℃孵育20 min，PBS浸泡后進(jìn)行抗原修復(fù)，血清封閉。滴加CD34一抗，4℃過夜。次日滴加二抗，室溫孵育0.5 h。DAB顯色，蘇木素染色，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。用CD34抗體標(biāo)記微血管，選取腺上皮細(xì)胞周圍血管密集區(qū)5個視野測量MVD，取平均值。

1.4.6 蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測大鼠子宮內(nèi)膜STAT3信號通路相關(guān)蛋白表達(dá) 取右側(cè)子宮內(nèi)膜，加入蛋白裂解液裂解，勻漿離心后取等量蛋白上清樣品，加等量上樣緩沖液混勻，冷卻后上樣，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉（SDS）-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE），電轉(zhuǎn)移至PVDF膜。5%脫脂奶粉封閉2 h，加入兔抗大鼠LIF、STAT3、p-STAT3、GAPDH等一抗（1∶1 000稀釋），4℃孵育過夜。洗膜3次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗（1∶2 000稀釋），室溫反應(yīng)2 h，洗膜，ECL發(fā)光顯影。應(yīng)用ImageJ軟件掃描各蛋白灰度值，結(jié)果以目的蛋白灰度值與內(nèi)參蛋白灰度值比值表示。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多樣本比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠種植窗期一般情況比較正常組大鼠眼球有神采，眼瞼正常，皮毛有光澤，體型壯實(shí)，動作靈活，反應(yīng)靈敏，飲食正常，干凈度較高；模型組大鼠眼球無神采，眼瞼多半開，皮毛稀疏無光澤，體型瘦小，反應(yīng)遲鈍，活動少，清潔度差；Stattic+中藥組大鼠眼球神采欠佳，個別眼瞼半開，皮毛光澤一般，反應(yīng)比較靈活，活動度和清潔度尚可；陽性對照組大鼠眼球神采、眼瞼基本正常，皮毛有光澤，體型、活動靈敏度、飲食及清潔度接近正常組。

2.2 各組大鼠血清E2、P水平計(jì)較表1結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組大鼠血清E2、P水平降低（P＜0.05）；與模型組比較，Stattic+中藥組、中藥組、陽性對照組血清E2、P水平升高（P＜0.05）；與Stattic+中藥組比較，中藥組、陽性對照組血清E2、P水平升高（P＜0.05）；與中藥組比較，陽性對照組血清E2、P水平升高（P＜0.05）。

表1 各組大鼠血清雌二醇（E2）、孕酮（P）水平比較Table 1 Comparison of serum E2 and P levels among various groups of rats （±s）

表1 各組大鼠血清雌二醇（E2）、孕酮（P）水平比較Table 1 Comparison of serum E2 and P levels among various groups of rats （±s）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與Stattic+中藥組比較；④P＜0.01，與中藥組比較

組別正常組模型組Stattic+中藥組中藥組陽性對照組F值P值鼠數(shù)/只10 10 10 10 10 E2/（pg·mL-1）50.74±1.82 16.28±0.58①25.42±1.45①②31.17±1.78①②③43.98±1.57①②③④850.151＜0.001 P/（ng·mL-1）0.67±0.04 0.31±0.03①0.40±0.06①②0.49±0.05①②③0.56±0.07①②③④71.963＜0.001

2.3 各組大鼠胚泡著床情況比較表2結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組胚泡著床數(shù)目較少（P＜0.05）；與模型組比較，Stattic+中藥組、中藥組、陽性對照組胚泡著床數(shù)目較多（P＜0.05）；與Stattic+中藥組比較，中藥組、陽性對照組胚泡著床數(shù)目較多（P＜0.05）；與中藥組比較，陽性對照組胚泡著床數(shù)目較多（P＜0.05）。

表2 各組大鼠胚泡著床情況比較Table 2 Comparison of the blastocyst nidation among various groups of rats （±s）

表2 各組大鼠胚泡著床情況比較Table 2 Comparison of the blastocyst nidation among various groups of rats （±s）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與Stattic+中藥組比較；④P＜0.01，與中藥組比較

組別正常組模型組Stattic+中藥組中藥組陽性對照組F值P值鼠數(shù)/只10 10 10 10 10胚泡著床大鼠數(shù)/只9 4 5 7 8胚泡著床率/%90.00 40.00 50.00 70.00 80.00胚泡著床數(shù)目/個14.99±0.42 5.15±0.24①7.95±0.31①②10.14±0.29①②③12.48±0.35①②③④733.729＜0.001

2.4 各組大鼠子宮內(nèi)膜病理組織形態(tài)比較圖1結(jié)果顯示：正常組大鼠子宮內(nèi)膜間質(zhì)略疏松、蛻膜化，血管豐富，未見炎性細(xì)胞浸潤；模型組子宮空腔擴(kuò)張，間質(zhì)細(xì)胞致密，無蛻膜化表現(xiàn)，炎性細(xì)胞浸潤嚴(yán)重；與模型組比較，Stattic+中藥組、中藥組和陽性對照組大鼠子宮內(nèi)膜間質(zhì)相對疏松，有蛻膜化表現(xiàn)，血管相對豐富，炎性細(xì)胞浸潤明顯減少。

圖1 各組大鼠子宮內(nèi)膜病理組織形態(tài)比較（HE染色，×200）Figure 1 Comparison of endometrialpathologicalhistomorphology among various groups of rats（HE staining，×200）

2.5 各組大鼠子宮內(nèi)膜MVD比較表3、圖2結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組大鼠子宮內(nèi)膜MVD降低（P＜0.05）；與模型組比較，Stattic+中藥組、中藥組、陽性對照組大鼠子宮內(nèi)膜MVD升高（P＜0.05）；與Stattic+中藥組比較，中藥組、陽性對照組大鼠子宮內(nèi)膜MVD升高（P＜0.05）；與中藥組比較，陽性對照組大鼠子宮內(nèi)膜MVD升高（P＜0.05）。

圖2 各組大鼠子宮內(nèi)膜CD34陽性表達(dá)情況（免疫組織化學(xué)染色，×200）Figure 2 Distribution of positive CD34 expression in the endometrium in each group of rats（Immunohistochemicalstaining，×200）

表3 各組大鼠子宮內(nèi)膜MVD比較Table 3 Comparison of endometrialMVD among various groups of rats （±s）

表3 各組大鼠子宮內(nèi)膜MVD比較Table 3 Comparison of endometrialMVD among various groups of rats （±s）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與Stattic+中藥組比較；④P＜0.01，與中藥組比較

組別正常組模型組Stattic+中藥組中藥組陽性對照組F值P值鼠數(shù)/只10 10 10 10 10 MVD/（條·mm-2）3.64±0.09 2.05±0.05①2.41±0.07①②2.89±0.05①②③3.31±0.06①②③④3 860.185＜0.001

2.6 各組大鼠子宮內(nèi)膜STAT3信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較表4、圖3結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組大鼠子宮內(nèi)膜LIF、p-STAT3蛋白相對表達(dá)量降低（P＜0.05）；與模型組比較，Stattic+中藥組、中藥組LIF、p-STAT3蛋白相對表達(dá)量升高（P＜0.05）；與Stattic+中藥組比較，中藥組LIF、p-STAT3蛋白相對表達(dá)量升高（P＜0.05）。

圖3 各組大鼠子宮內(nèi)膜LIF、STAT3、p-STAT3 Western Blot電泳條帶圖

表4 各組大鼠子宮內(nèi)膜LIF、STAT3、p-STAT3蛋白相對表達(dá)量比較Table 4 Comparison of the relative protein expression levels of LIF，STAT3 and p-STAT3 in the endometrium among various groups of rats （±s）

表4 各組大鼠子宮內(nèi)膜LIF、STAT3、p-STAT3蛋白相對表達(dá)量比較Table 4 Comparison of the relative protein expression levels of LIF，STAT3 and p-STAT3 in the endometrium among various groups of rats （±s）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與Stattic+中藥組比較

組別正常組模型組Stattic+中藥組中藥組F值P值鼠數(shù)/只10 10 10 10 LIF 0.91±0.09 0.12±0.02①0.33±0.06①②0.59±0.07①②③273.627＜0.001 STAT3 0.95±0.04 0.96±0.05 0.93±0.06 0.95±0.07 0.503 0.683 p-STAT3 0.36±0.05 0.04±0.01①0.15±0.02①②0.29±0.03①②③209.915＜0.001

3 討論

子宮內(nèi)膜容受性不良是限制女性妊娠的主要原因之一，如何提高子宮內(nèi)膜容受性也是現(xiàn)代生殖醫(yī)學(xué)界的研究熱點(diǎn)。

胚胎著床是成功妊娠的關(guān)鍵步驟，要求子宮內(nèi)膜呈接受態(tài)，胚泡發(fā)育成熟并有侵入性，經(jīng)歷漸進(jìn)性局部組織血管重建過程，最終由發(fā)育正常的胚泡順利植入子宮內(nèi)膜[10]。胚胎著床障礙是不孕癥發(fā)病機(jī)制的主要環(huán)節(jié)，與時(shí)相“種植窗期”相吻合，因此本研究建立胚胎著床障礙大鼠模型，模擬不孕癥的病證變化，分析菟絲子黃酮對大鼠種植窗期子宮內(nèi)膜容受性的作用及可能機(jī)制。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，中藥組大鼠種植窗期胚泡著床數(shù)目較多，提示菟絲子黃酮可改善子宮內(nèi)膜容受性，解決種植窗期的胚胎著床障礙問題。子宮內(nèi)膜在種植窗期的容受性最佳，此時(shí)上皮細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞均發(fā)揮重要作用，并在形態(tài)上發(fā)生了改變，如間質(zhì)細(xì)胞蛻膜化、血管增生。蛻膜細(xì)胞的增殖、凋亡的動態(tài)平衡是子宮內(nèi)膜容受性的主要標(biāo)志之一。本研究采用HE染色法觀察大鼠子宮內(nèi)膜形態(tài)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，中藥組子宮間質(zhì)細(xì)胞的蛻膜化表現(xiàn)突出，血管相對豐富。進(jìn)一步采取免疫組織化學(xué)染色法觀察子宮內(nèi)膜MVD發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，中藥組大鼠子宮內(nèi)膜MVD較多。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果共同提示：菟絲子黃酮可改善胚胎著床障礙大鼠子宮內(nèi)膜形態(tài)與功能，改善血液循環(huán)，為胚胎著床奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。

雌二醇（E2）、孕酮（P）均由卵巢及胎盤分泌，分別為女性體內(nèi)雌激素、孕激素，共同維持正常生理過程[11]。E2水平穩(wěn)定延續(xù)至分泌中晚期，對種植窗期子宮內(nèi)膜容受性有重要意義，若含量過低可影響內(nèi)膜間質(zhì)、上皮、腺體細(xì)胞發(fā)育，導(dǎo)致容受性降低；P在雌激素基礎(chǔ)上發(fā)揮作用，其主要功能是將子宮內(nèi)膜轉(zhuǎn)為分泌期，方便胚胎著床，若分泌不足可延緩內(nèi)膜成熟、間質(zhì)蛻膜化進(jìn)程。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，中藥組E2、P水平升高，提示菟絲子黃酮可調(diào)節(jié)胚胎著床障礙模型大鼠E2、P分泌狀態(tài)，從而調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜容受性，便于胚胎著床。

在E2和P的協(xié)同作用下，子宮內(nèi)膜組織多種因子呈時(shí)空特異性表達(dá)，共同影響胚胎著床這一復(fù)雜而精妙的過程，其中，LIF作用于STAT3信號通路，為胚胎著床機(jī)制發(fā)揮了關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用[12]。LIF是一種生物學(xué)功能多樣化的分泌型糖蛋白，其受體廣泛分布于子宮內(nèi)膜、蛻膜及胎盤等細(xì)胞膜上，其表達(dá)水平隨月經(jīng)周期改變，增殖期呈低表達(dá)，分泌中、晚期呈瞬時(shí)性高表達(dá)，且分泌中期與種植窗期的時(shí)間一致，表明LIF可標(biāo)記子宮內(nèi)膜容受性[13]。STAT3為STATs蛋白家族中的亞型之一，可在多種細(xì)胞因子刺激下磷酸化，但在子宮內(nèi)膜上皮，僅被LIF激活，且LIF在子宮內(nèi)膜上僅激活STAT3，表明LIF與STAT3存在特異性[14]。本研究通過Western Blot實(shí)驗(yàn)觀察了LIF、STAT3、p-STAT3等子宮內(nèi)膜容受性標(biāo)志物變化，結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組、Stattic+中藥組、中藥組大鼠子宮內(nèi)膜LIF、p-STAT3蛋白相對表達(dá)量降低，且模型組＜Stattic+中藥組＜中藥組，提示菟絲子黃酮可激活胚胎著床障礙模型大鼠LIF/STAT3信號通路。

綜上所述，菟絲子黃酮可能通過激活LIF/STAT3信號通路改善大鼠子宮內(nèi)膜容受性。