淫羊藿苷通過(guò)核轉(zhuǎn)錄因子KappaB通路減輕大鼠椎間盤退變

康小彪，李鵬飛，滕元平，胡鵬

（鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科，河南鄭州 450000）

椎間盤退變（intervertebral disc degeneration）是造成椎間盤疼痛的最主要原因，其主要病理學(xué)改變?yōu)樗韬思?xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)、纖維環(huán)斷裂及細(xì)胞外基質(zhì)合成減少[1]。近些年，隨著我國(guó)人口增長(zhǎng)及老齡化進(jìn)程加快，椎間盤退變發(fā)生率升高且趨于年輕化，但目前對(duì)椎間盤退變?nèi)詿o(wú)理想的治療方案。淫羊藿苷（icariin）是補(bǔ)腎中藥淫羊藿的主要活性成分，具有抗炎、抗腫瘤、抗衰老等藥理學(xué)功效[2-4]。既往研究[5-6]表明，淫羊藿苷可顯著緩解大鼠椎間盤源性腰痛，且劑量越大鎮(zhèn)痛效果越明顯，還可促進(jìn)退變髓核細(xì)胞增殖、蛋白聚糖及Ⅱ型膠原蛋白合成，減少白細(xì)胞介素（IL）-1β及IL-6表達(dá)，延緩椎間盤的退變，具有廣泛應(yīng)用前景，但其具體作用機(jī)制尚不完全清楚。有研究[7]發(fā)現(xiàn)，核轉(zhuǎn)錄子kappa B（NF-κB）信號(hào)通路在高糖誘導(dǎo)的髓核細(xì)胞中被激活?；诖?，本研究建立椎間盤退變大鼠模型，探討淫羊藿苷對(duì)椎間盤退變的改善作用及對(duì)NF-κB信號(hào)通路的影響，以期為臨床應(yīng)用淫羊藿苷治療椎間盤退變提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物60只清潔級(jí)健康8周齡雄性SD大鼠，體質(zhì)量180~200 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2018-0001。大鼠飼養(yǎng)于鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，自由飲食飲水，實(shí)驗(yàn)環(huán)境：明暗交替時(shí)間（12 h∶12 h）=1∶1，相對(duì)濕度50%～65%，室內(nèi)溫度20～25℃。

1.2 試劑與儀器淫羊藿苷（分子量：662.6351；分子式：C32H38O15；純度≥98.0%）購(gòu)自四川維克奇生物技術(shù)有限公司（批號(hào)：39012-04-9）。NF-κB信號(hào)通路激活劑脂多糖購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記（TUNEL）法試劑盒購(gòu)自上海羅氏制藥有限公司；B淋巴細(xì)胞瘤-2基因（Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）、NF-κB p65、p-p65等抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗購(gòu)自武漢博士德生物公司；蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒、免疫組織化學(xué)染色試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；IL-6、IL-1β、腫瘤壞死因子α（TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）試劑盒購(gòu)自美國(guó)ABclonal公司；3，3’-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物科技公司。CR21GII低溫高速離心機(jī)購(gòu)自日本日立公司；Multiskan Sky全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)賽默飛世爾科技公司；CKX53倒置顯微鏡購(gòu)自日本奧林巴斯公司。

1.3 模型制備、分組與給藥采用纖維環(huán)穿刺法制備椎間盤退變大鼠模型[8-9]：將50只大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉，仰臥位固定于鼠板上，腹部剃毛消毒，右側(cè)旁正中做一約2 cm的切口，逐層切開，暴露腹后壁，可見(jiàn)髂嵴正對(duì)L6錐體或L5~L6椎間盤。左右髂嵴為定位參照，剪開腹后膜，從脊柱附著點(diǎn)上呈節(jié)段性剝離腰大肌，充分暴露L4~L5、L5~L6椎間盤。22 G針頭穿刺于椎間盤中部，深度約為2 mm，針頭在椎間盤中停留10 s再拔出，穿刺完成后，復(fù)位腹腔內(nèi)容物，依次縫合皮下筋膜、肌肉層和皮膚。根據(jù)術(shù)后大鼠的步態(tài)、進(jìn)食情況、有無(wú)尿潴留以及傷口感染等情況可判斷椎間盤退變模型制備是否成功[10]。另取10只大鼠僅暴露椎間盤2 min，不進(jìn)行穿刺，作為假手術(shù)組。

4周后，將腰椎穿刺后存活的48只大鼠隨機(jī)分為模型組、淫羊藿苷組、激動(dòng)劑組、激動(dòng)劑+淫羊藿苷組，每組12只。激動(dòng)劑+淫羊藿苷組給予淫羊藿苷6.0 g/kg灌胃[11]，尾靜脈注射脂多糖5 mg/kg[12]；淫羊藿苷組給予淫羊藿苷6.0 g/kg灌胃，尾靜脈注射等量（5 mL）生理鹽水；激動(dòng)劑組給予等量（5 mL）生理鹽水灌胃，尾靜脈注射脂多糖5 mg/kg；假手術(shù)組、模型組給予等量（5 mL）生理鹽水灌胃，尾靜脈注射等量（5 mL）生理鹽水。每日1次，連續(xù)2周。

給藥過(guò)程中，激動(dòng)劑組和激動(dòng)劑+淫羊藿苷組大鼠由于腹內(nèi)感染各有1只死亡，其余組未有死亡。

1.4 觀察指標(biāo)與方法

1.4.1 ELISA法檢測(cè)血清中IL-6、IL-1β、TNF-α含量 末次給藥2 h后，腹腔麻醉，打開腹腔，主動(dòng)脈采血，室溫靜置30 min后，以3 000 r/min（離心半徑8 cm）離心10 min，吸取上清液。具體操作步驟按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。最后應(yīng)用酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（OD）值。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線后，計(jì)算各指標(biāo)含量。

1.4.2 HE染色法觀察椎間盤病理學(xué)變化 采血結(jié)束后，頸椎脫臼法將大鼠處死，冰上快速剝離L4~L5和L5~L6椎間盤組織，冰生理鹽水沖洗干凈，將L4~L5椎間盤置于4%多聚甲醛溶液中固定。經(jīng)常規(guī)脫水、石臘包埋、切片（片厚4μm），二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水后，蘇木素染液染色5 min，自來(lái)水沖洗干凈，分化液分化30 s，自來(lái)水浸泡10 min，伊紅染液染色2 min，自來(lái)水沖洗。脫水、透明、封片，顯微鏡下觀察并拍照。

1.4.3 TUNEL染色法測(cè)定髓核細(xì)胞凋亡率 L4~L5椎間盤組織石蠟切片脫蠟至水；PBS清洗3次，5 min/次，滴加蛋白酶K工作液于組織上，37℃水浴中反應(yīng)30 min；PBS清洗3次，5 min/次，室溫水解15 min；PBS清洗3次，5 min/次，加封閉液室溫封閉10 min；PBS清洗3次，5 min/次，拭水紙擦干玻片，滴加TUNEL反應(yīng)混合液50μL，37℃避光反應(yīng)1 h；PBS清洗3次，5 min/次，滴加DAPI染液，靜置10 min；雙蒸水沖洗，拭水紙擦干玻片，滴加熒光封片液。熒光顯微鏡下觀察并拍照，波長(zhǎng)為360～400 nm，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞凋亡率（%）=呈紅色熒光細(xì)胞/呈藍(lán)色熒光細(xì)胞×100%。

1.4.4 蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測(cè)椎間盤組織中NF-κB p65、p-p65，Bax，Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量 取L5~L6椎間盤組織，液氮中研磨，加RIPA裂解液充分裂解，低溫高速離心后，吸取上清液，BCA法測(cè)定蛋白濃度；加入5×上樣緩沖液和RIPA裂解液調(diào)整蛋白濃度，100℃煮沸10 min，使蛋白變性穩(wěn)定。進(jìn)行十二烷基硫酸鈉（SDS）凝膠電泳，每孔上樣20μL，濃縮膠80 V電泳30 min，分離膠120 V電泳1.5 h，0.3 A濕轉(zhuǎn)2 h；TBST洗膜3次，5 min/次，室溫封閉1 h；分別加NF-κB p65、p-p65、Bax、Bcl-2、GAPDH等一抗（稀釋比1∶1 000）4℃孵育過(guò)夜；TBST洗膜3次，5 min/次，二抗（稀釋比1∶5 000）室溫孵育1 h；TBST洗膜3次，5 min/次，ECL化學(xué)發(fā)光顯影。ImageJ軟件分析蛋白條帶灰度值，目的蛋白條帶灰度值/GAPDH灰度值比值為目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.4.5 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)椎間盤組織中p-p65蛋白表達(dá) L4~L5椎間盤組織置于4%多聚甲醛中固定24 h后，采用乙二胺四乙酸（EDTA）脫鈣液進(jìn)行脫鈣7 d，流水沖洗，脫水、包埋、切片（片厚4μm），脫蠟至水。玻片置于PBS中微波15 min，進(jìn)行抗原修復(fù)，3%過(guò)氧化氫滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶20 min，5%BSA室溫封閉20 min，p-p65蛋白一抗（稀釋比1∶200）4℃孵育過(guò)夜。二抗孵育1 h，DAB顯色液顯色5 min，雙蒸水終止反應(yīng)，脫水透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察并拍照。棕色部分表示p-p65蛋白表達(dá)陽(yáng)性。應(yīng)用Image Pro Plus 6.0軟件計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞積分光密度（IOD）值和總細(xì)胞面積（Area），p-p65蛋白表達(dá)水平用平均光密度（AOD）表示，AOD值=IOD值/Area值。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多樣本計(jì)量資料比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清中IL-6、IL-1β、TNF-α含量比較表1結(jié)果顯示：IL-6、IL-1β、TNF-α含量組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清中IL-6、IL-1β、TNF-α含量升高（均P＜0.05）；與模型組比較，淫羊藿苷組大鼠血清中IL-6、IL-1β、TNF-α含量降低（均P＜0.05），激動(dòng)劑組大鼠血清中IL-6、IL-1β、TNF-α含量升高（均P＜0.05）；與淫羊藿苷組比較，激動(dòng)劑+淫羊藿苷組大鼠血清中IL-6、IL-1β、TNF-α含量升高（均P＜0.05）；與激動(dòng)劑組比較，激動(dòng)劑+淫羊藿苷組大鼠血清中IL-6、IL-1β、TNF-α含量降低（均P＜0.05）。

表1 各組大鼠血清中白細(xì)胞介素（IL）-6、IL-1β、腫瘤壞死因子（TNF）-α含量比較Table 1 Comparison of serum levels of IL-6，IL-1βand TNF-αamong various groups of rats （±s，mg·L-1）

表1 各組大鼠血清中白細(xì)胞介素（IL）-6、IL-1β、腫瘤壞死因子（TNF）-α含量比較Table 1 Comparison of serum levels of IL-6，IL-1βand TNF-αamong various groups of rats （±s，mg·L-1）

①P＜0.05，與假手術(shù)組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與淫羊藿苷組比較；④P＜0.05，與激動(dòng)劑組比較

組別假手術(shù)組模型組淫羊藿苷組激動(dòng)劑組激動(dòng)劑+淫羊藿苷組F值P值鼠數(shù)/只10 12 12 11 11 IL-6 104.28±12.33 366.17±15.74①232.50±12.96①②414.26±16.63①②③298.18±15.72①②③④712.045＜0.001 IL-1β 52.80±8.64 123.62±10.58①78.66±9.27①②178.09±10.82①②③105.54±11.35①②③④234.996＜0.001 TNF-α 37.06±8.24 149.23±8.60①83.84±10.17①②190.22±11.53①②③115.62±12.80①②③④342.489＜0.001

2.2 各組大鼠椎間盤組織病理學(xué)變化比較圖1結(jié)果顯示：假手術(shù)組大鼠髓核與纖維環(huán)之間界限清晰、纖維環(huán)結(jié)構(gòu)完整、髓核細(xì)胞排列整齊且均勻；模型組大鼠髓核與纖維環(huán)之間界限模糊、纖維環(huán)排列紊亂且存在縫隙，髓核細(xì)胞聚集、皺縮，基質(zhì)減少；與模型組比較，淫羊藿苷組纖維環(huán)結(jié)構(gòu)和髓核形態(tài)及排列趨于正常；激動(dòng)劑組大鼠纖維環(huán)存在嚴(yán)重裂隙，髓核細(xì)胞數(shù)量明顯減少，病變程度較模型組嚴(yán)重；激動(dòng)劑+淫羊藿苷組大鼠椎間盤病變較激動(dòng)劑組減輕。

圖1 各組大鼠椎間盤組織病理學(xué)變化比較（HE染色，×400）Figure 1 Comparison of histopathologicalchanges of intervertebraldisc tissues among various groups of rats（HE staining，×400）

2.3 各組大鼠髓核細(xì)胞凋亡率比較表2、圖2結(jié)果顯示：髓核細(xì)胞凋亡率組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠髓核細(xì)胞凋亡率升高（P＜0.05）；與模型組比較，淫羊藿苷組大鼠髓核細(xì)胞凋亡率降低，激動(dòng)劑組大鼠髓核細(xì)胞凋亡率升高（P＜0.05）；與淫羊藿苷組比較，激動(dòng)劑+淫羊藿苷組大鼠髓核細(xì)胞凋亡率升高（P＜0.05）；與激動(dòng)劑組比較，激動(dòng)劑+淫羊藿苷組大鼠髓核細(xì)胞凋亡率降低（P＜0.05）。

圖2 各組TUNEL陽(yáng)性染色髓核細(xì)胞分布情況（TUNEL染色，×400）Figure 2 Distribution of TUNEL positive staining nucleus pulposus cells in each group of rats（TUNEL staining，×400）

表2 各組大鼠髓核細(xì)胞凋亡率比較Table 2 Comparison of apoptosis rate of nucleus pulposus cells among various groups of rats（±s）

表2 各組大鼠髓核細(xì)胞凋亡率比較Table 2 Comparison of apoptosis rate of nucleus pulposus cells among various groups of rats（±s）

①P＜0.05，與假手術(shù)組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與淫羊藿苷組比較；④P＜0.05，與激動(dòng)劑組比較

組別假手術(shù)組模型組淫羊藿苷組激動(dòng)劑組激動(dòng)劑+淫羊藿苷組F值P值鼠數(shù)/只10 12 12 11 11細(xì)胞凋亡率/%2.14±0.75 9.84±0.83①6.12±0.76①②15.73±0.68①②③8.03±0.62①②③④497.425＜0.001

2.4 各組大鼠椎間盤組織中Bax、Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量比較表3、圖3結(jié)果顯示：Bax、Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與假手術(shù)組比較，模型組Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量升高，Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量降低（均P＜0.05）；與模型組比較，淫羊藿苷組Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量降低、Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量升高，激動(dòng)劑組Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量升高、Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量降低（均P＜0.05）；與淫羊藿苷組比較，激動(dòng)劑+淫羊藿苷組Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量升高，Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量降低（均P＜0.05）；與激動(dòng)劑組比較，激動(dòng)劑+淫羊藿苷組Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量降低，Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量升高（均P＜0.05）。

表3 各組大鼠椎間盤組織中Bax、Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量比較Table 3 Comparison of protein relative expression levels of Bax and Bcl-2 in intervertebral disc tissues among various groups of rats （±s）

表3 各組大鼠椎間盤組織中Bax、Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量比較Table 3 Comparison of protein relative expression levels of Bax and Bcl-2 in intervertebral disc tissues among various groups of rats （±s）

①P＜0.05，與假手術(shù)組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與淫羊藿苷組比較；④P＜0.05，與激動(dòng)劑組比較

組別假手術(shù)組模型組淫羊藿苷組激動(dòng)劑組激動(dòng)劑+淫羊藿苷組F值P值鼠數(shù)/只10 12 12 11 11 Bax 0.16±0.05 0.62±0.07①0.33±0.07①②0.87±0.08①②③0.51±0.06①②③④176.165＜0.001 Bcl-2 0.87±0.04 0.30±0.07①0.75±0.05①②0.15±0.04①②③0.56±0.06①②③④341.964＜0.001

圖3 Bax、Bcl-2的Western Blot電泳條帶Figure 3 Western Blot electrophoresis bands of Bax and Bcl-2

2.5 各組大鼠椎間盤組織中NF-κB p65、p-p65蛋白相對(duì)表達(dá)量比較表4、圖4結(jié)果顯示：p-p65蛋白相對(duì)表達(dá)量組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與假手術(shù)組比較，模型組p-p65蛋白相對(duì)表達(dá)量升高（P＜0.05）；與模型組比較，淫羊藿苷組p-p65蛋白相對(duì)表達(dá)量降低，激動(dòng)劑組p-p65蛋白相對(duì)表達(dá)量升高（P＜0.05）；與淫羊藿苷組比較，激動(dòng)劑+淫羊藿苷組p-p65蛋白相對(duì)表達(dá)量升高（P＜0.05）；與激動(dòng)劑組比較，激動(dòng)劑+淫羊藿苷組p-p65蛋白相對(duì)表達(dá)量降低（P＜0.05）。NF-κB p65蛋白相對(duì)表達(dá)量組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖4 p-p65、NF-κB p65的Western Blot電泳條帶Figure 4 Western Blot electrophoresis bands of p-p65 and NF-κB p65

表4 各組大鼠椎間盤組織中NF-κB p65、p-p65蛋白相對(duì)表達(dá)量比較Table 4 Comparison of protein relative expression levels of NF-κB p65 and p-p65 in intervertebral disc tissues among various groups of rats （±s）

表4 各組大鼠椎間盤組織中NF-κB p65、p-p65蛋白相對(duì)表達(dá)量比較Table 4 Comparison of protein relative expression levels of NF-κB p65 and p-p65 in intervertebral disc tissues among various groups of rats （±s）

①P＜0.05，與假手術(shù)組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與淫羊藿苷組比較；④P＜0.05，與激動(dòng)劑組比較

組別假手術(shù)組模型組淫羊藿苷組激動(dòng)劑組激動(dòng)劑+淫羊藿苷組F值P值鼠數(shù)/只10 12 12 11 11 p-p65 0.24±0.08 0.73±0.07①0.32±0.07①②0.95±0.05①②③0.46±0.06①②③④215.815＜0.001 NF-κB p65 1.02±0.05 1.02±0.07 1.03±0.06 1.06±0.07 0.98±0.08 2.012 0.107

2.6 各組大鼠椎間盤組織中p-p65蛋白陽(yáng)性表達(dá)比較表5、圖5結(jié)果顯示：p-p65平均光密度值組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與假手術(shù)組比較，模型組p-p65平均光密度值升高（P＜0.05）；與模型組比較，淫羊藿苷組p-p65平均光密度值降低，激動(dòng)劑組p-p65平均光密度值升高（P＜0.05）；與淫羊藿苷組比較，激動(dòng)劑+淫羊藿苷組p-p65平均光密度值升高（P＜0.05）；與激動(dòng)劑組比較，激動(dòng)劑+淫羊藿苷組p-p65平均光密度值降低（P＜0.05）。

表5 各組大鼠椎間盤組織中p-p65蛋白陽(yáng)性表達(dá)比較Table 5 Comparison of p-p65 protein-positive expression in intervertebraldisc tissues among various groups of rats （±s）

表5 各組大鼠椎間盤組織中p-p65蛋白陽(yáng)性表達(dá)比較Table 5 Comparison of p-p65 protein-positive expression in intervertebraldisc tissues among various groups of rats （±s）

①P＜0.05，與假手術(shù)組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與淫羊藿苷組比較；④P＜0.05，與激動(dòng)劑組比較

組別假手術(shù)組模型組淫羊藿苷組激動(dòng)劑組激動(dòng)劑+淫羊藿苷組F值P值鼠數(shù)/只10 12 12 11 11 p-p65平均光密度值0.02±0.005 0.16±0.010①0.08±0.007①②0.25±0.013①②③0.12±0.011①②③④859.095＜0.001

圖5 各組大鼠椎間盤組織中p-p65免疫組織化學(xué)染色法結(jié)果（×400）Figure 5 Immunohistochemicalstaining results of p-p65 in intervertebraldisc tissues in each group of rats（×400）

3 討論

炎癥和髓核細(xì)胞凋亡是發(fā)生椎間盤退變的重要因素。研究[13-15]表明，抑制炎癥反應(yīng)和髓核細(xì)胞凋亡，可改善大鼠椎間盤退變。IL-1是一種強(qiáng)有力的炎癥因子，當(dāng)椎間盤受到損傷時(shí)，局部的單核細(xì)胞應(yīng)激產(chǎn)生IL-1，而IL-1可募集更多的炎性細(xì)胞聚集，并誘導(dǎo)炎性細(xì)胞分泌多種炎性介質(zhì)，從而催化椎間盤組織發(fā)生炎癥反應(yīng)[16]。而IL-1β作為IL-1最主要的亞型，可通過(guò)多條信號(hào)通路，放大炎性反應(yīng)，加重椎間盤損傷。IL-6作為炎癥反應(yīng)的催化劑和媒介，同樣在椎間盤退變中發(fā)揮重要的作用[17-18]。TNF-α是急性炎癥期的主要炎性因子，參與炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，并可引起細(xì)胞凋亡[17]。本研究結(jié)果顯示：椎間盤退變大鼠血清中IL-6、IL-1β和TNF-α含量明顯升高，采用HE染色法觀察椎間盤組織病理學(xué)變化，可見(jiàn)椎間盤退變大鼠椎間盤與纖維環(huán)界限模糊、纖維環(huán)排列紊亂且存在縫隙，髓核細(xì)胞聚集、皺縮、減少，淫羊藿苷治療后血清中IL-6、IL-1β和TNF-α含量等指標(biāo)降低，且椎間盤組織中纖維環(huán)結(jié)構(gòu)和髓核形態(tài)及排列趨于正常，表明淫羊藿苷可減輕椎間盤退變大鼠的炎癥反應(yīng)，改善椎間盤組織損傷。

Bcl-2和Bax是Bcl-2家族的關(guān)鍵組成成員，Bcl-2/Bax通過(guò)線粒體依賴途徑調(diào)控細(xì)胞凋亡，Bcl-2位于線粒體膜上，可抑制線粒體內(nèi)細(xì)胞色素C泄露至胞質(zhì)并阻斷鈣離子從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放，使依賴細(xì)胞色素C和鈣離子的核酸內(nèi)切酶活性降低，發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡作用。Bax與Bcl-2形成異源二聚體，可抑制Bcl-2，發(fā)揮促細(xì)胞凋亡作用[19]。本研究結(jié)果顯示：椎間盤退變大鼠椎間盤組織Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量升高、Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量降低，髓核細(xì)胞凋亡率亦增加，淫羊藿苷治療后，Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量降低、Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量升高，且髓核細(xì)胞凋亡率降低，表明淫羊藿苷可調(diào)節(jié)椎間盤退變大鼠椎間盤組織Bax/Bcl-2，抗髓核細(xì)胞凋亡。

NF-κB信號(hào)通路參與細(xì)胞增殖、分化和凋亡，而且與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，在細(xì)胞不受外界刺激的情況下，主要以p65和p50二聚體的形式與IκB結(jié)合位于胞漿內(nèi)。當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激后，IκB發(fā)生磷酸化而被降解，暴露NF-κB二聚體，并從胞漿轉(zhuǎn)移入細(xì)胞核，從而調(diào)控多種基因的轉(zhuǎn)錄，其中包括促炎細(xì)胞因子基因的表達(dá)。為進(jìn)一步探討淫羊藿苷是否通過(guò)調(diào)節(jié)NF-κB信號(hào)通路改善椎間盤退變，本研究應(yīng)用NF-κB信號(hào)通路激活劑脂多糖激活該信號(hào)通路，采用免疫組織化學(xué)法和Western Blot法檢測(cè)p-p65表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NF-κB信號(hào)通路被激活后p-p65活化水平升高，淫羊藿苷治療后可降低p-p65的活化水平。同時(shí)采用Western Blot法檢測(cè)Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，NF-κB信號(hào)通路激活可促進(jìn)凋亡蛋白Bax表達(dá)，抑制抗凋亡蛋白Bax表達(dá)，淫羊藿苷治療則發(fā)揮反向作用，表明淫羊藿苷可能通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路抗髓核細(xì)胞凋亡，起到保護(hù)椎間盤組織的作用。

綜上所述，淫羊藿苷可改善椎間盤退變大鼠椎間盤病理?yè)p傷、減輕炎癥反應(yīng)、抑制髓核細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與調(diào)控NF-κB信號(hào)通路有關(guān)。