龜鹿二仙膠對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)體內(nèi)抗衰老作用研究

安苗青，徐雅囡，卓倩婷，謝斯威，陳宏著，杜冰，黎攀

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州 510642；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)數(shù)學(xué)與信息學(xué)院，廣東廣州 510642）

衰老是一種自然的、普遍的、不可逆轉(zhuǎn)的自發(fā)性生理過(guò)程，同時(shí)伴有器官退行性障礙[1-2]，主要由環(huán)境因素和遺傳共同介導(dǎo)?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，隨著年齡的增長(zhǎng)，機(jī)體代謝速度緩慢，體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生過(guò)量的活性氧自由基（ROS）。當(dāng)ROS水平超出正常水平時(shí)會(huì)導(dǎo)致機(jī)體應(yīng)激損傷，破壞免疫系統(tǒng)，最終導(dǎo)致壽命縮短[3-4]。ROS也是導(dǎo)致高血壓、心血管疾病和阿爾茲海默癥的重要原因[5]。臨床上為延長(zhǎng)壽命通常使用人工合成的抗氧化劑來(lái)增強(qiáng)抗氧化酶的活性以清除體內(nèi)自由基，但這些抗氧化劑長(zhǎng)期服用會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生危害。因此，開(kāi)發(fā)具有抗衰老作用的天然活性藥物具有重要的意義。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，腎精不足、氣血虧虛是導(dǎo)致衰老的主要病因[6]。龜鹿二仙膠為延緩衰老的效驗(yàn)方，最早見(jiàn)于明代王三才的《醫(yī)便》，其方劑組成為鹿角10斤、龜板5斤、人參15兩、枸杞子30兩，四藥合用，多用于虛損精極、遺泄、瘦削少氣及目視不明等癥[7]。既往學(xué)者們對(duì)龜鹿二仙膠抗衰老作用進(jìn)行了大量的藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)。王樹(shù)鵬等[8]觀察龜鹿二仙膠顆粒對(duì)自然衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響，連續(xù)給藥3個(gè)月后，發(fā)現(xiàn)小鼠錯(cuò)誤反應(yīng)期延長(zhǎng)，逃避反應(yīng)期顯著縮短且錯(cuò)誤反應(yīng)次數(shù)減少。WANG等[9]研究結(jié)果表明，龜鹿二仙膠通過(guò)降低p16INK4a、p53和p21Cip1/Waf1蛋白的表達(dá)，可緩解化療藥物誘導(dǎo)造血干細(xì)胞的衰老。梁征洋等[10]將龜鹿二仙膠作用于D-半乳糖致衰老小鼠，發(fā)現(xiàn)藥物組中丙二醛（MDA）含量較模型組下降、超氧化物歧化酶（SOD）活性顯著較模型組升高。以上研究均表明龜鹿二仙膠具有抗氧化的功效，但其在抗衰老方面的研究甚少且具體作用機(jī)制尚不清楚。

秀麗隱桿線蟲(chóng)作為一種新型抗衰老評(píng)價(jià)模型，具有易于飼養(yǎng)、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、生命周期短、與人類(lèi)基因保守性較高的特點(diǎn)，是國(guó)際上公認(rèn)的抗氧化和延緩衰老研究的優(yōu)勢(shì)模型[11-12]，廣泛應(yīng)用于先天免疫、氧化脅迫效應(yīng)和環(huán)境暴露與損傷等的機(jī)制研究中[13]。因此，本研究以秀麗隱桿線蟲(chóng)為研究對(duì)象，通過(guò)對(duì)線蟲(chóng)壽命、行動(dòng)力、產(chǎn)卵量、脂褐質(zhì)水平、氧化應(yīng)激及抗氧化酶活性等相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行分析，進(jìn)一步探討龜鹿二仙膠的抗衰老機(jī)制，為擴(kuò)大其在市場(chǎng)上的廣泛應(yīng)用提供研究基礎(chǔ)，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料

1.1 動(dòng)物與細(xì)菌N2野生型秀麗隱桿線蟲(chóng)（Caenorhabditis elegans，the Bristol strain N2）購(gòu)于美國(guó)Caenorhabditis elegansGenetics Center；大腸埃希氏菌OP50（E.coliOP50），由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院曹康課題組贈(zèng)送。

1.2 藥物、試劑與儀器鹿角、龜板、枸杞子、肉桂、西洋參，購(gòu)自亳州中藥材市場(chǎng)，由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院肖南實(shí)驗(yàn)員鑒定。蝦青素標(biāo)品，索萊寶生物試劑有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：SA8730。胡桃醌、瓊脂、胰蛋白胨、鏈霉素硫酸鹽、氯化鈉、氯化鈣、硫酸鎂、磷酸氫二鈉、磷酸氫二鉀、磷酸緩沖溶液、2’，7’-二乙酸二氯熒光素（2’，7’-dichlorofluorescin diacetate，H2DCF-DA），購(gòu)自廣州齊湘生物科技有限公司；丙二醛（MDA）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）等檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自南京城建生物工程研究所。FA2204萬(wàn)分之一天平（上海舍巖儀器有限公司）；SN-HWS 250B恒溫生化培養(yǎng)箱[甘易儀器設(shè)備（上海）有限公司]；LD-SY96S多功能酶標(biāo)儀[美谷分子儀器（上海）有限公司]；MF53-N熒光顯微鏡（上海蔡康光學(xué)儀器有限公司）；LC-LX-HR185C冷凍離心機(jī)（日本久保田公司）。

1.3 藥物及制備龜鹿二仙膠的制備：利用超聲波將400~600份鹿角和200~300份龜甲清洗干凈，鹿角完全浸泡20~40 d，經(jīng)過(guò)3次熬煮后進(jìn)行酶解，然后在酶解液中加入10~20份肉桂、40~50份西洋參和80~100份枸杞子恒溫熬煮1~6 h，最后濃縮罐裝。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組實(shí)驗(yàn)分5組：空白組（不處理）、龜鹿二仙膠低劑量組（0.5 mg/mL）、龜鹿二仙膠中劑量組（2.5 mg/mL）、龜鹿二仙膠高劑量組（5 mg/mL）、陽(yáng)性對(duì)照組（蝦青素0.64μmol/mL）。

2.2 線蟲(chóng)的培養(yǎng)及傳代用涂有大腸桿菌OP50的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基，在20℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)線蟲(chóng)。成年的秀麗隱桿線蟲(chóng)分為雌雄同體和雄性?xún)煞N性別，傳代時(shí)挑取處于產(chǎn)卵期的單個(gè)雌雄同體的線蟲(chóng)于新的涂有E.coliOP50的NGM培養(yǎng)基，20℃恒溫培養(yǎng)。

2.3 線蟲(chóng)同期化培養(yǎng)為保證實(shí)驗(yàn)過(guò)程中所有線蟲(chóng)處于同一生長(zhǎng)時(shí)期，要將其進(jìn)行同期化處理。本實(shí)驗(yàn)采用高氯酸鈉漂白法進(jìn)行同期化培養(yǎng)：由于年輕成蟲(chóng)體內(nèi)有較多蟲(chóng)卵，故采用1 mL M9緩沖溶液將年輕成蟲(chóng)沖洗至無(wú)菌EP管中，加入1 mL裂解液裂解線蟲(chóng)，震蕩3.5 min，在低速離心機(jī)上以3 000 r/min（離心半徑5 cm）離心1 min，除去上清液。再用M9沖洗2~3次，離心棄上清后用移液槍吸取EP管底部線蟲(chóng)滴于NGM無(wú)菌區(qū)，約48 h后蟲(chóng)卵基本發(fā)育成L4期幼蟲(chóng)，完成同期化操作。

2.4 線蟲(chóng)壽命的測(cè)定挑取同期化的L4期幼蟲(chóng)到新的各組培養(yǎng)板上（每組4個(gè)平板，每個(gè)平板20條）繼續(xù)培養(yǎng)。從轉(zhuǎn)移時(shí)刻開(kāi)始計(jì)算存活時(shí)間，到生殖后期（通常為第4天）每2 d就將線蟲(chóng)轉(zhuǎn)移到新的各組培養(yǎng)板上以保證藥物濃度。隔天探視線蟲(chóng)，記錄死亡線蟲(chóng)數(shù)，記錄線蟲(chóng)生存、死亡及剔除實(shí)驗(yàn)的條數(shù)，直至所有組線蟲(chóng)全部死亡[14]，實(shí)驗(yàn)結(jié)束。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。計(jì)算線蟲(chóng)平均壽命和最高壽命，其平均壽命為線蟲(chóng)全部死亡時(shí)間的平均值，最高壽命為線蟲(chóng)最后存活數(shù)量的10%時(shí)的平均壽命[15]。

線蟲(chóng)死亡的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)：無(wú)移動(dòng)或吞咽動(dòng)作，輕觸后仍無(wú)反應(yīng)。剔除標(biāo)準(zhǔn)：①逃離至培養(yǎng)皿壁或蓋上而干死；②蟲(chóng)卵在體內(nèi)孵化成袋樣蟲(chóng)；③鉆入瓊脂中。剔除意外死亡、逃逸和袋樣蟲(chóng)。

2.5 線蟲(chóng)運(yùn)動(dòng)能力的測(cè)定與壽命試驗(yàn)同時(shí)進(jìn)行，線蟲(chóng)的運(yùn)動(dòng)能力測(cè)定參考YANG等[16]的研究方法。用鉑絲輕觸線蟲(chóng)身體，30 s內(nèi)若線蟲(chóng)表現(xiàn)出連續(xù)協(xié)調(diào)的正弦運(yùn)動(dòng)，則記為快速運(yùn)動(dòng)；反之則記為緩慢運(yùn)動(dòng)。記錄標(biāo)準(zhǔn)：①線蟲(chóng)自發(fā)運(yùn)動(dòng)，不需要觸碰刺激，記為“A”；②線蟲(chóng)必須受到觸碰刺激才運(yùn)動(dòng)，記為“B”；③線蟲(chóng)受到觸碰刺激后只擺頭或尾，記為“C”。

2.6 線蟲(chóng)產(chǎn)卵量的測(cè)定將線蟲(chóng)同期化培養(yǎng)后，每組挑取10條處于L4期的線蟲(chóng)到各組培養(yǎng)基中，每份線蟲(chóng)培養(yǎng)基上放置1條線蟲(chóng)。每隔24 h將線蟲(chóng)轉(zhuǎn)移至新的平板中，轉(zhuǎn)移4~5次后，線蟲(chóng)基本不再產(chǎn)卵。然后將所有平板繼續(xù)放在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，待子代線蟲(chóng)孵化長(zhǎng)大后，在其進(jìn)入產(chǎn)卵之前（20℃孵育24 h）對(duì)平板上的線蟲(chóng)進(jìn)行計(jì)數(shù)，即可得到每個(gè)線蟲(chóng)的產(chǎn)卵量。

2.7 吞咽頻率的測(cè)定挑取同期化的L4期幼蟲(chóng)到新的各組培養(yǎng)板上（每組4個(gè)平板，每個(gè)平板20條）繼續(xù)干預(yù)5 d后，每組隨機(jī)挑取10~15條線蟲(chóng)，測(cè)定其在1 min內(nèi)吞咽的次數(shù)。測(cè)定方法：在顯微鏡下用鉑絲輕輕觸碰線蟲(chóng)身體觀測(cè)其咽部肌肉1 min內(nèi)抽動(dòng)的次數(shù)。獨(dú)立重復(fù)進(jìn)行3次。

2.8 線蟲(chóng)應(yīng)激壽命實(shí)驗(yàn)

2.8.1 線蟲(chóng)熱應(yīng)激壽命 挑取同期化的L4期幼蟲(chóng)到新的各組培養(yǎng)板上（每組4個(gè)平板，每個(gè)平板20條）繼續(xù)干預(yù)5 d，再轉(zhuǎn)移到37℃環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng)，每小時(shí)在倒置熒光顯微鏡下計(jì)算線蟲(chóng)的生存和死亡個(gè)數(shù)，并繪制生存曲線，直至所有線蟲(chóng)全部死亡。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.8.2 線蟲(chóng)紫外應(yīng)激壽命 挑取同期化的L4期幼蟲(chóng)到新的各組培養(yǎng)板上（每組4個(gè)平板，每個(gè)平板20條）繼續(xù)干預(yù)5 d，轉(zhuǎn)移到紫外照射環(huán)境中培養(yǎng)12 h后，在倒置顯微鏡下跟蹤計(jì)算線蟲(chóng)的生存和死亡個(gè)數(shù)，繪制生長(zhǎng)曲線，直至所有組線蟲(chóng)死亡。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.8.3 線蟲(chóng)胡桃醌氧化應(yīng)激壽命 挑取同期化的L4期幼蟲(chóng)到新的各組培養(yǎng)板上（每組4個(gè)平板，每個(gè)平板20條）繼續(xù)干預(yù)5 d，然后轉(zhuǎn)移至含有240μmol/L胡桃醌（先乙醇溶解，再加入培養(yǎng)基）的培養(yǎng)基，每組50條。每天記錄線蟲(chóng)的生存及死亡個(gè)數(shù)，并繪制生存曲線，直至所有線蟲(chóng)死亡。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.9 線蟲(chóng)體內(nèi)ROS及脂褐質(zhì)水平測(cè)定ROS水平測(cè)定：挑取同期化的L4期幼蟲(chóng)到新的各組培養(yǎng)板上（每組4個(gè)平板，每個(gè)平板20條）繼續(xù)干預(yù)5 d后，用M9緩沖溶液沖洗培養(yǎng)基3次，轉(zhuǎn)移到離心管中離心取上清液。吸取50μL上清液和50μL H2DCF-DA避光混勻后，在激發(fā)波長(zhǎng)485 nm、發(fā)射波長(zhǎng)530 nm的熒光顯微鏡下每10 min進(jìn)行1次熒光強(qiáng)度測(cè)定。連續(xù)測(cè)定2 h，并以上清液蛋白質(zhì)濃度進(jìn)行相對(duì)熒光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)化。

脂褐質(zhì)水平測(cè)定：選取同期化的L4期幼蟲(chóng)到新的各組培養(yǎng)板上（每組4個(gè)平板，每個(gè)平板20條）繼續(xù)干預(yù)7 d，用1%疊氮化鈉溶液將其麻醉，隨即轉(zhuǎn)移到2%瓊脂糖凝膠墊片上，然后通過(guò)熒光顯微鏡（激發(fā)波長(zhǎng)365 nm、發(fā)射波長(zhǎng)420 nm），單色數(shù)碼相機(jī)以及Image Pro Plus software獲取熒光圖像。

2.10 體內(nèi)抗氧化酶活性測(cè)定同期化后的線蟲(chóng)生長(zhǎng)到L4期后，將各組線蟲(chóng)轉(zhuǎn)移到NGM培養(yǎng)基上，分別以不同濃度的樣品干預(yù)5 d，用M9緩沖溶液沖洗培養(yǎng)皿并收集各板上的成蟲(chóng)。冷凍研磨后離心，棄上清液，最終制成5%的線蟲(chóng)勻漿，參照相關(guān)試劑盒進(jìn)行SOD、CAT、GSH-Px活力和MDA含量的測(cè)定，并以上清液蛋白質(zhì)濃度進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

2.11 統(tǒng)計(jì)方法實(shí)驗(yàn)均重復(fù)進(jìn)行3次。實(shí)驗(yàn)結(jié)果均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行單因素方差分析并用最小顯著性差異法進(jìn)行多重比較，顯著水平設(shè)置為P＜0.01或P＜0.001。另外，使用GraphPad（Windows 5.00版）軟件進(jìn)行l(wèi)og-rank檢驗(yàn)分析生存曲線顯著性。

3 結(jié)果與分析

3.1 龜鹿二仙膠對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)壽命的影響本研究以蝦青素為陽(yáng)性對(duì)照。有研究表明，蝦青素可有效清除自由基，抑制體內(nèi)過(guò)氧化反應(yīng)，能夠延緩線蟲(chóng)壽命[17-18]。本研究結(jié)果如圖1、表1所示，與空白組相比，不同濃度的龜鹿二仙膠均提高了秀麗隱桿線蟲(chóng)的平均健康壽命。空白組線蟲(chóng)平均壽命為（14.88±1.58）d，陽(yáng)性對(duì)照組線蟲(chóng)的平均壽命為（27.73±5.01）d，而龜鹿二仙膠低劑量組線蟲(chóng)的平均壽命和最長(zhǎng)壽命分別延長(zhǎng)至（18.93±4.20）d和（28.07±5.82）d，其效果與蝦青素陽(yáng)性對(duì)照組相當(dāng)，且與空白組相比形成顯著性差異（P＜0.01），表明龜鹿二仙膠能夠有效地延長(zhǎng)線蟲(chóng)的健康壽命。

表1 龜鹿二仙膠對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)平均壽命和最長(zhǎng)壽命的影響Table 1 Effects of Guilu Erxian Jiao on average and maximum life span of Caenorhabditis elegans（±s）

表1 龜鹿二仙膠對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)平均壽命和最長(zhǎng)壽命的影響Table 1 Effects of Guilu Erxian Jiao on average and maximum life span of Caenorhabditis elegans（±s）

①P＜0.01，與空白組比較

組別空白組龜鹿二仙膠低劑量組龜鹿二仙膠中劑量組龜鹿二仙膠高劑量組陽(yáng)性對(duì)照組中位生存時(shí)間/d 15.00±2.83 18.67±4.50①17.00±2.94 17.67±3.30①18.33±3.86平均壽命/d 14.88±1.58 18.93±4.20①17.17±3.41①16.84±3.18①18.22±3.28最長(zhǎng)壽命/d 23.67±2.70 28.07±5.82①25.80±5.16 25.53±4.36 27.73±5.01

圖1 龜鹿二仙膠對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)壽命的影響Figure 1 Effects of Guilu Erxian Jiao on life span of Caenorhabditis elegans

3.2 龜鹿二仙膠對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)行動(dòng)能力的影響線蟲(chóng)運(yùn)動(dòng)能力與線蟲(chóng)壽命有直接關(guān)系，能夠有效地評(píng)價(jià)機(jī)體的衰老速度[19]。本研究觀察龜鹿二仙膠對(duì)線蟲(chóng)第4、8、12、16天運(yùn)動(dòng)能力的影響，結(jié)果如圖2所示：當(dāng)線蟲(chóng)處于生命早期階段（第4天），空白組、龜鹿二仙膠各劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組均有90%左右的線蟲(chóng)保持在A狀態(tài)；第8天，空白組、龜鹿二仙膠各劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組線蟲(chóng)運(yùn)動(dòng)能力與第4天相比，A狀態(tài)的線蟲(chóng)顯著減少，此時(shí)線蟲(chóng)大部分處于B狀態(tài)；在線蟲(chóng)中晚期階段（第12天），除陽(yáng)性對(duì)照組有6%線蟲(chóng)處于A狀態(tài)，龜鹿二仙膠低、中、高劑量組中分別有80%、90%和83%的線蟲(chóng)保持在運(yùn)動(dòng)B狀態(tài)，與空白組相比分別提高了31%、48%和36%?？梢?jiàn)龜鹿二仙膠可以顯著提高線蟲(chóng)的運(yùn)動(dòng)能力，且濃度在2.5 mg/mL時(shí)其效果最好，進(jìn)一步說(shuō)明龜鹿二仙膠不僅可以延長(zhǎng)線蟲(chóng)壽命還可以提高線蟲(chóng)行動(dòng)力。

圖2 不同濃度龜鹿二仙膠對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)運(yùn)動(dòng)能力的影響Figure 2 Effects of different concentrations of Guilu Erxian Jiao on the motility of Caenorhabditis elegans

3.3 龜鹿二仙膠對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)產(chǎn)卵量的影響線蟲(chóng)通常在L4期的前4 d具有很高的繁殖能力。本研究結(jié)果如圖3-A所示，隨著線蟲(chóng)的衰老，產(chǎn)卵量逐漸降低。龜鹿二仙膠組第2、3天線蟲(chóng)產(chǎn)卵量高于空白組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。如圖3-B結(jié)果顯示，龜鹿二仙膠樣品組總產(chǎn)卵量與空白組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）?？梢?jiàn)龜鹿二仙膠干預(yù)對(duì)線蟲(chóng)的生殖能力沒(méi)有影響，表明龜鹿二仙膠延長(zhǎng)秀麗隱桿線蟲(chóng)壽命并沒(méi)有打破“能量守恒學(xué)說(shuō)”，故其可能不是通過(guò)“飲食限制”來(lái)延長(zhǎng)線蟲(chóng)壽命的[20]。

圖3 龜鹿二仙膠對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)產(chǎn)卵量的影響Figure 3 Effects of Guilu Erxian Jiao on oviposition quantity of Caenorhabditis elegans

3.4 龜鹿二仙膠對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)吞咽頻率的影響結(jié)果如圖4所示，與空白組比較，龜鹿二仙膠低劑量組線蟲(chóng)的吞咽運(yùn)動(dòng)頻率升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），中劑量組和高劑量組線蟲(chóng)的吞咽運(yùn)動(dòng)頻率顯著升高（P＜0.001），表明龜鹿二仙膠加快了線蟲(chóng)的攝食能力，具有一定的抗衰老能力。

圖4 龜鹿二仙膠對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)吞咽頻率的影響Figure 4 The effect of Guilu Erxian Jiao on swallowing frequency of Caenorhabditis elegans

3.5 龜鹿二仙膠對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)應(yīng)激能力的影響如圖5-A所示：與空白組相比較，經(jīng)龜鹿二仙膠干預(yù)后，線蟲(chóng)在37℃熱應(yīng)激壓力下的存活率曲線明顯向右移動(dòng)；此外，與空白組比較，龜鹿二仙膠低劑量組的存活率提高了13%，中劑量組和高劑量組的存活率分別提高了19%和21%。結(jié)果表明，龜鹿二仙膠能明顯增強(qiáng)線蟲(chóng)熱抵抗力，并以劑量依賴(lài)的方式延長(zhǎng)線蟲(chóng)壽命。

繼而檢測(cè)線蟲(chóng)抗紫外脅迫能力，結(jié)果如圖5-B所示，在紫外照射環(huán)境下，龜鹿二仙膠各劑量組線蟲(chóng)存活時(shí)間較空白組延長(zhǎng)，其中，高劑量組（5 mg/mL）線蟲(chóng)存活時(shí)間可達(dá)到216 h，較空白組壽命延長(zhǎng)了73%。

研究[21]表明，胡桃醌能夠使處于其中的線蟲(chóng)在短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生大量的氧自由基，引起氧化應(yīng)激，導(dǎo)致線蟲(chóng)體內(nèi)急性氧化損傷。本研究結(jié)果如圖5-C所示，經(jīng)龜鹿二仙膠樣品干預(yù)后的線蟲(chóng)存活率曲線明顯向右移動(dòng)，低、中、高劑量組存活率較空白組分別提高了36%、44%和56%。

圖5 龜鹿二仙膠對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)應(yīng)激能力的影響Figure 5 The effect of Guilu Erxian Jiao on the stress ability of Caenorhabditis elegans

以上結(jié)果表明，龜鹿二仙膠在熱應(yīng)激、紫外應(yīng)激、胡桃醌應(yīng)激等壓力環(huán)境下均可以延長(zhǎng)線蟲(chóng)壽命，這與根皮素和益智仁對(duì)線蟲(chóng)應(yīng)激能力的影響結(jié)果相一致[22-23]。具體結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同條件對(duì)各組秀麗隱桿線蟲(chóng)應(yīng)激能力的影響Table 2 Effects of different conditions on stress ability in each group of Caenorhabditis elegans

3.6 龜鹿二仙膠對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)脂褐質(zhì)及ROS水平的影響如圖6-A、圖6-B所示，龜鹿二仙膠低、中、高劑量組L4期線蟲(chóng)體內(nèi)脂褐質(zhì)水平較空白組顯著降低（均P＜0.001），且呈劑量依賴(lài)性，其中，高劑量組（5 mg/mL）脂褐質(zhì)水平較空白組降低了65.78%。結(jié)果表明龜鹿二仙膠具有較好地降低線蟲(chóng)體內(nèi)脂褐質(zhì)含量的能力。線蟲(chóng)體內(nèi)ROS隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增多。第5天，各組線蟲(chóng)體內(nèi)ROS水平如圖6-C所示，龜鹿二仙膠低、中、高劑量組的ROS水平較空白組顯著降低（均P＜0.001），表明龜鹿二仙膠可以有效降低線蟲(chóng)體內(nèi)ROS水平，進(jìn)而降低體內(nèi)脂褐質(zhì)的堆積。

圖6 龜鹿二仙膠對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)脂褐質(zhì)及ROS水平的影響Figure 6 Effects of Guilu Erxian Jiao on lipofuscin leveland ROS levelof Caenorhabditis elegans

3.7 龜鹿二仙膠對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)體內(nèi)氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響結(jié)果如圖7所示，與空白組比較，龜鹿二仙膠低、中、高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組線蟲(chóng)體內(nèi)抗氧化應(yīng)激指標(biāo)SOD、CAT和GSH-Px酶活性均顯著升高，其中，高劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。龜鹿二仙膠低、中、高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組線蟲(chóng)體內(nèi)氧化產(chǎn)物MDA含量顯著降低，較空白組分別降低了15.24%、24.69%和30.24%。結(jié)果表明龜鹿二仙膠能夠有效地提高秀麗隱桿線蟲(chóng)體內(nèi)抗氧化能力，減輕氧化損傷，延長(zhǎng)線蟲(chóng)壽命，當(dāng)濃度為5 mg/mL時(shí)，效果更明顯。

圖7 龜鹿二仙膠對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)體內(nèi)氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響Figure 7 Effects of Guilu Erxian Jiao on oxidative stress indexes of Caenorhabditis elegans in vivo

4 討論

中醫(yī)學(xué)對(duì)衰老的研究歷史悠久，中醫(yī)認(rèn)為衰老的主要病機(jī)為陰陽(yáng)失調(diào)、臟腑衰虛、精氣衰竭，常用健脾補(bǔ)氣、養(yǎng)陰補(bǔ)陽(yáng)、補(bǔ)腎填精的中草藥進(jìn)行調(diào)理[24]。龜鹿二仙膠具有滋陰補(bǔ)陽(yáng)、健腎補(bǔ)脾、延緩衰老的功效[7]，但其作用機(jī)制尚不明確。本研究采用秀麗隱桿線蟲(chóng)衰老模型，首次研究龜鹿二仙膠在延長(zhǎng)壽命的同時(shí)對(duì)線蟲(chóng)基礎(chǔ)生理指標(biāo)的影響。

自由基是衰老過(guò)程中最重要的因素之一，高溫會(huì)導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)部代謝紊亂、酶失活以及氧氣傳輸受阻，使機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生大量的活性氧，引起氧化應(yīng)激[20，25]。經(jīng)過(guò)紫外線長(zhǎng)時(shí)間照射，機(jī)體內(nèi)自由基平衡會(huì)被打破，甚至引起蛋白質(zhì)變性和DNA損傷，最終加速衰老[26]。也有研究表明，胡桃醌在線蟲(chóng)體內(nèi)發(fā)生氧化還原反應(yīng)時(shí)會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生大量的自由基，從而引起急性氧化損傷[27]。ROS的過(guò)量堆積不僅會(huì)導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化，產(chǎn)生大量的MDA，還會(huì)破壞蛋白質(zhì)，引起氧化應(yīng)激，因此通過(guò)抑制ROS的積累可以延緩衰老[28]。另外，機(jī)體也會(huì)分泌CAT、SOD和GSH-Px等酶類(lèi)物質(zhì)抑制體內(nèi)ROS的積累，因此，提高線蟲(chóng)體內(nèi)抗氧化酶活性是至關(guān)重要的。提示延緩線蟲(chóng)衰老的作用機(jī)制與抗氧化作用、清除或抑制自由基、增強(qiáng)抗衰老活性和調(diào)控衰老相關(guān)基因等[29]有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，龜鹿二仙膠能夠延長(zhǎng)健康和應(yīng)激條件下線蟲(chóng)的壽命，提高其運(yùn)動(dòng)能力和吞咽頻率以及體內(nèi)SOD、CAT和GSH-Px酶的活性，同時(shí)降低線蟲(chóng)體內(nèi)ROS、脂褐質(zhì)的積累以及MDA含量，故龜鹿二仙膠可能是通過(guò)降低體內(nèi)ROS含量、提高機(jī)體抗氧化酶活性來(lái)降低體內(nèi)氧自由基蓄積，減緩細(xì)胞氧化損傷，進(jìn)而起到延長(zhǎng)壽命的作用。