檳榔多糖多酚對大鼠的亞慢性毒性研究

李 敏，何 寧，張大龍，管 彤，錢智勇

(天津市疾病預防控制中心毒理科，天津 300011)

檳榔(Areca catechu L.)入藥歷史悠久，中醫(yī)常將其用于驅(qū)蟲、消積等[1]，由于檳榔含有生物堿、酚類、多糖、脂肪酸、氨基酸、油脂等多種生物活性成分，被認為具有抗炎、抗氧化、抗疲勞、調(diào)節(jié)血糖、血脂、抗菌、增強免疫力等[2]多種藥用價值。

隨著檳榔提取物的開發(fā)利用逐漸增多，近年來研發(fā)的富含檳榔多糖和多酚的食品層出不窮[3-4]。人們在開發(fā)利用中更多地關注其功效性，而忽視了其安全性。然而天然并不等同于無毒，植物提取物的食用安全性是目前食品安全領域關注的重要問題，目前對于檳榔提取物中多糖多酚食用安全性的研究并無相關報道，因此對其進行毒理學試驗對于檳榔的開發(fā)利用、促進檳榔產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

本研究在檳榔多糖多酚急性經(jīng)口毒性試驗的基礎上，根據(jù)《OECD化學品測試準則408：嚙齒類動物重復90天喂養(yǎng)試驗》[5]、《GB 15193.1-2015 食品安全國家標準：食品安全毒理學評價程序》[6]和《GB 15193.13-2015 食品安全國家標準：90 天經(jīng)口毒性試驗》[7]對檳榔多糖多酚進行了大鼠90 天喂養(yǎng)試驗，旨在了解檳榔多糖多酚對大鼠的亞慢性毒性及其靶器官，為檳榔多糖多酚的食用安全性評價提供必要的毒理學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 受試物

檳榔多糖多酚，淺棕色粉末，由海南某公司提供。其中總多糖含量(以葡萄糖計)為48.2%，總多酚含量(以沒食子酸計)為13.6%，生物堿含量(以氫溴酸檳榔堿計)為3.1%。

1.2 實驗動物與分組

選用4周齡SPF級健康Wistar種大鼠100只，體質(zhì)量82～107 g，雌雄各半，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，合格證號為SCXK(京)2016-0006 11400700326990-6991。屏障環(huán)境動物實驗室溫度20～25 ℃，相對濕度40%～70%，實驗動物使用許可證號為SYXK(津)2014-0001。試驗前大鼠適應性飼養(yǎng)3 d，健康狀況良好。參考本實驗室對檳榔多糖多酚的大鼠急性經(jīng)口毒性結果(雌雄大鼠急性經(jīng)口毒性LD50均為14.7 g/kg)，進行劑量設計。試驗分為染毒期和恢復期，其中染毒期為90 d，恢復期為染毒期后停止染毒并觀察28 d。將實驗大鼠按體質(zhì)量隨機分4 組：0.28和0.83 g/kg 檳榔多糖多酚染毒組(分別相當于1/54 LD50和1/18 LD50)，每組20 只，雌雄各半，染毒90 d后處死；2.5 g/kg 檳榔多糖多酚染毒組(相當于1/6 LD50)和對照組，每組30 只，雌雄各半，其中20 只在染毒90 d 后處死，10 只在染毒90 d 后停止給予受試物，進入恢復期繼續(xù)正常飼養(yǎng)，觀察28 d。受試物用蒸餾水配制，各劑量組灌胃給予受試物，對照組灌胃給予蒸餾水，灌胃容量均按10 mL/kg，每天1 次，連續(xù)90 d。大鼠分籠飼養(yǎng)，自由進食和飲水。飼料由斯貝福(北京)生物技術有限公司提供，實驗大鼠飼料生產(chǎn)許可證號SCXK(京)2015-0015。

1.3 實驗方法和觀察指標

1.3.1 大鼠生長發(fā)育情況觀察實驗期間每天觀察并記錄大鼠的一般表現(xiàn)、精神、行為、活動、毛色及其他中毒癥狀和死亡情況。每周記錄大鼠體質(zhì)量和進食量，并計算食物利用率。

1.3.2 血常規(guī)指標的測定染毒期及恢復期觀察結束后禁食16 h，腹腔注射戊巴比妥鈉(100 mg/kg，購于Sigma 公司)麻醉后腹主動脈取血，15% EDTA-K2 抗凝，全自動模塊式大鼠血液體液分析儀[Sysmex XN-1000V(B1)]檢測血液中紅細胞(RBC)、白細胞(WBC)數(shù)量、血紅蛋白(Hb)含量、血小板(PLT)計數(shù)、紅細胞壓積(HCT)及白細胞分類(中性粒細胞、淋巴細胞、單核細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞)。3.8%檸檬酸鈉抗凝，全自動血凝分析儀(Sysmex CS-5100)測定大鼠血漿活化部分凝血活酶時間(APTT)及凝血酶原時間(PT)。

1.3.3 血生化指標的測定取全血凝集離心后的血清，采用全自動生化分析儀(Toshiba TBA-40FR 型)檢測血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、尿素氮(BUN)、血糖(GLU)、總膽固醇(CHO)、肌酐(CRE)、甘油三酯(TG)、堿性磷酸酶(ALP)、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(GGT)的濃度，離子分析儀(MEDICA-Easylute Plus)測定鈉(Na+)、鉀(K+)、氯(Cl-)的濃度。

1.3.4 尿液指標的測定染毒期及恢復期觀察結束后，代謝籠采集尿液，采用尿液分析儀(長春迪瑞H-500型)檢測尿中潛血、白細胞、亞硝酸鹽、pH、尿膽原、膽紅素、蛋白質(zhì)、葡萄糖、酮體及尿比重。

1.3.5 大體解剖、臟器系數(shù)及組織病理學檢查試驗期間出現(xiàn)死亡或試驗結束時解剖取大鼠腦、垂體、甲狀腺、胸腺、肺、心臟、肝、腎、腎上腺、脾、胃、十二指腸、空腸、回腸、結腸、直腸、胰、腸系膜淋巴結、卵巢、子宮、睪丸、附睪、前列腺、膀胱等進行組織病理學檢查。全部大鼠的腦、心臟、胸腺、肝、腎、腎上腺、脾、卵巢、子宮、睪丸、附睪稱臟器濕質(zhì)量，并以解剖當天大鼠的空腹體質(zhì)量計算各臟器系數(shù)。

1.4 統(tǒng)計學分析

實驗數(shù)據(jù)用SPSS 24.0 進行統(tǒng)計檢驗。計量資料數(shù)據(jù)以表示，染毒期檳榔多糖多酚各劑量組與對照組先進行方差齊性檢驗：如果方差齊，進行單因素方差分析(one way ANOVA)；如果方差不齊，進行非參數(shù)檢驗?；謴推跈壚贫嗵嵌喾?.5 g/kg 組與同期對照組比較采用t檢驗，計數(shù)資料用卡方檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般情況觀察

染毒期間2.50 g/kg 檳榔多糖多酚組雌雄各5 只大鼠于第3 周出現(xiàn)精神欠佳、被毛不順、腹部脹滿、活動減少等癥狀。2.50 g/kg檳榔多糖多酚組雌雄大鼠于染毒期間各死亡2只；恢復期2.50 g/kg 檳榔多糖多酚組雄性大鼠于染毒期間死亡1 只。其余各組未見明顯中毒表現(xiàn)，無死亡大鼠出現(xiàn)?；謴推谟^察期間，未見明顯中毒表現(xiàn)，無死亡大鼠出現(xiàn)。

2.2 體質(zhì)量、進食量及食物利用率

由圖1、圖2可見，試驗期間各組大鼠體質(zhì)量總體呈增長趨勢。染毒期2.50 g/kg檳榔多糖多酚組雄性大鼠第1～13周體質(zhì)量低于對照組，第1周食物利用率低于對照組(P<0.05)。其余各劑量組體質(zhì)量、每周食物利用率與對照組比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

圖1 各組大鼠90天喂養(yǎng)檳榔多糖多酚期間平均體質(zhì)量

圖2 各組大鼠90天喂養(yǎng)檳榔多糖多酚期間平均食物利用率

恢復期2.50 g/kg 檳榔多糖多酚組雄性大鼠第2、3、4、5 周體質(zhì)量低于對照組，第12 周食物利用率低于對照組(P<0.05)。恢復期2.50 g/kg 檳榔多糖多酚組雌性大鼠第5周食物利用率低于對照組(P<0.05)。

2.3 血常規(guī)指標

血常規(guī)檢測結果見表1，染毒期2.50 g/kg 檳榔多糖多酚組雄性大鼠單核細胞百分率高于對照組(P<0.05)。染毒期2.50 g/kg檳榔多糖多酚組雌性大鼠白細胞計數(shù)高于對照組，血小板低于對照組(P<0.05)?；謴推?.50 g/kg檳榔多糖多酚組雌性大鼠嗜酸性粒細胞百分率低于恢復期對照組，且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。其余各項血常規(guī)指標各劑量組與對照組比較，以及恢復期2.50 g/kg檳榔多糖多酚組與恢復期對照組比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表1 檳榔多糖多酚進行大鼠90天經(jīng)口毒性試驗中的血常規(guī)指標檢測結果()

表1 檳榔多糖多酚進行大鼠90天經(jīng)口毒性試驗中的血常規(guī)指標檢測結果()

與染毒期對照組比較，*P<0.05；與恢復期對照組比較，#P<0.05.

2.4 血生化指標

血生化指標檢測結果見表2，染毒期0.28 g/kg 檳榔多糖多酚組雌性大鼠Cl-高于對照組(P<0.05)，2.50 g/kg 檳榔多糖多酚染毒組雌性大鼠TG 低于對照組(P<0.05)，恢復期2.50 g/kg檳榔多糖多酚染毒組雌性大鼠GLU低于恢復期對照組。其余各項血生化檢查指標各劑量組與對照組比較，以及恢復期2.50 g/kg檳榔多糖多酚組與恢復期對照組比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表2 檳榔多糖多酚進行大鼠90天經(jīng)口毒性試驗中的血生化指標檢測結果()

表2 檳榔多糖多酚進行大鼠90天經(jīng)口毒性試驗中的血生化指標檢測結果()

與染毒期對照組比較，*P <0.05；與恢復期對照組比較，#P <0.05.

2.5 尿液指標

尿液分析儀檢測結果見表3，染毒期0.28、0.82 g/kg 檳榔多糖多酚染毒組雌性大鼠尿潛血低于對照組(P<0.05)，其余各劑量組大鼠尿液pH、白細胞、葡萄糖、蛋白質(zhì)、膽紅素、酮體、尿膽原、尿比重、潛血及亞硝酸等10 項指標與對照組比較，以及恢復期2.50 g/kg檳榔多糖多酚組與恢復期對照組比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表3 檳榔多糖多酚進行大鼠90天經(jīng)口毒性試驗中的尿液指標檢測結果

2.6 病理組織學檢查

2.6.1 大體解剖觀察試驗期間死亡的2.50 g/kg檳榔多糖多酚組和恢復期2.50 g/kg檳榔多糖多酚組大鼠于瀕死前解剖，可見胃內(nèi)充滿食糜，胃腸脹氣嚴重，胃腸壁變薄呈透明狀。試驗結束時禁食16 h后解剖大鼠未見胃腸脹氣，恢復期觀察結束后解剖也未發(fā)現(xiàn)大鼠胃腸脹氣等癥狀。其他各組大鼠主要臟器未見明顯病變。

2.6.2 臟器質(zhì)量及系數(shù)由表4、表5 可見，由于染毒期結束時2.50 g/kg 檳榔多糖多酚組雄性大鼠心、肝、腎質(zhì)量均低于對照組(P<0.05)，恢復期2.50 g/kg檳榔多糖多酚組雄性大鼠附睪質(zhì)量低于恢復期對照組(P<0.05)，恢復期2.50 g/kg 檳榔多糖多酚組雌性大鼠心臟質(zhì)量低于恢復期對照組(P<0.05)。其余各劑量組大鼠臟器質(zhì)量及臟器系數(shù)與對照組比較，以及恢復期2.50 g/kg檳榔多糖多酚組與恢復期對照組比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表4 檳榔多糖多酚進行大鼠90天經(jīng)口毒性試驗中的臟器質(zhì)量檢測結果(g，)

表4 檳榔多糖多酚進行大鼠90天經(jīng)口毒性試驗中的臟器質(zhì)量檢測結果(g，)

與染毒期對照組比較，*P<0.05；與恢復期對照組比較，#P<0.05.

表5 檳榔多糖多酚進行大鼠90天經(jīng)口毒性試驗中的臟器系數(shù)的檢測結果(%，)

表5 檳榔多糖多酚進行大鼠90天經(jīng)口毒性試驗中的臟器系數(shù)的檢測結果(%，)

2.6.3 組織病理學檢查通過鏡下觀察，各劑量組與對照組比較，恢復期2.50 g/kg檳榔多糖多酚組與恢復期對照組比較，未發(fā)現(xiàn)檳榔多糖多酚引起試驗大鼠有典型病理組織學改變和特異性損傷改變，主要臟器病理組織學檢查結果見圖3。

圖3 對照組和2.50 g/kg檳榔多糖多酚組雄性大鼠主要臟器病理組織學檢查結果(×400)

3 討論

富含多糖和多酚成分的檳榔提取物，由于其具有多種生物活性，被廣泛開發(fā)和利用。毒理學研究顯示，檳榔具有致癌、致炎癥等毒性作用，引起毒性的成分主要為生物堿[2]。而適量的生物堿具有促進高糖環(huán)境下胰島素分泌，以及潛在的抗血栓、抗動脈粥樣硬化作用[8]。本研究的受試物檳榔多糖多酚是經(jīng)過壓榨提取、去除鞣質(zhì)、去除部分生物堿、殘渣提取和脫水等步驟獲得的檳榔果的有效成分，最終將生物堿含量控制在4%以下，以去除生物堿所帶來的毒性作用[9]。本研究通過大鼠90 天喂養(yǎng)試驗對檳榔多糖多酚的亞慢性毒性進行研究，以期獲得檳榔多糖多酚對機體產(chǎn)生的毒性反應及可能的毒作用靶器官，確定未見毒性反應劑量/觀察到有害作用最小劑量(NOAEL/LOAEL)，為確定人群食用的安全劑量提供參考依據(jù)，也為檳榔的開發(fā)利用提供理論支持。

試驗期間，2.50 g/kg檳榔多糖多酚組雄性大鼠每周平均體質(zhì)量和增加質(zhì)量低于對照組，并且該組雌雄各5 只大鼠于染毒第3 周開始出現(xiàn)被毛不順、腹部脹滿等癥狀，染毒期間2.50 g/kg檳榔多糖多酚組雌、雄大鼠各死亡2只，恢復期2.50 g/kg 檳榔多糖多酚組雄性大鼠于灌胃期間死亡1 只，死亡大鼠均觀察到胃腸脹氣、腸壁變薄。灌胃期結束禁食16 h后、恢復期觀察期間及結束后解剖均未觀察到大鼠胃腸脹氣，考慮停止接觸樣品后癥狀消失。Zhang等[10]研究發(fā)現(xiàn)植物多糖類可在腸道菌群作用下在結腸發(fā)酵，產(chǎn)生大量氣體，本研究中2.50 g/kg檳榔多糖多酚組大鼠可能因食用大量多糖導致胃腸脹氣、進食受限、消化受阻并抑制體質(zhì)量增長，甚至死亡。管彤等[11]采用與本研究相同劑量的檳榔多糖多酚進行大鼠致畸試驗，2.50 g/kg檳榔多糖多酚組同樣觀察到大鼠胃腸脹氣等現(xiàn)象，但未見對大鼠產(chǎn)生致畸效應。恢復期觀察組在90 d染毒期間大鼠生長狀態(tài)與試驗組相同，但在恢復觀察期間，恢復期2.50 g/kg檳榔多糖多酚組雄性大鼠平均每周增加質(zhì)量和每周進食量與恢復期對照組持平或稍有增長，提示檳榔多糖多酚對大鼠生長所造成的影響是可逆的，停止接觸后可恢復。

染毒結束后，2.50 g/kg檳榔多糖多酚組雌雄大鼠白細胞計數(shù)及分類個別指標與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義，但無劑量反應關系，組織病理學檢查也未見相關臟器有炎癥等組織病理學改變，因此不認為這些指標的變化與炎癥相關。

有關檳榔提取物的亞慢性毒性研究中報道過其引起肝腎功能指標的改變[12-13]，可能與檳榔堿相關。本研究中各劑量組肝腎功能血清學、尿液常規(guī)指標與對照組均無統(tǒng)計學差異，且未觀察到相應病理學改變。2.50 g/kg 檳榔多糖多酚組雌性大鼠TG 和GLU 低于對照組，提示檳榔多糖多酚可能具有降低血糖和血脂的功能，尚需進一步的功能學試驗進行驗證。

染毒期和恢復期結束后對所有大鼠進行解剖及稱量主要臟器質(zhì)量，2.5 g/kg 檳榔多糖多酚劑量組大鼠個別臟器質(zhì)量低于對照組，臟器系數(shù)與對照組比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，考慮與2.5 g/kg劑量組大鼠的空腹體質(zhì)量較低有關。另外，組織病理學檢查未發(fā)現(xiàn)檳榔多糖多酚引起試驗大鼠有典型病理組織學改變和特異性損傷改變，因此不認為檳榔多糖多酚能夠?qū)Υ笫笈K器產(chǎn)生影響。綜上，在本試驗條件下，檳榔多糖多酚對Wistar 大鼠經(jīng)口灌胃90 d，未觀察到有害作用劑量(NOAEL)為0.83 g/kg。

隨著檳榔提取物的開發(fā)利用，國內(nèi)外學者對于檳榔提取物的食用安全性研究逐漸增多，主要集中在檳榔堿的毒性、致癌性等方面，而應用廣泛的檳榔多糖多酚的食用安全性研究鮮有報道。本研究通過經(jīng)口灌胃Wistar 大鼠90 d，得到了檳榔多糖多酚的安全劑量范圍，我們也將進一步結合遺傳毒性、生殖發(fā)育毒性等數(shù)據(jù)對檳榔多糖多酚的食用安全性進行全面評價，為檳榔多糖多酚的開發(fā)利用提供數(shù)據(jù)支持和科學依據(jù)。