中華被毛孢作為飼料添加劑在南美白對(duì)蝦養(yǎng)殖中的應(yīng)用

袁慧敏 林嘉敏 鄒佳芮 俞靈軍 鄭永標(biāo) 福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 福州 350117

中華被毛孢（Hirsutella sinensis）是冬蟲(chóng)夏草的無(wú)性型菌絲體階段[1]，適合液體培養(yǎng)，并越來(lái)越多被當(dāng)做保健品使用[2]。據(jù)報(bào)道，中華被毛孢菌絲體具有很多生物活性，如抗腫瘤、抗疲勞、抗氧化、降血糖以及增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能，在治療肺腎虛等方面也有良好的療效[3-6]。目前，通過(guò)液體發(fā)酵培養(yǎng)中國(guó)被毛孢菌絲體來(lái)代替天然冬蟲(chóng)夏草得到了廣泛應(yīng)用[7]，菌絲體作為動(dòng)物飼料添加劑，改善生長(zhǎng)性能及提高免疫力等的作用也逐漸被挖掘。邵紫培等[8]在飼料中添加0.1%和0.2%冬蟲(chóng)夏草菌絲體粉末，發(fā)現(xiàn)肉雞外周血T淋巴細(xì)胞的數(shù)量增加，白細(xì)胞吞噬率得到提高，免疫功能得到增強(qiáng)。趙樂(lè)樂(lè)等[9]用人工培育的冬蟲(chóng)夏草菌絲體（含固體培養(yǎng)基）添加到蘆花雞飼料中，發(fā)現(xiàn)可以促進(jìn)蘆花雞早期的生長(zhǎng)發(fā)育，改善皮膚的黃度品質(zhì)，促進(jìn)蘆花雞的優(yōu)質(zhì)生產(chǎn)。

此前，對(duì)中華被毛孢深層液體發(fā)酵的條件進(jìn)行了優(yōu)化[10]。現(xiàn)采用中華被毛孢液體發(fā)酵優(yōu)化試驗(yàn)所得菌絲體作為南美白對(duì)蝦的飼料添加劑，考察其對(duì)南美白對(duì)蝦生長(zhǎng)性能、免疫能力及抗氧化能力的作用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 中華被毛孢（Hirsutella sinensis）菌絲體由本實(shí)驗(yàn)室制備。南美白對(duì)蝦（Penaeus vannamei）購(gòu)自福清宏峰泰水產(chǎn)養(yǎng)殖公司。南美白對(duì)蝦0號(hào)、1號(hào)餌料購(gòu)自福建大昌生物科技實(shí)業(yè)有限公司。

1.2 對(duì)蝦養(yǎng)殖試驗(yàn)方法 在5 m×3 m×1.5 m的水池中對(duì)幼蝦苗進(jìn)行培育，飼養(yǎng)期間控制水溫為24～29℃，保持水的鹽度為6‰，提供24 h充氧。每天上午、下午各投餌1次，試驗(yàn)開(kāi)始采用0號(hào)餌料進(jìn)行投喂，投餌量為蝦苗總重量的1/10，每日遞增10%；20 d后，選擇體質(zhì)健康、規(guī)格整齊的南美白對(duì)蝦，設(shè)中華被毛孢試驗(yàn)組與對(duì)照組，每組設(shè)3個(gè)平行，進(jìn)行飼養(yǎng)試驗(yàn)。試驗(yàn)組將5%中華被毛孢菌絲體添加到飼料中，加一定量水混合均勻進(jìn)行投喂，對(duì)照組在基礎(chǔ)飼料中加入等量水混勻進(jìn)行投喂。投餌量為蝦苗總重量的1/10，每日遞增10%，每天上午、下午各投餌1次。飼養(yǎng)期間保持水的鹽度為4‰～7‰，水溫控制在23～30℃，提供24 h充氧，飼養(yǎng)試驗(yàn)周期為30 d，結(jié)束后進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)測(cè)定。

1.3 南美白對(duì)蝦生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)定 對(duì)試驗(yàn)前后對(duì)蝦的體重、體長(zhǎng)進(jìn)行準(zhǔn)確測(cè)量，統(tǒng)計(jì)對(duì)蝦存活數(shù)量，經(jīng)脫殼去頭處理后取對(duì)蝦肌肉，按以下公式對(duì)南美白對(duì)蝦的存活率、增重率、出肉率、增長(zhǎng)率和飼料系數(shù)進(jìn)行計(jì)算：存活率=終尾數(shù)/初尾數(shù)×100%；增重率=(終重-初量)/初量×100%；出肉率=肌肉重/總重×100%；增長(zhǎng)率=(終體長(zhǎng)-初體長(zhǎng))/初體長(zhǎng)×100%；飼料利用率=(終量-初重)/喂食餌料總量×100%。

1.4 南美白對(duì)蝦免疫指標(biāo)測(cè)定 酚氧化酶、溶菌酶、堿性磷酸酶及酸性磷酸酶活力都是反映對(duì)蝦免疫能力的重要指標(biāo)，試驗(yàn)結(jié)束后對(duì)這些酶活性進(jìn)行測(cè)定。首先從南美白對(duì)蝦背部抽取血液，冷凍離心后取上層血清，置于-80℃保存，分別測(cè)定酚氧化酶和溶菌酶的活力；接著取出對(duì)蝦肝胰腺，測(cè)定酸性磷酸酶、堿性磷酸酶的活力。

1.4.1 溶菌酶活力測(cè)定 首先配制0.1 mol/L磷酸鉀鹽緩沖液，調(diào)pH為6.4，用該緩沖液配制溶壁微球菌 （Micrococcus lysoleiklicus）的凍干菌粉懸液（OD570nm≈0.3），冰浴備用，取該懸液600 uL，加入10 uL血清，混勻，測(cè)量吸光值（計(jì)為A0），37℃水浴條件下反應(yīng)30 min后，測(cè)量吸光值（計(jì)為Ae），測(cè)量溶菌酶活力（U）=（A0-Ae）/Ae。

1.4.2 酚氧化酶活力測(cè)定 配制濃度為0.1 mol/L磷酸鉀鹽緩沖液，調(diào)pH為6.0，再配制濃度為0.01 mol/L的L-dopa，分別取1 mL、30 uL在室溫下混勻，酶標(biāo)儀測(cè)量，在OD490nm讀數(shù)1 h，2 min/次。

1.4.3 堿性磷酸酶和酸性磷酸酶活力測(cè)定 采用檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程研究所）進(jìn)行測(cè)定。

1.5 南美白對(duì)蝦抗氧化指標(biāo)測(cè)定 超氧化物歧化酶、過(guò)氧化物酶活力及肌肉中丙二醛含量等抗氧化指標(biāo)采用檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程研究所）進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 中華被毛孢對(duì)南美白對(duì)蝦生長(zhǎng)性能的影響試驗(yàn)所得南美白對(duì)蝦存活率、增長(zhǎng)率、增重率、出肉率結(jié)果見(jiàn)表1，中華被毛孢試驗(yàn)組的生長(zhǎng)性能相對(duì)于對(duì)照組都有所提高，對(duì)蝦增重率顯著提高30%，飼料系數(shù)、存活率差異性顯著（P＜0.05），存活率提高了52%，而飼料系數(shù)降低了66%，說(shuō)明中華被毛孢菌絲體對(duì)南美白對(duì)蝦的生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用。

表1 南美白對(duì)蝦的生長(zhǎng)指標(biāo)

2.2 中華被毛孢對(duì)南美白對(duì)蝦免疫能力的影響溶菌酶能夠有效殺菌，酚氧化酶幫助傷口愈合、抑制和殺死病原體，而酸性磷酸酶、堿性磷酸酶廣泛存在于動(dòng)物體內(nèi)，是重要的解毒體系，是反映甲殼動(dòng)物免疫水平的指標(biāo)酶。根據(jù)表2結(jié)果分析，中華被毛孢試驗(yàn)組南美白對(duì)蝦血液中的溶菌酶活力、酚氧化酶活力分別提高了62.7%、23.9%，堿性磷酸酶、酸性磷酸酶活性分別提高了11.4%、7.85%，相對(duì)于對(duì)照組差異顯著（P＜0.05），表明中華被毛孢菌絲體使南美白對(duì)蝦的免疫力有所提高。

表2 南美白對(duì)蝦的免疫指標(biāo) U/mg

2.3 中華被毛孢對(duì)南美白對(duì)蝦抗氧化能力的影響試驗(yàn)所得南美白對(duì)蝦的各個(gè)抗氧化指標(biāo)見(jiàn)表3，結(jié)果表明，中華被毛孢組的過(guò)氧化氫酶和超氧化物歧化酶的活力相對(duì)于對(duì)照組差異顯著（P<0.05），過(guò)氧化氫酶、過(guò)氧化物酶、超氧化物歧化酶活力比對(duì)照組分別提高了324.2%、23.4%、35%，而丙二醛含量明顯降低。過(guò)氧化物酶和超氧化物歧化酶能夠有效分解機(jī)體代謝產(chǎn)生的活性氧自由基，丙二醛含量可以反映機(jī)體過(guò)氧化程度，說(shuō)明中華被毛孢作為飼料添加劑能夠增強(qiáng)南美白對(duì)蝦的抗氧化作用。

表3 南美白對(duì)蝦的抗氧化指標(biāo)

3 討 論

抗生素曾被廣泛應(yīng)用于畜牧和水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)上，用來(lái)治療和預(yù)防各種養(yǎng)殖動(dòng)物的疾病。但抗生素的廣泛應(yīng)用導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性的出現(xiàn)，如在水產(chǎn)養(yǎng)殖生物體和環(huán)境中能夠檢測(cè)到抗生素抗性基因[11]。2004年，根據(jù)“預(yù)防原則”，歐盟委員會(huì)決定禁止抗生素生長(zhǎng)促進(jìn)劑[12]。近年來(lái)，世界各國(guó)也逐漸意識(shí)到抗生素濫用的危害，許多發(fā)達(dá)國(guó)家開(kāi)始采用無(wú)抗養(yǎng)殖方法。2020年，中國(guó)飼料行業(yè)停止對(duì)含有促生長(zhǎng)添加劑（中草藥除外）飼料的生產(chǎn)，中國(guó)開(kāi)始進(jìn)入“禁抗”養(yǎng)殖。這些禁令對(duì)動(dòng)物養(yǎng)殖產(chǎn)生了巨大的影響，尋找能夠替代抗生素且安全無(wú)害并促進(jìn)牲畜高效養(yǎng)殖的飼料添加劑，成為新的研究熱點(diǎn)。

食藥用菌含有多糖、黃酮、萜類(lèi)、生物堿、甾醇類(lèi)、蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、維生素以及多酚化合物等多種營(yíng)養(yǎng)及藥用化學(xué)成分[13-14]，是飼料添加劑的主要來(lái)源，目前靈芝、銀耳、猴頭菇、金針菇以及蟲(chóng)草等品種在飼料添加劑上的應(yīng)用都取得一定進(jìn)展。文貴輝等[15]研究發(fā)現(xiàn)，育肥豬飼糧中添加0.2%靈芝細(xì)胞外多糖，可以顯著改善育肥豬生長(zhǎng)性能、血液指標(biāo)和免疫功能。彭彥淳等[16]研究表明，以0.3%的比例將靈芝液體發(fā)酵物添加到飼料中，可提高抗氧化能力和免疫功能，促進(jìn)肉雞優(yōu)質(zhì)生產(chǎn)。薛瑞婷等[17]為了研究銀耳多糖對(duì)斷乳仔豬腸道健康的調(diào)節(jié)作用，以0.3%的比例添加到飼料中，結(jié)果表明銀耳多糖可以提高仔豬腸道消化酶的活性，改善消化能力，促進(jìn)腸道菌群平衡。文敏等[18]研究發(fā)現(xiàn)，以0.4%的比例將銀耳孢子發(fā)酵物添加到生長(zhǎng)肥育豬的飼料中，可以增強(qiáng)其各個(gè)生長(zhǎng)階段的免疫機(jī)能，肉質(zhì)也得到明顯提升。陳景杰[19]研究發(fā)現(xiàn)，猴頭菇多糖對(duì)斷乳仔豬的生長(zhǎng)具有一定的促進(jìn)作用，可以提高其抗氧化能力、腸道通透性及免疫能力。郭志欣[20]研究發(fā)現(xiàn)，金針菇菇腳中的多糖可以顯著提高七彩鮭幼魚(yú)的抗氧化能力和免疫力，調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)和改善生長(zhǎng)性能。王軼群等[21]研究發(fā)現(xiàn)，以30 g/頭·d的量將蟲(chóng)草類(lèi)真菌發(fā)酵物添加到泌乳中期荷斯坦乳牛的飼料中，經(jīng)過(guò)70 d試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，可顯著提高乳牛乳糖率、非脂乳固體物含量，改善牛乳品質(zhì)。朱艷芝等[22]在海蘭褐蛋雞產(chǎn)蛋后期的飼料中添加0.01%和0.02%蟲(chóng)草多糖，發(fā)現(xiàn)可以改善腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)，降低料蛋比，當(dāng)添加0.02%蟲(chóng)草多糖時(shí)，蛋雞平均日產(chǎn)蛋率可顯著提高。以上研究表明，食藥用菌的多糖等成分可以有效改善動(dòng)物的生長(zhǎng)性能、提高免疫力及改善腸道健康，是較好的飼料添加劑來(lái)源。

本研究將中華被毛孢菌絲體以5%比例添加到南美白對(duì)蝦飼料中，可顯著改善生長(zhǎng)性能，增強(qiáng)免疫能力和抗氧化能力，是對(duì)蝦健康養(yǎng)殖飼料添加劑的一種選擇，但對(duì)其作用機(jī)理和活性成分還有待進(jìn)一步研究。