競(jìng)爭(zhēng)ELISA法檢測(cè)布病終止反應(yīng)后影響OD值的因素探討

吳 蔚 南平市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 福建南平 354200

布病，即布魯氏菌病，是由布魯氏菌引起的急性或慢性人畜共患病，廣泛流行于世界許多國(guó)家，被我國(guó)列為二類動(dòng)物疫病。該病主要侵害動(dòng)物的生殖器官，引起家畜不育、流產(chǎn)等。獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室對(duì)布病抗體的檢測(cè)有許多方法，如虎紅平板凝集試驗(yàn)、試管凝集試驗(yàn)、競(jìng)爭(zhēng)ELISA試驗(yàn)等[1]。競(jìng)爭(zhēng)ELISA法在實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)中以精準(zhǔn)、方便、快速、高通量獨(dú)占優(yōu)勢(shì)[2]，2018年已被列入國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。而在競(jìng)爭(zhēng)ELISA法檢測(cè)過(guò)程中，有很多需要注意的步驟，但在終止反應(yīng)后這一階段最容易被檢測(cè)人員忽略[3]。本文就這一步驟中可能影響試驗(yàn)結(jié)果的因素（氣泡、放置時(shí)間等）進(jìn)行初步探討。

1 材料與方法

1.1 樣本與試劑 經(jīng)過(guò)虎紅平板凝集試驗(yàn)初篩后抗體為陰性的牛、羊血清各4份；布魯氏菌病競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)試劑盒（北京中海生物），試劑盒內(nèi)的抗體陰性血清、陽(yáng)性血清。

1.2 儀器 微量移液器、純水儀、生化培養(yǎng)箱、酶標(biāo)儀。

1.3 方法

1.3.1 終止反應(yīng)前的試驗(yàn)操作 將牛、羊血清（各4份，共計(jì)8份）以及陰性、陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)血清（各1份，共計(jì)2份）作為待檢血清按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)設(shè)置陰性、陽(yáng)性對(duì)照（各2孔），具體步驟大致為：在包被板上加樣 （50μL/孔）、加酶標(biāo)二抗（50μL/孔）以及抗體工作液（100μL/孔），蓋板，37℃避光溫育；洗板4次，加入底物（100μL/孔），蓋板，37℃避光溫育10 min，加入終止液。

1.3.2 終止反應(yīng)后的試驗(yàn)操作 在加入終止液終止反應(yīng)后，立即用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)450 nm下測(cè)定各反應(yīng)孔的吸光度OD值，之后用微量移液器將各反應(yīng)孔快速打出氣泡，測(cè)定其吸光度OD值，然后再用吸頭戳破氣泡，15 min再次測(cè)定各反應(yīng)孔中的吸光度OD值。

2 結(jié) 果

由表1可見(jiàn)，在同一個(gè)反應(yīng)孔中若產(chǎn)生氣泡，其OD值增大；隨著時(shí)間延長(zhǎng)，其OD值也變大。而在戳破氣泡靜置15 min后反應(yīng)孔OD值反而小于之前有氣泡時(shí)的OD值。

表1 不同處理后各樣本OD值

將打出氣泡的樣本OD值、戳破氣泡靜置15 min的樣本OD值分別與樣本初始（無(wú)氣泡）OD值作配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2。t值分別為-4.701、-5.778；P（Sig.）分別為0.001、0.000，均小于0.05，差異顯著。

表2 不同處理的配對(duì)樣本t檢驗(yàn)

3 討 論

本試驗(yàn)探討了競(jìng)爭(zhēng)ELISA法檢測(cè)布病抗體時(shí)在試驗(yàn)終止階段可能出現(xiàn)影響結(jié)果的因素，在用該方法檢測(cè)前已使用虎紅平板凝集試驗(yàn)對(duì)樣品做過(guò)初篩，結(jié)果均為陰性?？紤]到需要抗體陽(yáng)性作對(duì)比，因此，用試劑盒中的陽(yáng)性對(duì)照，即多做一孔作為陽(yáng)性孔進(jìn)行對(duì)比。

結(jié)果表明，無(wú)論是陰性還是陽(yáng)性的反應(yīng)孔，在加終止液后，反應(yīng)孔內(nèi)若存有氣泡，會(huì)使得該孔的吸光度OD值明顯變大，從而影響結(jié)果的判定。產(chǎn)生氣泡的原因有很多，在移液或洗板階段均有可能發(fā)生。因此，移液時(shí)應(yīng)盡量準(zhǔn)確，用力均勻，不要過(guò)快、過(guò)猛帶入空氣導(dǎo)致氣泡的產(chǎn)生；洗板階段，洗滌結(jié)束后也應(yīng)在吸水紙上拍干，避免氣泡殘留。若反應(yīng)孔出現(xiàn)氣泡，要及時(shí)處理，可用微量移液器的吸頭將其戳破。終止反應(yīng)后，隨著放置時(shí)間延長(zhǎng)，會(huì)增加反應(yīng)孔的OD值，但在戳破氣泡靜置15 min后的反應(yīng)孔OD值反而小于之前有氣泡時(shí)的OD值，說(shuō)明放置時(shí)間對(duì)OD值的影響稍小于存有氣泡。本試驗(yàn)采用的試劑盒要求在終止反應(yīng)的5 min內(nèi)測(cè)定結(jié)果，但本試驗(yàn)在15 min后測(cè)定的結(jié)果仍滿足試驗(yàn)成立的條件。一般的ELISA檢測(cè)中，要求加入終止液的15 min內(nèi)測(cè)定樣品OD值，最好是加完終止液混勻后馬上測(cè)定，這是由于在加入終止液后，顯色劑在光的作用下有時(shí)仍然會(huì)出現(xiàn)非特異顯色，造成誤差。因此，在日常的ELISA試驗(yàn)過(guò)程中，最好提前（15 min以上）做好酶標(biāo)儀的開(kāi)機(jī)預(yù)熱與調(diào)試工作，以免終止反應(yīng)后不能及時(shí)讀數(shù)，導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)偏差。