擴張型心肌病心臟移植患者全外顯子測序分析

武 瓊， 劉 濤， 魏 兵， 安 然

北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院1. 新生兒科；2. 心血管外科，遼寧 沈陽110016

擴張型心肌病(dilated cardiomyopathy，DCM)是 一種以左心室或雙心室擴大伴心臟收縮功能降低為典型特征的原發(fā)性心肌病，臨床主要表現(xiàn)為慢性心力衰竭、心律失常、附壁血栓形成及心源性猝死。美國的一項流行病學調(diào)查顯示，在歐美人群中，DCM 的年患病率為36.5/10 萬人[1]。 近年來，隨著血管緊張素轉換酶抑制劑、β 受體阻滯劑、植入型心律轉復除顫器和心臟移植等治療措施的不斷應用，DCM 患者的生存質(zhì)量不斷改善，但仍有較高的病死率[2-5]。 Haas 等[6]研究報道，DCM 占所有心力衰竭患者的30% ~40%，是心臟移植的主要原因。DCM 可歸因于遺傳和非遺傳原因，遺傳原因占所有DCM 患者的30% ~50%[6]，常染色體顯性遺傳是主要的遺傳方式。 非遺傳原因包括高血壓、瓣膜疾病、心肌炎、遺傳代謝病和神經(jīng)肌肉疾病等，但這些非遺傳形式的心肌病也可能受個人遺傳特征的影響。 全外顯子測序技術的發(fā)展使人類遺傳學和基因組學進入臨床研究的新時代[7]。 本研究采集DCM 心臟移植患者的靜脈血DNA 進行全外顯子基因測序，結合生物信息學分析，旨在探索與DCM 發(fā)生密切相關的突變基因，并分析其與臨床特征的相關性。 現(xiàn)報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象 回顧性分析自2016 年9 月至2020 年9 月就診于北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院心血管外科的6 例DCM 心臟移植患者的臨床資料。 患者均符合《中國擴張型心肌病診斷和治療指南》[8]中DCM 的診斷標準。 6 例患者的一般資料見表1。 本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準[倫審K(2020)29 號]。

表1 6 例患者一般資料

1.2 全外顯子測序 采集患者靜脈血約2 ml，經(jīng)EDTA 抗凝，離心后于-80℃冰箱保存，高通量測序法進行全外顯子基因測序。 使用DNA 血液檢測試劑盒提取血液DNA。 通過1%瓊脂凝膠電泳評估DNA 的降解程度以及是否有RNA、蛋白質(zhì)污染，進而評估DNA 的完整性。 對所有DNA 樣本進行定量，總量＞250 ng 可用來建庫。 將DNA 隨機剪切到200 bp 的平均片段大小，使用AMPureXP 磁珠提純碎片以除去小產(chǎn)物。 片段化后的DNA 經(jīng)過3 個酶解步驟:末端修復、A-拖尾和與Illumina 成對末端索引接頭的連接，通過PCR 擴增進行樣本標記并富集DNA，用Qubit 2.0 熒光光度計進行定量檢測。將帶有生物素標記的RNA 探針與特異片段文庫進行液相雜交，再通過帶有鏈酶親和素標記的磁珠獲取目標基因外顯子，進而用PCR 擴增進行目標基因的富集。 測量DNA 濃度，文庫濃度＞25 ng/μl 參考為合格文庫。 使用Agilent 的2100 生物分析儀分析捕獲的文庫，文庫主峰在220 ~320 bp，主峰前后無雜峰。 文庫構建完成后，使用Qubit 3.0 進行定量，然后用NovaSeq 6000 平臺進行PE150 測序，產(chǎn)生2 ×150 bp 的成對末端讀數(shù)。

1.3 生物信息學分析 使用GATK 分析基因突變位點，并用ANNOVAR 注釋。 在CLNDN、HGMD_Phenotype、KEGG、OMIN_disease、HPO、HGMD 數(shù)據(jù)庫篩選關鍵詞“DCM”，將發(fā)現(xiàn)的致病基因位點與其進行比對。 通過千人基因組 2015 年版(1000g2015aug)、 ExAC 數(shù) 據(jù) 庫、 gnomAD exome人群基因突變頻率數(shù)據(jù)庫篩選，保留“未收錄”及人群突變頻率≤0.05 的突變。 采用GERP ＋＋RS 軟件對核苷酸序列進行保守性分析，分值＞2 代表突變基因位點具有保守性，分值越高表明核酸的保守性越高。 采用Mutation Taster、Fathmm MKL 在線預測軟件及CADD 評分評估蛋白質(zhì)的致病性。 Mutation Taster 用于預測內(nèi)含子和非同義突變、移碼突變對基因功能的影響，分值越大結果越可靠，預測結果取值為D:Disease causing(有害)；N:Polymorphism(無害)。 Fathmm MKL 軟件的預測分值越小越有害，預測結果取值為D:Deleterious(有害)；T:Tolerated(無害)。 采用CADD 評分評估單核苷酸位點突變的有害性，CADD 值越高，該突變位點是一個有害突變的概率越高，CADD 分值＞15 為有害突變。 應用InterVar 軟件對篩選的基因突變位點進行美國醫(yī)學遺傳學與基因組學學會(The American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG)評級。

2 結果

2.1 全外顯子測序結果 全外顯子測序共篩選出3 個與DCM 相關的基因突變位點。 (1) 患者2 發(fā)現(xiàn)PSEN2 基因在chr1:227078985 位置發(fā)生錯義突變，導致編碼的第298 號氨基酸由蛋氨酸變異為蘇氨酸。 (2)患者3 發(fā)現(xiàn)MYBPC3 基因在chr11:47364625 位置發(fā)生錯義突變，導致編碼的第433 號氨基酸由丙氨酸變異為甘氨酸。 (3)患者4 發(fā)現(xiàn)LMNA 基因在chr1:156104248 位置發(fā)生錯義突變，導致編碼的第190 號氨基酸由精氨酸變異為色氨酸。 見表2。

2.2 突變位點致病性評估結果 LMNA 及MYBPC3 基因突變位點在人群突變數(shù)據(jù)庫中為未收錄位點，PSEN2 基因突變位點在人群數(shù)據(jù)庫中的最高突變頻率為0.000 008 15。 經(jīng)GERP ＋＋RS 軟件預測，3 個突變基因位點均具有保守性。 經(jīng)Mutation Taster 軟件、Fathmm-MKL 軟件預測及CADD 評分，3 個基因突變位點均具有致病性。 經(jīng)ACMG 評級，LMNA Arg190Trp 突變?yōu)榭赡苤虏〉耐蛔?，MYBPC3 Ala433Gly 突變及PSEN2 Met298Thr 突變?yōu)榕R床意義未明的突變。 見表3。

表2 篩選基因突變位點的具體信息

表3 基因突變位點突變頻率及在線軟件預測結果

3 討論

分子遺傳學研究表明，基因突變與DCM 發(fā)病機制、臨床表型及預后等高度相關[9]。 目前研究發(fā)現(xiàn)，有40 多個基因與DCM 相關，這些基因分別編碼細胞骨架、心肌結構蛋白、離子通道蛋白、線粒體和RNA 結合蛋白等[10]。 LMNA 基因突變是家族性DCM 的第二大常見病因，發(fā)生于5% ~13%的特發(fā)性DCM 患者中[11]。 LMNA 基因編碼的核纖層蛋白A 和C，可以維持細胞核核膜的穩(wěn)定及核孔的形成，在肌動蛋白和細胞外基質(zhì)的連接中起機械傳導的作用[12]。 功能研究表明，與野生型蛋白相比，LMNA 變異體改變了蛋白的粘彈性，降解速率更快，并形成了更多的蛋白質(zhì)聚集體[13-14]。 該突變位點ACMG 評級為可能致病的突變(致病證據(jù):PM1 ＋PM2 ＋PP3 ＋PP5)，在ClinVar 網(wǎng)站中被報告為致病性突變(變異ID:66908)。

LMNA 基因突變的患者常在未診斷DCM 前便出現(xiàn)了有癥狀的傳導系統(tǒng)疾病或心律失常，診斷DCM 后常伴有嚴重心力衰竭、左室壁血栓形成或心源性猝死，但心源性猝死的患者一般伴有輕微的收縮功能障礙或無收縮功能障礙[15]。 因此，歐洲心臟病學會指南建議，對于具有LMNA 突變的DCM患者，即使心臟收縮功能正常，也應考慮植入型心律轉復除顫器治療(Ⅱa 類推薦)[16]。 本研究中，LMNA 基因突變患者伴有心房顫動及右束支傳導阻滯，心功能較差，在38 歲接受了心臟移植手術，這與現(xiàn)有的LMNA 基因型與DCM 臨床表型相關的研究結論相符，且患者父親具有心臟擴大病史，不能排除家族性DCM 的可能。 有研究報道，LMNA相關的DCM 患者表現(xiàn)出與年齡相關的外顯率，70 歲時外顯率可達90% ~95%[15]，因此建議患者家系成員進行該基因位點的篩查，對無癥狀基因突變攜帶者的心臟功能進行長期的隨訪篩查。

MYBPC3 基因編碼的心肌肌球蛋白結合蛋白C，在肌節(jié)A 帶中橫向排列，在粗肌絲中結合肌球蛋白重鏈，在細肌絲中結合肌動蛋白，該蛋白的磷酸化對于心肌肌節(jié)的收縮起調(diào)節(jié)作用。 MYBPC3基因突變與DCM 相關研究較少，多在肥厚性心肌病家系中被報道。 Daehmlow 等[17]報道了1 例DCM男性患者的MYBPC3 錯義突變(Asn948Thr)。 本研究發(fā)現(xiàn)了 1 例新的 MYBPC3 錯義突變(Ala433Gly)，ACMG 評級為臨床意義未明的突變(致病證據(jù):PM1 ＋PM2 ＋PP3)，需進一步獲取患者家系成員的基因位點信息以提升ACMG 評級的證據(jù)等級。 目前尚缺乏MYBPC3 基因突變與DCM 臨床表型相關聯(lián)的研究，僅有Dhandapany 等[18]分析了南亞人群心肌病患者MYBPC3 基因中25 bp 的缺失，確定了MYBPC3 基因突變與心力衰竭風險增加相關。 而本研究中MYBPC3 基因突變患者心力衰竭癥狀較重，在接受心臟起搏器治療后心功能難以維持，最終接受心臟移植治療。

PSEN2 編碼早老素2，是影響γ-分泌酶活性的重要決定因素，負責淀粉樣前體蛋白和NOTCH 受體蛋白的蛋白水解切割，被證實為3 型阿爾茲海默病的突變基因。 Li 等[19]對315 例DCM 患者的PSEN1 和PSEN2 基因序列進行了評估，在兩個DCM 家系分別中發(fā)現(xiàn)了一個新的PSEN1 錯義突變(Asp333Gly)和一個PSEN2 錯義突變(Ser130Leu)，并證實來自PSEN1 和PSEN2 突變攜帶者的成纖維細胞中的鈣信號發(fā)生了改變。 而本研究發(fā)現(xiàn)了1 例新的PSEN2 錯義突變(Met298Thr)，ACMG 評級為臨床意義未明的突變(致病證據(jù):PM1 ＋PM2 ＋PP3)。 由于目前對于PSEN2 基因與DCM 的相關研究較少，仍需大樣本的臨床研究及功能驗證進一步得到更準確的結論。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)了1 例DCM 的熱點突變LMNA Arg190Trp，2 例臨床意義未明的基因突變位點MYBPC3 Ala433Gly 及PSEN2 Met298Thr，需要進一步對患者家系成員進行基因篩查，同時進行功能試驗，對基因位點的致病性進行驗證。