響應(yīng)面優(yōu)化金槍魚骨膠原肽提取工藝

舒聰涵，孫繼鵬，王家星，廖妙飛，鄭斌，周宇芳*

（1.浙江省海洋開發(fā)研究院，浙江 舟山 316021；2.浙江海洋大學(xué)，浙江 舟山 316022）

將動物的皮、骨或明膠通過水解降解為小分子肽段，當其單條肽鏈的組成在兩個氨基酸以上且分子量小于10 kDa時，可以稱為膠原肽[1]，膠原肽由膠原衍生而來，也稱為水解膠原。研究表明，攝入某些膠原水解物具有促進健康的作用，其除了擁有膠原所有性質(zhì)外，還具有多種生物活性[2]，如降血壓、抑菌、抗腫瘤等[3-6]。此外，相較于陸生動物膠原蛋白，海洋生物蛋白具有低過敏性、低抗原性等優(yōu)勢[7]。

金槍魚是一種大洋暖水性高度洄游魚類，屬硬骨魚綱鱸形目鯖科[8]。作為一種深海魚類，金槍魚營養(yǎng)價值高、肉質(zhì)鮮美、無污染，頗受市場歡迎，其加工產(chǎn)業(yè)也因此發(fā)展迅速。但在加工過程中會伴隨著大量副產(chǎn)物的產(chǎn)生，通常被隨意丟棄或是直接加工成低值飼料，既浪費資源又污染環(huán)境。金槍魚魚骨約占副產(chǎn)物20%[9]，其蛋白含量豐富，約為57.2%[10]，將它作為提取膠原肽的原材料，可以提高金槍魚骨的利用價值。因此本研究以金槍魚骨為原料，采用酶解法制備骨膠原肽，以水解度為指標，從5種商用蛋白酶中篩選出最佳蛋白酶，并通過單因素、響應(yīng)面試驗優(yōu)化酶解工藝，以期為金槍魚骨附加值的提高提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃鰭金槍魚骨：浙江融創(chuàng)食品工業(yè)有限公司；胃蛋白酶（2 000 U/g）：華懋雙匯實業(yè)公司生物化學(xué)制藥廠；食用小蘇打：河南恩苗食品有限公司；動物蛋白酶（10萬 U/g）、骨蛋白酶（10萬 U/g）、海產(chǎn)品水解酶（10萬 U/g）：南寧東恒華道生物公司；中性蛋白酶（5萬U/g）：河南仰韶生化工程有限公司；風(fēng)味蛋白酶（1.5萬U/g～1.7萬U/g）：浙江一諾生物科技有限公司；甲醇、乙腈（均為色譜純）：美國TEDIA公司；氨基酸標準品、鄰苯二甲醛、氯甲酸芴甲酯（均為色譜純）：美國Sigma公司；三乙胺、四氫呋喃、結(jié)晶乙酸鈉、三氯乙酸、鹽酸、氫氧化鈉、甲醛（均為分析純）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

KDN816凱氏定氮儀：上海纖檢儀器有限公司；710401040冷凍干燥機：美國Labconco公司；YSF-20L雙層玻璃反應(yīng)釜：鞏義市予華儀器有限公司；CeraMem-0100卷式膜多功能小試設(shè)備：廈門世達膜科技有限公司；Agilent 1100高效液相色譜儀：美國安捷倫科技公司。

1.3 方法

1.3.1 金槍魚骨粉的制備

從-20℃冰箱中取出魚骨，流水解凍15 min左右，刷子清洗表面后去除多余碎肉，并用剪刀將魚骨剪成2 cm左右小段；稱重后，加入2%胃蛋白酶，調(diào)節(jié)pH值為3.0，在55℃條件下對無法去除的碎肉酶解3 h；用滅菌鍋120℃蒸煮30 min，去除油脂，瀝干；添加2%食用小蘇打進行脫色，2 h后多次用自來水沖洗至中性；55℃烘箱烘干12 h；將魚骨用粉碎機粉碎后過20目篩，得到成品魚骨粉。

1.3.2 篩選最佳水解用酶

稱取魚骨粉10 g，加入100 mL去離子水，分別添加1.0%的動物蛋白酶、中性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、骨蛋白酶和海產(chǎn)品水解酶，酶解條件見表1。酶解結(jié)束后沸水浴滅酶15 min，離心取上清液測水解度。通過比較水解度的高低，選擇酶解效果最佳的蛋白酶。

表1 不同蛋白酶的酶解條件Table 1 Enzymatic hydrolysis conditions of different proteases

酶解液中的游離氨基酸態(tài)氮含量采用甲醛滴定法測定[11]。原料中總氮含量采用GB 5009.5—2016《食品安全國家標準食品中蛋白質(zhì)的測定》中的凱氏定氮法測定，取3次平行測量的平均值。用下列公式計算水解度。

1.3.3 酶解條件單因素試驗

選擇1.3.2篩選出的水解度最佳的酶對金槍魚骨進行酶解，固定溫度50℃、自然pH值、時間6 h、料液比 0.10∶1（g/mL），考察不同酶添加量（0.5%、1.0%、2.0%、3.0%）對水解度的影響；固定酶添加量、溫度50 ℃、自然 pH 值、料液比0.10∶1（g/mL），考察不同酶解時間（2、4、6、8、10 h）對水解度的影響；固定酶解時間、酶添加量、溫度50℃、自然pH值，考察不同料液比[0.04 ∶1、0.06 ∶1、0.08 ∶1、0.10 ∶1、0.12 ∶1（g/mL）]對水解度的影響；固定料液比、酶解時間、酶添加量、自然pH 值，考察不同溫度（40、45、50、55、60 ℃）對水解度的影響；固定酶解溫度、料液比、酶解時間和酶添加量，考察不同 pH 值（6.5、7.0、7.5、8.0、8.5）對水解度的影響。

1.3.4 酶解條件響應(yīng)面優(yōu)化

在單因素試驗基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken組合試驗設(shè)計原理，考察酶添加量（A）、酶解時間（B）、料液比（C）、溫度（D）、pH值（E）這5個因素對水解度的影響，各取3個水平進行響應(yīng)面試驗，試驗因素水平見表2。

表2 金槍魚骨酶解工藝的響應(yīng)面因素和水平Table 2 Response surface factors and levels of enzymatic hydrolysis of tuna bone

1.3.5 金槍魚骨膠原肽的游離氨基酸組成測定

在反應(yīng)釜中對金槍魚骨進行酶解，酶解條件為1.3.4優(yōu)化得到的最優(yōu)工藝，酶解結(jié)束后90℃滅酶0.5 h，離心棄沉淀，上清液即為金槍魚骨膠原肽酶解液。將酶解液過卷式膜多功能小試設(shè)備進行分子量分級，得到不同分子級的金槍魚骨膠原肽。

用三氯乙酸沉淀不同分子級的金槍魚骨膠原肽后，分別以鄰苯二甲醛和氯甲酸芴甲酯作為一級和二級氨基酸的衍生反應(yīng)試劑，參考GB/T 22729—2008《海洋魚低聚肽粉》中的柱前自動衍生化反相高效液相色譜法測定骨膠原肽中的游離氨基酸總量。

1.3.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示，單因素試驗利用Excel軟件進行分析，利用Origin 8.0軟件進行繪圖，響應(yīng)面試驗利用Design Expert 8.0軟件進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳酶篩選結(jié)果

5種蛋白酶的水解度比較結(jié)果見圖1。

圖1 5種蛋白酶的水解度比較Fig.1 Comparison of hydrolysis degrees of five proteases

水解度高代表更多的底物被蛋白酶水解，由圖1可知，水解度由高到低依次為動物蛋白酶、海產(chǎn)品蛋白酶、骨蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶，最后是中性蛋白酶。與海產(chǎn)品蛋白酶相比，動物蛋白酶水解度略高，但無顯著性（p＞0.05），與其他蛋白酶相比差異明顯。蛋白酶根據(jù)作用位點不同，分為內(nèi)肽酶和端肽酶。內(nèi)肽酶能從中間切斷大分子量多肽鏈，形成小分子量多肽；端肽酶能從多肽的游離羧基末端或氨基末端逐個水解肽鏈生成氨基酸[12]。動物蛋白酶本身是一種由內(nèi)肽酶和端肽酶組成的復(fù)合酶，具有多種酶切位點，故其水解度較高。柏昌旺等[13]以水解度、短肽質(zhì)量濃度及得率為指標對牡蠣進行水解，從5種蛋白酶中篩選出效果較好的酶是動物蛋白酶，與本研究所得結(jié)論相似。因此，本試驗選取動物蛋白酶進行后續(xù)試驗。

2.2 單因素試驗結(jié)果

2.2.1 酶添加量對水解度的影響

酶添加量對水解度的影響見圖2。

圖2 酶添加量對水解度的影響Fig.2 The efect of enzyme addition on degree of hydrolysis

如圖2所示，當酶添加量從0.5%到2.0%時，水解度逐漸增加，在2.0%時水解度達到最高。當酶添加量從2.0%繼續(xù)增加到3.0%時，水解度則呈現(xiàn)略微下降的趨勢。酶添加量的多少意味著酶活性的大小，當?shù)孜餄舛纫欢〞r，隨著酶添加量的增加，水解度與其成正比。但當酶添加量過多時，則會導(dǎo)致底物與酶的結(jié)合位點不斷減少，即便再添加酶，水解度也不會有較大提高，還會造成浪費[14]。故2.0%為最適加酶量。

2.2.2 酶解時間對水解度的影響

酶解時間對水解度的影響見圖3。

圖3 酶解時間對水解度的影響Fig.3 The effect of enzymolysis time on degree of hydrolysis

如圖3所示，當酶解時間從2 h到8 h時，水解度持續(xù)升高；當酶解時間從8 h增加到10 h時，金槍魚骨膠原肽的水解度變化則不大?？梢钥闯?，酶解時間越長酶解越徹底，但隨著時間的延后，底物不斷發(fā)生反應(yīng)，濃度逐漸降低，酶活也達到極限，水解度也趨于穩(wěn)定[15]。故本試驗選取酶解時間為8 h。

2.2.3 料液比對水解度的影響

料液比對水解度的影響見圖4。

圖4 料液比對水解度的影響Fig.4 The effect of material liquid ratio on degree of hydrolysis

由圖4可以看出，當料液比從 0.04∶1（g/mL）到0.08∶1（g/mL）時，水解度升高并在料液比為0.08∶1（g/mL）時達到最大值。當料液比從 0.08∶1（g/mL）到0.12∶1（g/mL）時，水解度則開始逐漸降低。由此可見，當料液比為0.08∶1（g/mL）時，金槍魚骨膠原肽的水解度最佳。料液比對酶解速率有重要影響，底物濃度過低時，酶與底物結(jié)合空間較小，水解程度不高，降低試驗效率；底物濃度過高時，蛋白溶液黏度增大，影響酶與底物的充分接觸，水解度也會下降[16]。

2.2.4 溫度對水解度的影響

溫度對水解度的影響見圖5。

圖5 溫度對水解度的影響Fig.5 The effect of temperature on degree of hydrolysis

如圖5所示，當酶解溫度從40℃升高到55℃時，水解度逐漸增加，當溫度為55℃時，水解度達到最大值。當酶解溫度從55℃繼續(xù)升高到60℃時，水解度則開始下降。酶解溫度影響著酶的活性，溫度的升高有利于提高酶活性，但過高時會導(dǎo)致酶活性減弱甚至喪失，從而影響酶解效果[17]。故本試驗選取55℃作為酶解溫度。

2.2.5 pH值對水解度的影響

pH值對水解度的影響見圖6。

圖6 pH值對水解度的影響Fig.6 The effect of pH on degree of hydrolysis

如圖6所示，當pH值從6.5到7.0時，水解度逐漸升高并在7.0時達到最大。當pH值從7.0繼續(xù)增加到8.5時，水解度則持續(xù)降低。pH值會通過影響酶的構(gòu)象和底物的解離狀態(tài)進而影響水解度[18]。因此，本試驗選取酶解pH值為7.0。

2.3 響應(yīng)面試驗結(jié)果

在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，以酶添加量、酶解時間、料液比、溫度、pH值這5個因素作為響應(yīng)變量，水解度作為響應(yīng)值，用Design Expert 8.0軟件Box-Behnken組合試驗設(shè)計原理進行響應(yīng)面試驗，每個變量均設(shè)3個水平，方案與結(jié)果如表3所示。

表3 響應(yīng)面方案設(shè)計和試驗結(jié)果Table 3 Response surface design and experimental results

續(xù)表3 響應(yīng)面方案設(shè)計和試驗結(jié)果Continue table 3 Response surface design and experimental results

對表3結(jié)果進行分析，得到金槍魚骨膠原肽水解度對酶添加量、酶解時間、料液比、溫度、pH值5個因素的二次多項回歸模型方程，即y=65.55+1.72A+1.29B+1.46C-2.17D+1.00E+0.018AB+0.5AC-1.88AD+0.39AE+0.11BC-0.005 5BD-0.10BE-0.32CD+0.61CE+0.043DE-2.34A2-3.43B2-3.77C2-5.91D2-4.31E2。

方差分析見表4。

表4 回歸方程參數(shù)方差分析Table 4 Analysis of variance of regression equation parameters

續(xù)表4 回歸方程參數(shù)方差分析Continue table 4 Analysis of variance of regression equation parameters

由表4方差分析可知，模型p值＜0.000 1，擬合度較好。失擬項p值為0.095 6＞0.05，不顯著，進一步說明模型不失擬，選擇合理。根據(jù)文獻研究表明，R2＞0.75是模型可被接受的范圍[19]，本試驗?zāi)Ｐ偷南嚓P(guān)系數(shù)R2為0.939 9，相對可靠，可用來預(yù)測試驗結(jié)果。一次項中，酶添加量（A）、酶解時間（B）、料液比（C）、溫度（D）、pH 值（E）這5個因素對水解度影響的主次順序為D＞A＞C＞B＞E，且都極顯著影響水解度（p＜0.01）。在二次項中，各因素均影響極顯著（p＜0.01），但各因素間交叉項對于水解度的影響較?。╬＞0.05），僅有A和D交互項影響極顯著（p＜0.01）。

根據(jù)金槍魚骨膠原肽水解度的回歸方程，利用Design Expert分析軟件可以得到各因素交互作用的響應(yīng)面圖，其中酶添加量和溫度之間的相互作用如圖7所示。

圖7 酶添加量和溫度對水解度的交互作用Fig.7 Interaction of enzyme addition and temperature on degree of hydrolysis

響應(yīng)面圖較為直觀地反映兩個因素對水解度的影響，當響應(yīng)值越敏感時，其在響應(yīng)曲面圖中的曲線變化趨勢越大，坡度則越陡，顏色也愈加深。從圖7中可以看出，隨著酶添加量不斷升高，水解度逐漸增加；隨著溫度的升高，水解度則先增加后減小。酶添加量和溫度的交互作用對水解度的影響較大，表現(xiàn)為響應(yīng)面曲線走勢較陡峭，顏色也逐漸由淺變深，說明金槍魚骨膠原肽水解度對酶添加量和溫度的交互作用較為敏感，與方差分析結(jié)果一致。

2.4 水解度最優(yōu)制備工藝條件的確定與驗證

根據(jù)響應(yīng)面分析得到最優(yōu)酶解條件為酶添加量2.52%、酶解時間 8.38 h、料液比 0.09 ∶1（g/mL）、溫度53.64℃、pH 7.08，此時理論上金槍魚骨膠原肽水解度最高，為66.68%。為了便于實際操作，將酶解條件修正為酶添加量 2.5%、酶解時間 8 h、料液比 0.09∶1（g/mL）、溫度53℃、pH 7.0。在該條件下進行3次平行試驗，測得水解度為65.43%，與理論值接近。這表明該模型適用于金槍魚骨膠原肽酶解工藝的分析和預(yù)測。

2.5 游離氨基酸組成分析

大多數(shù)游離氨基酸不僅自身具有特殊滋味，還可以通過脫羧、脫氨等作用生成其他揮發(fā)性風(fēng)味前體物質(zhì)[20]，并具有增鮮和提高機體免疫力等作用[21]。對最優(yōu)酶解工藝進行放大試驗，過膜后得到兩個不同分子級的骨膠原肽，分別命名為骨膠原肽1（bone collagen peptides 1，BCP1，分子量為 250 Da～1 000 Da）、骨膠原肽 2（bone collagen peptides 2，BCP2，分子量為 1 000 Da～3 500 Da），骨膠原肽中的游離氨基酸組成見表5。

表5 骨膠原肽中的游離氨基酸組成Table 5 Composition of free amino acids in bone collagen peptides

續(xù)表5 骨膠原肽中的游離氨基酸組成Continue table 5 Composition of free amino acids in bone collagen peptides

由表5可知，金槍魚骨膠原肽中的氨基酸種類豐富，兩種不同分子量的骨膠原肽中均能檢測到17種游離氨基酸，在總含量上BCP1遠大于BCP2。兩者在組成上也存在一定差異，BCP1中必需氨基酸占游離氨基酸總量的42.02%，含量最高的必需氨基酸是賴氨酸，占游離氨基酸總量的10.27%。而BCP2中必需氨基酸占游離氨基酸總量的31.53%，其中含量最高的必需氨基酸也是賴氨酸（11.33%）。由此可見，金槍魚骨膠原肽可以滿足人體對必需氨基酸的需求，利用價值高。

3 結(jié)論

本試驗以金槍魚骨為原料，從5種蛋白酶中篩選出動物蛋白酶為酶解制備骨膠原肽的最佳蛋白酶，并通過單因素試驗及響應(yīng)面試驗分析，優(yōu)化得到最優(yōu)工藝條件為酶添加量 2.5%、pH7.0、料液比0.09∶1（g/mL）、溫度53℃、酶解時間8 h，此時水解度為65.43%。在該條件下，進行工藝放大試驗和過膜精制，得到兩個不同分子級的骨膠原肽（BCP1和BCP2），對其游離氨基酸組成進行分析，發(fā)現(xiàn)膠原肽中氨基酸種類豐富，利用價值高。該研究有望減少金槍魚骨資源的浪費，為使用動物蛋白酶水解金槍魚骨獲得骨膠原肽提供參考，為進一步充分開發(fā)利用金槍魚骨膠原肽提供了理論和試驗基礎(chǔ)。