響應面法優(yōu)化超聲輔助提取桑黃總酚工藝

馬婧嘉 張文雋 李雅茹 吳亞召 雷 萍

（陜西省微生物研究所，陜西西安 710043）

桑黃Sanghuangporusspp.是一類大型珍稀藥用真菌，早在《藥性論》《新修本草》和《本草綱目》等書中就有對其藥性的記載，民間主要用于治療腮腺炎、淋巴結(jié)發(fā)炎腫大以及婦女產(chǎn)后血凝，腹內(nèi)結(jié)塊等[1-2]。桑黃含多糖類、三萜類、黃酮類、多酚類、甾類等多種活性成分[3-4]，其中多酚是由一個或多個芳香環(huán)和多個羥基組成的化合物，具有抗腫瘤、抗氧化能力，是桑黃的主要活性成分之一[5]。超聲波輔助提取方法是利用超聲波產(chǎn)生的物理綜合效應，破壞細胞壁，加速細胞內(nèi)的成分溶解，提高提取物得率，縮短提取時間[6]。以往文獻中桑黃多酚的提取常參考其他植物提取方式，例如樺褐孔菌、三葉青等[7-8]。以桑黃為研究對象的多酚提取文獻相對較少。研究以桑黃子實體為原料，采用超聲波輔助提取，利用響應面法探索超聲波輔助提取桑黃多酚的最佳工藝條件，旨在為桑黃的進一步開發(fā)應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗儀器

TU-1901 雙光束紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；JP-120ST 超聲波清洗儀，深圳市結(jié)盟設(shè)備有限公司；TD5 離心機，上海盧湘儀離心機儀器有限公司。

1.2 試驗材料

供試桑黃菌株桑黃-H（Sanghuangporus baumi）為陜西省微生物研究所微生物技術(shù)研究中心第二研究室保藏菌種。沒食子酸標準品，河南標準物質(zhì)研發(fā)中心；福林酚試劑，Biotopped Life Siciences；水為純化水；其余試劑為分析純。

1.3 桑黃總酚的提取

1.3.1 供試品溶液的制備[9]

準確稱取桑黃子實體粉末1.0 g，置于50 mL 具塞三角瓶中，加入一定體積的乙醇，在規(guī)定溫度下超聲提取一定時間，冷卻至室溫，4 000 r/min 離心10 min，收集濾渣加入一定體積的乙醇，在規(guī)定溫度下超聲提取一定時間，冷卻至室溫，4 000 r/min 離心10 min，合并兩次上清液定容至100 mL 量瓶中，作為供試品溶液。

1.3.2 標準曲線的制備

稱取10 mg 沒食子酸對照品，加60%乙醇定容至100 mL，即得100μg/mL 的沒食子酸標準品溶液，分別移取 0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL 置于10 mL 容量瓶中，以蒸餾水作為空白對照，分別加入福林酚試劑0.5 mL，振蕩1 min搖勻，加10%碳酸鈉2 mL，搖勻后蒸餾水定容，室溫避光放置2 h，于750 nm 處測定其吸光度，并繪制標準曲線，計算得線性回歸方程：Y沒食子酸=0.7489X-0.0079（R2=0.999），沒食子酸與吸光度的線性關(guān)系良好。

1.4 單因素試驗

1.4.1 乙醇體積分數(shù)對桑黃總酚提取效果的影響

固定料（g）液（mL）比1∶25，超聲提取溫度50 ℃，提取時間30 min，乙醇體積分數(shù)分別為40%、50%、60%、70%和80%，考察不同體積分數(shù)的乙醇對桑黃總酚得率的影響，篩選適合的乙醇體積分數(shù)。

1.4.2 料液比對桑黃總酚提取效果的影響

固定乙醇體積分數(shù)為70%，提取時間30 min，提取溫度50 ℃，按照料（g）液（mL）比1∶15、1∶25、1∶30、1∶35、1∶45 加入提取溶劑，考察不同料液比對桑黃總酚得率的影響。

1.4.3 提取時間對桑黃總酚提取效果的影響

固定料（g）液（mL）比1∶25，提取溫度50 ℃，乙醇體積分數(shù)70%，分別超聲提取20 min、30 min、40 min、50 min、60 min，考察提取時間對桑黃總酚得率的影響。

1.4.4 提取溫度對桑黃總酚提取效果的影響

固定料液比1∶25，乙醇體積分數(shù)70%，提取時間 30 min，提取溫度分別為 20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃，考察提取溫度對桑黃總酚得率的影響。

1.5 響應面分析的設(shè)計與擬合模型

以單因素試驗結(jié)果為基礎(chǔ)，選取乙醇體積分數(shù)、提取時間和提取溫度3個因素為自變量，以桑黃總酚得率為響應值，采用Box-Benhnken 中心組合試驗設(shè)計3 因素3 水平的響應面分析法對桑黃總酚提取過程進行優(yōu)化，以達到最大限度提取桑黃總酚的目的。試驗因素與水平設(shè)計見表1。

表1 Box-Benhnken試驗設(shè)計各因素水平

1.6 桑黃總酚提取方法對比

響應面擬合最佳提取條件與《安徽省中藥飲片炮制規(guī)范》[10]中的多酚提取法進行對比。

1.7 桑黃總酚的得率計算

桑黃總酚得率（質(zhì)量比）＝c×100×10/m（式中：100 為樣品體積；10 為稀釋倍數(shù)；c為總酚含量，m為稱取樣品質(zhì)量g）。

1.8 數(shù)據(jù)處理

用Design expert 8.0.6.1 軟件處理數(shù)據(jù)，運用GraphPad Prism 7.00作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶劑乙醇體積分數(shù)試驗結(jié)果

由圖1所知，隨著乙醇體積分數(shù)的增加，桑黃總酚得率逐漸上升，當乙醇體積分數(shù)為70%時，桑黃總酚得率最高，當乙醇體積分數(shù)為80%時，桑黃總酚得率下降，這可能與桑黃中酚類化合物都具有羥基有關(guān)，與70%乙醇極性相似，所以溶解度最大[11]。差異顯著性分析（P＜0.05）結(jié)果，乙醇體積分數(shù)50%與60%差異不顯著，與70%差異顯著，因此選擇體積分數(shù)70%的乙醇作為提取溶劑。

圖1 乙醇體積分數(shù)對桑黃總酚得率的影響

2.2 料液比試驗結(jié)果

由圖2 可知，料液比對桑黃總酚得率的影響并不顯著，當料液比＞1∶25 后，桑黃總酚得率基本保持不變，且P＜0.05顯著性分析表明，料液比為1∶25時，桑黃總酚得率與料液比1∶30、1∶35、1∶45 差異不顯著。考慮到料液比上升會增加溶劑使用量[12]，故選擇料液比為1∶25。

圖2 料液比對桑黃總酚得率的影響

2.3 提取時間試驗結(jié)果

由圖3可知，隨著提取時間的延長，桑黃總酚得率逐漸上升，提取時間50 min 時桑黃總酚得率達最高。再延長提取時間，桑黃總酚得率下降，可能是由于隨著提取時間的增加，其他成分增多后會干擾多酚類物質(zhì)的溶出[13]。顯著性分析結(jié)果表明（P＜0.05），提取時間50 min 與其他處理差異顯著，因此選擇提取時間50 min左右為宜。

圖3 提取時間對桑黃總酚得率的影響

2.4 提取溫度試驗結(jié)果

由圖4 所知，提取溫度在20~80 ℃，隨著提取溫度的上升，桑黃總酚得率不斷地提高，提取溫度為80 ℃時桑黃總酚得率達最高，再提高提取溫度，桑黃總酚得率下降。由顯著性分析結(jié)果（P＜0.05）也可看出，提取溫度80 ℃與其他處理差異顯著。提取溫度過高溶劑可能損失較多，影響提取效果，因此選擇提取溫度在80 ℃左右為宜。

圖4 提取溫度對桑黃總酚得率的影響

2.5 桑黃總酚的提取工藝響應面法優(yōu)化結(jié)果

由于料液比達一定程度后，其對提取桑黃總酚得率影響不大，因此響應面優(yōu)化時采用Box-Benhnken中心組合試驗設(shè)計3 因素3 水平的響應面分析法，對桑黃總酚提取進行優(yōu)化，響應面分析方案及試驗結(jié)果見表2。由Design expert 8.0.6.1軟件處理數(shù)據(jù)，其方差分析結(jié)果見表3。對響應值與各個因素進行回歸擬合，該模型對應的回歸方程如下Y=- 1 149.56+4.58A+26.55B+4.78C-0.04AB+0.002AC+0.04BC-0.02A2-0.17B2-0.06C2

表2 響應面分析方案及結(jié)果

表3 回歸方程方差分析

對二次回歸方程進行方差分析，模型P＜0.01，此時回歸方差模型極顯著，該試驗方法可靠。方程失擬項不顯著，表明該回歸模型與實測值能較好地擬合?；貧w系數(shù)R2=0.9829＞0.9，表明該模型相關(guān)度好。回歸方程各項的方差分析表明：B、C、B2、C2均達極顯著水平（P＜0.01），AB、BC達顯著水平（P＜0.05）。同時由F值可推斷，在所選擇的試驗范圍內(nèi)，3 個因素對桑黃多酚得率的影響大小依次為提取溫度（B）＞乙醇體積分數(shù)（C）＞提取時間（A）。

響應面Y對應因素A、B、C值構(gòu)成的三維空間在二維平面上的等高圖可直觀地反映各因素之間的相互作用。Design expert 8.0.6.1 軟件處理得到響應面分析結(jié)果見圖5—圖7?？梢钥闯?，3 個三維圖均有最高點，表明試驗所選提取時間、提取溫度和乙醇體積分數(shù)3 個因素的設(shè)定值范圍內(nèi)包含響應極值；二次項中提取時間與提取溫度、乙醇體積分數(shù)和提取時間的曲面效應顯著，表現(xiàn)為等高線的形狀為橢圓形，說明桑黃總酚的提取過程各因素之間能夠相互影響，且不是簡單的線性關(guān)系。乙醇體積分數(shù)與提取溫度成圓形，表明它們之間交互作用較弱。

圖5 提取時間、提取溫度對提取效果交互作用

圖6 乙醇體積分數(shù)、提取時間對提取效果交互作用

圖7 乙醇體積分數(shù)、提取溫度對提取效果交互作用

根據(jù)所得到的模型，預測最優(yōu)工藝條件：乙醇體積分數(shù)65.9%、提取時間48.2 min、提取溫度77.9 ℃，在此條件下桑黃總酚的得率理論上可達152.95 mg/g。為了便于控制試驗條件，調(diào)整方案為乙醇體積分數(shù)65%、料液比1∶25、提取溫度78 ℃、提取時間48 min。在此條件下重復試驗3 次，并計算桑黃總酚得率，其平均值為152.78 mg/g，實際值與預測值較為接近，充分驗證所建模型的正確性，說明響應面分析方法適用于桑黃總酚的超聲提取工藝的優(yōu)化。

2.6 桑黃中總酚的提取工藝對比

采用響應面法優(yōu)化工藝條件乙醇體積分數(shù)65%、料液比1∶25、提取溫度78 ℃、提取時間48 min與安徽中藥飲片炮制規(guī)范中桑黃多酚甲醇提取法料（g）液（mL）比 1∶500、超聲功率 150 W、頻率40 kHz、提取時間30 min 進行對比試驗。結(jié)果表明響應面優(yōu)化工藝桑黃總酚得率為152.78 mg/g，甲醇提取桑黃總酚得率為91.84 mg/g，響應面優(yōu)化工藝條件桑黃總酚得率提升66.4%，差異顯著（P＜0.05）（圖8）。

圖8 桑黃總酚的不同方法提取效果比較

3 小結(jié)

植物多酚廣泛存在于自然界中，桑黃中的多酚是其主要的活性成分之一，具有抗氧化等作用。超聲波能瞬時產(chǎn)生高壓的空化作用，使細胞中的有效成分更容易被溶劑溶出，從而提高提取效率[14]。響應面法是通過回歸模型方程以及響應面圖的建立與分析，表示出響應值與各個因素之間的函數(shù)關(guān)系以及各個因素間的交互作用，從而高效地優(yōu)化出最佳響應值多因素的組合條件，因此被廣泛應用于各種工藝條件優(yōu)化中[15]。研究通過單因素試驗和響應面試驗基本確定提取桑黃總酚的最佳工藝條件為：料（g）液（mL）比1∶25，乙醇體積分數(shù) 65%，提取溫度78 ℃、提取時間48 min，在此條件下桑黃總酚得率為152.78 mg/g。經(jīng)驗證，在該工藝條件下桑黃總酚得率穩(wěn)定。除了料液比其他3個提取條件對桑黃總酚得率的影響依次為提取溫度＞乙醇體積分數(shù)＞提取時間，3 個提取條件交互作用對桑黃總酚得率的影響依次為：提取時間、提取溫度＞乙醇體積分數(shù)、提取時間＞乙醇體積分數(shù)、提取溫度。響應面優(yōu)化桑黃總酚提取工藝，減少溶劑用量，使后續(xù)提取工藝得到簡化，同時顯著提高桑黃總酚提取率，是一種較為高效的提取方法。