蔣 寧 林金盛 曲紹軒 李輝平 駱 昕 徐 平 李宏斌 馬 林* 顧魯同
(1江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所/江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇南京 210014;2泗洪綠康食用菌科技有限公司,江蘇宿遷 223942;3 陽泉職業(yè)技術(shù)學(xué)院,山西陽泉 045000;4江蘇省農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣總站,江蘇南京 210036)
草菇Volvariella volvacea,隸屬于擔(dān)子菌綱Basidiomycetes 傘菌目Agaricales 小苞腳菇屬Volvariella[1],是一種高溫型食用菌,具有較高的保健價(jià)值,在我國南方地區(qū)和東南亞國家栽培較廣[2]。據(jù)中國食用菌協(xié)會(huì)統(tǒng)計(jì),2019 年中國草菇總產(chǎn)量為23.43萬t。
草菇栽培常用的原料有棉籽殼、廢棉渣、稻草、中藥渣等,近年來利用金針菇、杏鮑菇等木腐類食用菌菌渣栽培草菇量不斷上升[3]。草菇規(guī)模化栽培分幾個(gè)階段,首先從20 世紀(jì)60 年代的室外生料堆式栽培,到80 年代后期的保溫房床架式栽培,之后進(jìn)入21 世紀(jì)實(shí)現(xiàn)了機(jī)械化、周年化栽培,再到目前開始探索全方位的工廠化栽培階段[4]。
草菇工廠化栽培,通過隧道發(fā)酵有效降解培養(yǎng)料是實(shí)現(xiàn)草菇高產(chǎn)的關(guān)鍵。在同樣需要經(jīng)過培養(yǎng)料隧道發(fā)酵過程的雙孢蘑菇Agaricus bisporus生產(chǎn)中,培養(yǎng)料木質(zhì)纖維素的降解率與其酶活性呈正相關(guān)[5]。利用不同基質(zhì)栽培大球蓋菇Stropharia rugosoannulata時(shí),胞外纖維素酶、半纖維素酶、漆酶等胞外酶活性均存在明顯差異[6]。已有文獻(xiàn)報(bào)道,菌渣中加入稻草或麥草有利于草菇培養(yǎng)料的發(fā)酵[7],但未對最適比例進(jìn)行深入研究,尤其是適宜隧道發(fā)酵的最佳配方鮮有報(bào)道。培養(yǎng)料配方對隧道發(fā)酵過程中基質(zhì)胞外酶、產(chǎn)量等都有影響。因此,筆者從草菇生理生化的角度出發(fā),以杏鮑菇菌渣和麥草培養(yǎng)料為研究對象,探究隧道發(fā)酵過程中草菇基質(zhì)的pH 和部分胞外酶活性的變化,以期為穩(wěn)定草菇產(chǎn)量,優(yōu)化生產(chǎn)條件,進(jìn)一步推進(jìn)草菇工廠化栽培提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支撐。
草菇菌種:V23,江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所提供。
培養(yǎng)料配方1:杏鮑菇菌渣100%;配方2:杏鮑菇菌渣90%,麥草10%;配方3:杏鮑菇菌渣80%,麥草20%;配方4:杏鮑菇菌渣70%,麥草30%。杏鮑菇菌渣的原始配方為雜木屑25%,玉米芯20%,甘蔗渣15%,麩皮25%,玉米粉5%,豆粕粉7%,輕質(zhì)碳酸鈣2%,石灰1%。
1.2.1 發(fā)酵前準(zhǔn)備
杏鮑菇采收結(jié)束后,挑選無雜菌感染的菌包,用脫袋機(jī)去除塑料袋,并將菌渣粉碎成直徑小于5 mm 的顆粒物;將麥草切割成長度20 cm 左右的小段。菌渣與麥草按比例備好,分別加入4%的熟石灰,混合均勻后準(zhǔn)備發(fā)酵。
1.2.2 培養(yǎng)料隧道發(fā)酵
將混勻備用的培養(yǎng)料放入一次發(fā)酵隧道中,按照8 min/20 min的通風(fēng)頻率持續(xù)發(fā)酵2 d。一次發(fā)酵結(jié)束后將培養(yǎng)料轉(zhuǎn)入封閉的二次發(fā)酵隧道,加大通風(fēng)量將培養(yǎng)料料溫降至45 ℃(空間溫度為43 ℃),隨后降低通風(fēng)量,保持每小時(shí)1~1.5 ℃的速度增溫,至料溫達(dá)到60 ℃(空間溫度為58 ℃),恒溫保持10 h;加大通風(fēng)量降溫8 h,料溫降至50 ℃(空間溫度為48 ℃),保持通風(fēng)2~3 d,待氨氣下降到5 mg/L 以下,溫度40 ℃以下時(shí)培養(yǎng)料隧道發(fā)酵結(jié)束。
1.2.3 樣品采集
分別在一次隧道發(fā)酵前(A)、二次隧道發(fā)酵前(B)和二次隧道發(fā)酵結(jié)束后(C)采集培養(yǎng)料樣品。采用隨機(jī)取樣法,每處理取5 個(gè)點(diǎn)采集50 g,混勻,三次重復(fù)。每重復(fù)分兩份樣品:一份用于測定pH,另一份用于測定胞外酶活性。
1.2.4 培養(yǎng)料pH測定
稱取通過2 mm 孔徑篩的供試樣品10 g,按水樣比2.5∶1加入去除CO2的蒸餾水,將樣品充分?jǐn)嚢璺稚?,放?0 min后采用玻璃電極法測定樣品pH[8]。
1.2.5 粗酶液的提取
稱取10 mg 供試樣品,加入100μL pH 7.2~7.4的磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS),充分混勻。4 ℃、3 000 r/min 離心20 min,收集上清即為粗酶液。
1.2.6 胞外酶活性測定
采用雙抗體夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒法,分別按照上海茁彩生物科技有限公司微生物總蛋白酶(t-Pro)、半纖維素酶(Hce)、纖維素酶(CE)和木質(zhì)素過氧化物酶(LIP)ELISA 檢測試劑盒說明書操作,Rayto RT-6100 酶標(biāo)分析儀在450 nm 波長處測定各處理的OD 值,根據(jù)說明書計(jì)算公式計(jì)算酶活性。
1.2.7 草菇產(chǎn)量統(tǒng)計(jì)
培養(yǎng)料二次發(fā)酵結(jié)束后出倉移入出菇房內(nèi),播種后進(jìn)行常規(guī)的工廠化出菇管理,分別記錄4 個(gè)配方的兩潮草菇產(chǎn)量。
數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20 軟件,計(jì)量資料用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±SD)表示,多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA),兩兩比較采用Duncan-Dunnett’s T3,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
由圖1 可知,培養(yǎng)料經(jīng)過一、二次隧道發(fā)酵后pH 發(fā)生了變化。4 個(gè)配方均表現(xiàn)出相同的pH 變化趨勢,即一次發(fā)酵后pH 下降明顯,pH 全部下降至8.15~8.50。二次發(fā)酵后pH 變化較小,配方1 和配方2仍為下降趨勢,但配方3和配方4卻略有上升。
圖1 供試配方料發(fā)酵過程pH變化
2.2.1 總蛋白酶活性的變化
培養(yǎng)料中含有豐富的蛋白質(zhì),在隧道發(fā)酵過程中總蛋白酶活性的變化呈現(xiàn)出不同的規(guī)律。由圖2可以看出,配方1 培養(yǎng)料中總蛋白酶的活性經(jīng)過兩次隧道發(fā)酵變化很小,差異不顯著;其他3個(gè)添加麥草的配方,培養(yǎng)料經(jīng)過一次發(fā)酵后總蛋白酶活性均呈上升趨勢,且差異顯著,經(jīng)過二次發(fā)酵后,配方2的酶活性依然上升,而配方3、配方4 酶活性卻下降至2 IU/g;二次發(fā)酵結(jié)束后,配方2 的總蛋白酶活性顯著高于其他3個(gè)配方。
圖2 供試配方培養(yǎng)料發(fā)酵過程總蛋白酶活性變化
2.2.2 木質(zhì)素酶活性的變化
培養(yǎng)料在隧道發(fā)酵過程中木質(zhì)素酶活性的變化趨勢如圖3 所示。麥草含量最高的配方4 在兩次發(fā)酵中木質(zhì)素酶活性都呈上升趨勢,一次發(fā)酵前和二次發(fā)酵結(jié)束后的酶活性差異顯著;其他3 個(gè)配方的培養(yǎng)料酶活性呈先上升后下降的趨勢,其中無麥草的配方1培養(yǎng)料經(jīng)過兩次隧道發(fā)酵后酶活性從最高(0.58±0.02)U/g 降至最低(0.51±0.03)U/g,配方2和配方3培養(yǎng)料發(fā)酵過程中各時(shí)間點(diǎn)木質(zhì)素酶活性的差異不顯著。
圖3 供試配方培養(yǎng)料發(fā)酵過程木質(zhì)素酶活性變化
2.2.3 半纖維素酶活性的變化
隧道發(fā)酵過程中降解培養(yǎng)料中半纖維素的主要酶是內(nèi)切木聚糖酶,其變化趨勢如圖4 所示,4 個(gè)配方表現(xiàn)出3 種不同的變化趨勢:配方1 培養(yǎng)料的酶活性變化為先降后升,且二次發(fā)酵結(jié)束后與一次發(fā)酵前的差異不顯著;配方4 培養(yǎng)料經(jīng)過每一次發(fā)酵后酶活性均明顯地上升;配方2 和配方3 的培養(yǎng)料酶活性為先升后降,且每個(gè)取樣點(diǎn)麥草含量較少的配方2培養(yǎng)料的酶活性都顯著高于麥草含量較多的配方3。
圖4 供試配方培養(yǎng)料發(fā)酵過程半纖維素酶活性變化
2.2.4 纖維素酶活性的變化
草菇培養(yǎng)料隧道發(fā)酵過程中纖維素酶活性變化如圖5 所示,4 個(gè)配方的酶活性變化趨勢一致,均在二次隧道發(fā)酵前出現(xiàn)了酶活性最高峰,其中配方3 的培養(yǎng)料酶活性最高,為(4 414.47±184.80)U/g。在二次隧道發(fā)酵結(jié)束后,除配方4 外,其他3 個(gè)配方的培養(yǎng)料酶活性都顯著高于一次隧道發(fā)酵前。
圖5 供試配方培養(yǎng)料發(fā)酵過程纖維素酶活性變化
4 個(gè)配方培養(yǎng)料栽培草菇采收兩潮后記錄草菇總產(chǎn)量。由表1可知,配方1和配方2的總產(chǎn)量顯著高于配方3、配方4,配方1的出菇表現(xiàn)為第1潮菇產(chǎn)量最高,第2 潮菇產(chǎn)量顯著降低;配方2 的兩潮菇產(chǎn)量相當(dāng)。
表1 供試配方培養(yǎng)料栽培草菇產(chǎn)量統(tǒng)計(jì) 單位:kg/m2
試驗(yàn)表明,當(dāng)培養(yǎng)料含有杏鮑菇菌渣90%和10%的麥草時(shí),采收兩潮菇的總產(chǎn)量最高,為(7.22±0.03)kg/m2,高于黃桂平采用純杏鮑菇菌渣栽培草菇的產(chǎn)量[9],同樣隨著麥草比例的上升,產(chǎn)量逐漸降低。林金盛等[10]研究表明以杏鮑菇菌渣為培養(yǎng)料栽培草菇的產(chǎn)量顯著高于以稻草為培養(yǎng)料的產(chǎn)量。這說明在草菇生長過程中菌渣提供了比麥草更多的營養(yǎng)物質(zhì),菌渣比例越低,產(chǎn)量越低。純菌渣中加入少量麥草,在隧道發(fā)酵過程中料通氣性更好,培養(yǎng)料發(fā)酵更加徹底。
草菇培養(yǎng)料隧道發(fā)酵時(shí),除配方1外,其他配方一次隧道發(fā)酵培養(yǎng)料的半纖維素酶活性全部呈上升趨勢。以廢棉為培養(yǎng)料栽培草菇時(shí)一次發(fā)酵培養(yǎng)料的木質(zhì)纖維素酶變化同樣為上升趨勢[5],但以秸稈為主要培養(yǎng)料栽培雙孢蘑菇時(shí)一次隧道發(fā)酵的培養(yǎng)料酶活性變化差異較大[11],導(dǎo)致這些不同結(jié)果的原因可能與一次發(fā)酵的時(shí)間及條件相關(guān)。二次隧道發(fā)酵酶活性呈下降趨勢的較多,但在二次隧道發(fā)酵結(jié)束后,所有酶活性均高于一次發(fā)酵前。這說明在隧道發(fā)酵時(shí)培養(yǎng)料中的微生物開始生長,并對培養(yǎng)料中的蛋白質(zhì)、木質(zhì)素、纖維素、半纖維素等分解利用,從而有利于草菇播種后菌絲的萌發(fā)生長[12]。杏鮑菇菌渣中存在木質(zhì)素含量高的雜木屑,麥草的加入不僅能優(yōu)化培養(yǎng)料結(jié)構(gòu),提高透氣性,同時(shí)會(huì)額外增加纖維素和半纖維素含量,試驗(yàn)中麥草量與木質(zhì)素酶、纖維素酶和半纖維素酶活性變化差異相關(guān)。
草菇培養(yǎng)料在兩次隧道發(fā)酵過程中pH 表現(xiàn)出一致的變化規(guī)律,即一次發(fā)酵顯著降低,二次發(fā)酵略微降低,與已報(bào)道的廢棉栽培草菇[5]和菌渣栽培雙孢蘑菇[13]規(guī)律一致。試驗(yàn)發(fā)酵前初始pH 用熟石灰調(diào)整后達(dá)pH 10~11,但二次發(fā)酵結(jié)束后的pH 為8.15~8.50,與趙書光等[14]報(bào)道的最適pH(7.5 左右)接近,這可能與本試驗(yàn)采用隧道發(fā)酵有關(guān)。
以菌渣為主要培養(yǎng)料的工廠化栽培草菇模式已是近年來草菇栽培的發(fā)展方向,隧道發(fā)酵則是工廠化栽培草菇中極為關(guān)鍵的環(huán)節(jié)之一。試驗(yàn)通過分析供試配方在發(fā)酵過程的酶活性變化及栽培草菇的產(chǎn)量,篩選出最適宜配方,為工廠化栽培草菇進(jìn)一步降本增產(chǎn)、增效提供數(shù)據(jù)支持。