一株紅樹植物內(nèi)生真菌Pseudallescheria boydii L32的代謝產(chǎn)物*

陳若蘭，黎子洋，巫惠珍，羅藝盟，佘志剛，熊亞紅，李春遠(yuǎn)

1. 生物基材料與能源教育部重點實驗室/華南農(nóng)業(yè)大學(xué)材料與能源學(xué)院，廣東 廣州 510642

2. 中山大學(xué)化學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510275

紅樹林真菌因特殊的沿海生存環(huán)境，能產(chǎn)生結(jié)構(gòu)多樣的具有各種活性的新代謝產(chǎn)物，是農(nóng)藥和醫(yī)藥開發(fā)的重要資源之一［1-3］。半紅樹植物苦檻藍(lán)Myoporum bontioides在我國沿海分布廣泛，其不同組織部位蘊含著豐富的內(nèi)生真菌資源［4］，在對其部分內(nèi)生菌株代謝產(chǎn)物的研究中，我們獲得了10 多個具有強(qiáng)抗菌活性的新代謝物，包括細(xì)胞松弛素生物堿、環(huán)六脂肽、色原酮、異香豆素及六、七元單環(huán)內(nèi)酯等結(jié)構(gòu)類型［5-7］。本文研究純化自該植物葉片的另1 株真菌Pseudallescheria boydiiL32 的代謝產(chǎn)物，共分離鑒定了10 個單體代謝物（圖1），包括2，2′-oxybis（1，4）-di-tert-butylbenzene（1），livistone B（2），simplicildone A（3），simplicildone B（4），botryorhodine B（5），（-）-regiolone（6），citreoanthrasteroid B（7），豆甾-4-烯-3-酮（8），丁二酸（9）和草酸（10）。其中代謝物1，3，4，5，7，8為首次從Pseudallescheria屬分離得到?；钚詼y試顯示，代謝物1，4，5，6 對O6 血清型大腸桿菌（人致病性），代謝物1，5 對O78 血清型大腸桿菌（禽致病性）顯示出抑菌活性。

圖1 代謝物1～10的結(jié)構(gòu)Fig.1 The structures of compounds 1-10

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑及材料

Bruker Biospin AV 600 核磁共振波譜儀，MDS SCIEX APCI 2000 液質(zhì)聯(lián)用儀，Horiba SEPA-300旋光儀。GF254 薄層及200-300 目柱層析硅膠（青島海洋化工公司），Sephadex LH-20 凝膠（GE Healthcare），其他試劑為分析純。Pseudallescheria boydiiL32 分離自苦檻藍(lán)葉片，通過PCR 擴(kuò)增真菌核糖體ITS 基因區(qū)段，并登陸NCBI數(shù)據(jù)庫Blast搜索與MK646016.1 菌株對比（相似度99.82%）得到鑒定，大腸桿菌（O6，O78 血清型）引自華南農(nóng)業(yè)大學(xué)天然資源再生與利用研究室，保藏于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)材料與能源學(xué)院。

1.2 菌種發(fā)酵培養(yǎng)及分離

采用與文獻(xiàn)相同的大米培養(yǎng)基［8］、培養(yǎng)體積及培養(yǎng)時間，將發(fā)酵物用乙醇萃取3次，減壓濃縮得提取物31.2 g，通過常規(guī)微生物代謝產(chǎn)物分離流程［8］，分別得到代謝物1（5.1 mg），2（3.5 mg），3（2.2 mg），4（2.3 mg），5（6.1 mg），6（1.8 mg），7（3.2 mg），8（2.6 mg），9（60.4 mg），10（35.1 mg）。

1.3 抗菌活性測試

用二倍稀釋法［9］測試代謝物1～8 體外對O6，O78 血 清 型 大 腸 桿 菌（Escherichia coliO78 和Escherichia coliO6，購自上海烜雅生物科技有限公司）抗菌活性，以最小抑菌濃度（MIC）表示抗菌效果，用頭孢拉定作陽性對照，平行測定3次。

1.4 代謝物波譜數(shù)據(jù)

代謝物1：C28H42O，黃色油狀物，ESI -MSm/z394.36［M+H］+，1H NMR（400 MHz，acetoned6）δ7.57（d，J= 8.6 Hz，2H），7.47（d，J= 2.5 Hz，2H），7.26（d，J= 8.6，2.5 Hz，2H），1.37（s，18H），1.30（s，18H）。13C NMR（100 MHz，acetone-d6）δ148.6，148.2，139.3，125.4，124.9，119.9，35.5，35.1，31.7，30.6。

代謝物2：C17H16O6，白色粉末，ESIMSm/z317.14［M+H］+，1H NMR（400 MHz，acetone-d6）δ6.65（s，1H），6.53（s，1H），5.06（s，2H），2.39（s，3H），2.38（s，3H），2.14（s，3H）。13C NMR（100 MHz，acetone-d6）δ166.0，163.9，161.4，153.4，144.8，144.5，143.8，128.2，116.4，116.3，115.4，114.9，113.7，56.1，21.2，16.8，9.3。

代謝物3：C18H18O6，無色固體，ESIMSm/z353.1［M+Na］+，1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ8.40（s，1H），6.62（s，1H），6.43（s，1H），5.04（s，2H），4.87（s，1H），3.52（s，3H），2.46（s，3H），2.33（s，3H），2.23（s，3H）。13C NMR（100 MHz，CDCl3）δ163.8，161.0，160.3，151.2，145.5，143.8，143.7，127.0，116.7，114.6，113.5，113.5，110.7，68.2，58.9，21.4，17.2，9.3。

代謝物4：C19H20O6，無色固體，ESIMSm/z345.1［M+H］+，1H NMR（400 MHz，acetone-d6）δ6.67（s，1H），6.53（s，1H），4.85（s，2H），3.64（q，J= 7.0 Hz，2H），2.38（s，3H），2.38（s，3H），2.14（s，3H），1.19（t，J= 7.0 Hz，3H）。13C NMR（100 MHz，acetone-d6）δ163.3，160.7，160.3，153.4，146.9，145.4，144.5，128.3，116.3，115.6，114.8，114.1，113.6，66.7，62.9，21.3，16.5，15.5，9.3。

代謝物5：C17H14O6，無色固體，ESIMSm/z313.1［M-H］-，1H NMR（400 MHz，acetone-d6）δ10.72（s，1H），6.76（s，1H），6.58（s，1H），2.50（s，3H），2.34（s，3H），2.17（s，3H）。13C NMR（100 MHz，acetone-d6）δ194.6，166.3，165.9，162.5，154.7，154.1，144.1，143.3，128.1，117.8，115.7，114.1，113.9，111.7，22.2，17.0，9.4。

代謝物6：C10H10O3，無色晶體，ESIMSm/z179.1［M+H］+，= -4.2（c0.10，MeOH），1H NMR（400 MHz，acetone-d6）δ12.46（s，1H），7.53（dd，J= 8.4，7.2 Hz，1H），7.12（d，J= 7.2 Hz，1H），6.83（d，J= 8.4 Hz，1H），4.89（dd，J= 8.5，3.8 Hz，1H），4.71（s，1H），2.74（m，1H），2.67（m，1H），2.33（m，1H），2.13（m，1H）。13C NMR（100 MHz，acetone-d6）δ204.6，162.4， 147.1， 136.6， 117.4， 116.2， 115.3，66.8，35.0，32.7。

代謝物7：C28H40O，無色油狀物，ESIMSm/z393.3［M+H］+，= +23.5（c0.10，CHCl3），1H NMR（400 MHz，acetone-d6）δ6.64（s，1H），6.63（d，J= 9.6 Hz，1H），6.47（d，J= 10.0 Hz，1H），5.31（dd，J= 6.4，4.8 Hz，1H），5.27（dd，J=7.1 Hz，1H），4.04（m，1H），2.97（dd，J= 16.5，5.2 Hz，1H），2.81（m，2H），2.80（m，1H），2.45（dd，J= 16.3，7.6 Hz，1H），2.17（s，3H），2.02～ 1.86（m，5H），1.75 ～ 1.46（m，5H），1.30（d，J=11.8 Hz，3H），1.16（d，J=6.6 Hz，3H），0.96（d，J= 6.8，3.0 Hz，3H），0.86（d，J= 6.5 Hz，3H），0.58（s，3H）。13C NMR（100 MHz，acetoned6）δ140.1，137.3，136.3，135.6，133.1，132.3，132.0，131.2，124.6，123.8，67.7，52.6，51.1，44.3，43.7，41.8，37.2，33.8，32.2，30.3，28.7，22.6，21.2，20.3，20.0，18.1，14.4，11.7。

代謝物8：C29H48O，無色油狀物，ESIMSm/z413.4［M+H］+，= +39.2（c0.10，CHCl3），1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ5.72（s，1H），1.18（s，3H），0.92（d，6.6 Hz，3H），0.86（d，7.2 Hz，6H），0.82（d，7.2 Hz，3H），0.71（s，3H），2.45～1.03（m，29H，不含1.18 的甲基及1.6 附近水峰信號）。13C NMR（100 MHz，CDCl3）δ199.5，171.6，123.0，56.2，55.6，53.6，45.5，42.6，39.1，38.4，36.7，35.6，35.2，34.5，33.7，33.5，32.6，29.7，28.3，26.2，24.3，23.6，21.0，19.7，19.1，18.9，17.5，12.1，12.0。

代謝物9：C4H6O4，無色晶體，ESIMSm/z119.1［M+H］+，1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ12.15（br s，2H），2.40（s，4H）。13C NMR（100 MHz，DMSO-d6）δ173.4，28.9。

代謝物10：C2H2O4，無色晶體，ESIMSm/z91.0［M+H］+，1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ13.75（br s，2H）。13C NMR（100 MHz，DMSO-d6）δ161.1。

2 結(jié)果與討論

ESIMS 譜m/z394.36［M+H］+，1H NMR 譜δ7.57（d，J= 8.6 Hz，2H），7.47（d，J= 2.5 Hz，2H），7.26（d，J=8.6，2.5 Hz，2H）3 組氫化學(xué)位移及偶合常數(shù)表明代謝物1 有2 個對稱的1，2，4-三取代苯環(huán)，δ1.37（s，18H），1.30（s，18H）的峰形及積分表明存在4 個叔丁基，13C NMR 譜觀察到δ148.6，148.2，139.3，125.4，124.9，119.9 共6 組芳香碳信號，結(jié)合分子式C28H42O 進(jìn)一步證明有2個對稱的苯環(huán)存在且二者通過氧原子連接。與文獻(xiàn)［10］對照，數(shù)據(jù)基本一致，鑒定代謝物為2，2′-oxybis（1，4）-di-tert-butylbenzene。

代謝物2 的1H NMR 譜δ6.65，6.53 的單峰及13C NMR 譜δ113.7～163.9 的12 個芳香碳，推測存在2 個五取代苯，166.0 是酯羰基碳。1H NMR譜2.39（s，3H），2.38（s，3H），2.14（s，3H）是3個取代在苯環(huán)上的甲基，5.06（s，2H）是與氧或羥基相連的亞甲基。結(jié)合ESIMS 數(shù)據(jù)剩余的相對分子質(zhì)量，將剩余的結(jié)構(gòu)單元歸屬為羥基和氧。與文獻(xiàn)［11］對照，數(shù)據(jù)基本一致，鑒定為livistone B。

代謝物3 的1H NMR 譜比代謝物2 多出1 個甲氧基信號δ3.52（s，3H）。對比剩余數(shù)據(jù)表明它們其他的結(jié)構(gòu)單元一致，因此代謝物3 是2 中的1 個羥基變?yōu)榱思籽趸难苌铮c文獻(xiàn)［12］對照，數(shù)據(jù)基本一致，鑒定為simplicildone A。

代謝物4 的1H NMR 譜比代謝物2 多出δ3.64（q，J= 7.0 Hz，2H），1.19（t，J= 7.0 Hz，3H）的乙氧基信號，ESIMS 譜也顯示前者比后者多出28的相對分子質(zhì)量，根據(jù)化學(xué)位移值可初步判斷該乙氧基連接在脂肪碳上，與文獻(xiàn)［12］對照，數(shù)據(jù)基本一致，鑒定為simplicildone B。

代謝物5 的1H NMR 譜δ10.72（s，1H）及13C NMR 譜δ194.6 比代謝物2 多出1 個醛基，同時后者連羥基的亞甲基（δH4.85，δc56.1）在前者1H NMR 譜中未被觀察到，據(jù)此推測代謝物5 是代謝物2羥甲基轉(zhuǎn)化為醛基的衍生物，與文獻(xiàn)［13］對照，數(shù)據(jù)基本一致，鑒定為botryorhodine B。

代謝物6 的1H NMR 譜δ7.53（dd，J= 8.4，7.2 Hz，1H），7.12（d，J=7.2 Hz，1H），6.83（d，J=8.4 Hz，1H）是苯環(huán)上互為鄰位的3 組氫。滴加重水后根據(jù)1H NMR 譜信號消失情況，發(fā)現(xiàn)有2 個羥基，δ12.46（s，1H）是與羰基形成分子內(nèi)氫鍵的羥基，4.71（s，1H）是另1 個羥基。13C NMR 譜δ162.4，147.1，136.6，117.4，116.2，115.3 再次確認(rèn)了苯環(huán)的存在，此外還顯示有1 個羰基（δ204.6），1 個連羥基的亞甲基（δ66.8）及另2 個亞甲基（δ35.0 和32.7）信號。該代謝物核磁及比旋光度與文獻(xiàn)［14］報道基本一致，鑒定為（-）-regiolone。

代謝物7的1H NMR 譜δ6.64～5.27 有5個雙鍵氫 的 信 號，13C NMRδ140.1～123.8 有10 個 雙 鍵碳，推測可能含有苯環(huán)。1H NMR 譜δ4.04（m，1H）是連羥基的次甲基信號，δ2.17（s，3H）及δ1.30～0.58 之間積分分別為3 的5 組氫是6 個甲基信號，據(jù)此與文獻(xiàn)［15］報道代謝物的核磁及比旋光度數(shù)值對比基本一致，鑒定為citreoanthrasteroid B。

代 謝 物8 的1H NMR 譜 在δ0.71～2.45 高 場 區(qū)的化學(xué)位移（通常為脂肪甲基、亞甲基、次甲基信號）和積分情況以及對應(yīng)的13C NMR 譜δ12.0～56.2 的碳均與典型的甾醇特征吻合［16］，其中δH1.18（s，3H），0.92（d，6.6 Hz，3H），0.86（d，7.2 Hz，6H），0.82（d，7.2 Hz，3H），0.71（s，3H）是6 個甲基信號。此外，δH5.72（s，1H）是雙鍵H信號；13C NMR 譜δ199.5，171.6，123.0 說明存在1 個羰基且與上述雙鍵共軛，據(jù)此與文獻(xiàn)［17］對照，數(shù)據(jù)基本一致，鑒定為豆甾-4-烯-3-酮。

代謝物9 的1H NMR 譜δ12.15（br s，2H）和2.40（s，4H）是羧基H 和連接羧基的亞甲基信號，分別對應(yīng)于13C NMR 譜δ173.4 的羧基碳和28.9 的亞甲基信號，結(jié)合ESIMSm/z119.1［M+H］+的分子離子峰并與文獻(xiàn)［18］對照，數(shù)據(jù)基本一致，鑒定為丁二酸。

代謝物10 的1H NMR 譜δ13.85（br s，2H）是羧基H 信號，對應(yīng)于13C NMR 譜δ161.1 的羰基碳信號，結(jié)合ESIMSm/z91.0［M+H］+的分子離子峰并與文獻(xiàn)［19］對照，數(shù)據(jù)基本一致，鑒定為草酸。

上述代謝物1，3，4，5，7，8首次從Pseudallescheria屬分離得到，豐富了該菌屬的代謝產(chǎn)物庫。文獻(xiàn)報道代謝物2 和3 具有磷酸二酯酶5 抑制活性［20］，代謝物5具有抗枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis、土曲霉菌Aspergillus terreus、尖孢鐮刀菌Fusarium oxysporum活性及抑制人子宮頸癌細(xì)胞（Hela）、臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）、慢性骨髓性白血病細(xì)胞（K562）增殖活性［13］，代謝物7 具有抗表皮葡萄球菌Staphylococcus epidermidis， 蠟樣芽孢桿菌Bacillus cereus、副溶血弧菌Vibrio parahaemolyticus活性及乙酰膽堿酯酶抑制活性［21］，但尚未見所分離代謝物抗大腸桿菌活性的研究報道。本文活性測試結(jié)果顯示，代謝物1，4，5，6對人致病性O(shè)6 血清型大腸桿菌MIC 分別為50，12.5，25，100 μg/mL，代謝物1，5 對禽致病性O(shè)78 血清型大腸桿菌MIC 均為100 μg/mL，其余所測MIC 值均高于200 μg/mL（陽性對照頭孢拉定對O6 和O78血清型大腸桿菌MIC 分別為3.13 和6.25 μg/mL）。代謝物4，5 對O6 型大腸桿菌活性相對較強(qiáng)，且結(jié)構(gòu)中含有的容易修飾的活潑位點較多，如羥基、芳甲基、醛基等，因此可優(yōu)先考慮作為抗O6 血清型大腸桿菌的先導(dǎo)代謝物開展結(jié)構(gòu)改造研究。禽大腸桿菌是由致病性大腸桿菌所引起的禽病，是危害家禽養(yǎng)殖業(yè)的重要傳染病之一［22］，其中O78型大腸桿菌引起的禽大腸桿菌病在國內(nèi)較為常見［23］，但專用的防治獸藥極少，后續(xù)有必要開展代謝物1，5 防治O78 型禽大腸桿菌病的體內(nèi)療效研究。