紫花苜蓿與垂穗披堿草混播比例對其抗寒生長生理特征的影響

劉彩婷，毛麗萍，阿依謝木，3，于應(yīng)文，3，沈禹穎，3*

（1. 蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅 蘭州 730020；2. 蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730020；3. 蘭州大學(xué)草業(yè)科學(xué)國家級實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，甘肅 蘭州 730020）

紫花苜蓿（Medicago sativa）含豐富的蛋白質(zhì)，是世界上最重要的牧草，素有“飼草之王”的美稱［1-2］。自2012年農(nóng)業(yè)農(nóng)村部啟動“振興奶業(yè)苜蓿發(fā)展行動”以來，我國紫花苜蓿需求量不斷增加，每年政策性支持苜蓿種植面積為3.33×104~6.67×104hm2，據(jù)中國草業(yè)統(tǒng)計(jì)，截至2019 年全國苜蓿種植面積達(dá)231.8×104hm2，有力促進(jìn)了草畜產(chǎn)業(yè)發(fā)展［3-4］。然而，在我國青藏高原地區(qū)，紫花苜蓿往往面臨越冬率低的問題，制約著紫花苜蓿草地的建植與發(fā)展［5-7］，加之該地區(qū)牧草多以抗寒性強(qiáng)的禾草為主，家畜所需養(yǎng)分以能量類粗纖維為主，粗蛋白供應(yīng)嚴(yán)重不足，難以滿足草食家畜健康生長需求［8］。聚焦紫花苜?？购畽C(jī)理，可為高寒區(qū)引入蛋白含量高的優(yōu)質(zhì)紫花苜蓿，為該地區(qū)草地質(zhì)量的提升提供技術(shù)保障，目前其已成為寒區(qū)苜蓿種植研究熱點(diǎn)之一。

近年來，對紫花苜?？购匝芯考杏谄淇购贩N的篩選，有學(xué)者采用多點(diǎn)試驗(yàn)評估本地紫花苜蓿與引進(jìn)品種的抗寒性，表明本地品種環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)，其抗寒性優(yōu)于引進(jìn)品種［9］；耐寒性強(qiáng)的紫花苜蓿其根頸可溶性糖含量高，能防止細(xì)胞液凝結(jié)形成小冰晶對植物根系產(chǎn)生傷害而起到保護(hù)作用，與秋眠級無直接相關(guān)性［10］；紫花苜蓿對低溫的響應(yīng)，表現(xiàn)在其葉片的丙二醛、可溶性糖和脯氨酸含量均較對照有所提升［11］。研究表明，在松嫩平原，紫花苜蓿與無芒雀麥（Bromus inermis）、草地羊茅（Festuca pratensis）分別以30%比例混播時(shí)，越冬期其根系的可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量分別較單播提高14.9%、3.1%和18.0%，表現(xiàn)出混播可提高苜?？购芰Γ?2-14］。但在青藏高原高海拔地區(qū)，紫花苜蓿與當(dāng)家草種垂穗披堿草（Elymus nutans）的混播能否提高其抗寒性，不同混播比例對紫花苜蓿苗期的抗寒生長表型及生理特征的綜合影響尚不明確。因此，本研究在控制低溫下，設(shè)置紫花苜蓿與垂穗披堿草4 個混播比例，研究不同混播比例下紫花苜蓿的地上、地下形態(tài)和植株生理特征對低溫的響應(yīng)，并采用隸屬函數(shù)法對其低溫適應(yīng)性進(jìn)行綜合評價(jià)，為高海拔寒區(qū)紫花苜蓿草地的成功建植提供一定理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

盆栽培養(yǎng)于2021 年3 月至5 月在蘭州大學(xué)榆中校區(qū)智能溫室（35°56′N，104°10′E，海拔1720~1900 m）開展。試驗(yàn)材料為紫花苜蓿“龍牧806”（M. sativacv. Longmu 806，MS）（休眠級為1［15］）及垂穗披堿草，分別來源于黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)院和甘肅猛犸農(nóng)業(yè)有限公司，純凈度分別≥90%和≥95%，發(fā)芽率分別為80%和85%。盆栽試驗(yàn)采用草炭∶蛭石∶河沙=1∶1∶1 混合基質(zhì)培養(yǎng)，相對含水量為19.7%，pH 值為6.2，速效氮含量為128.6 mg·kg-1、速效磷含量為58.2 mg·kg-1、速效鉀含量為130.5 mg·kg-1。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

混播設(shè)計(jì)：設(shè)置紫花苜蓿與垂穗披堿草4 個混播處理：紫花苜蓿占比分別為100%、70%、50%、30%，即MS100%、MS70%、MS50%和MS30%，各處理具相同播種密度（每盆10 株，花盆大小為直徑21 cm×高12 cm），播深2.5~3.0 cm，株距2.0 cm。每個播種比例16 盆，4 次重復(fù)，共64 盆，完全隨機(jī)排列放置。

溫度處理：在25 ℃下育苗后，先轉(zhuǎn)入15 ℃下低溫培養(yǎng)10 d 后，再轉(zhuǎn)入5 ℃下低溫培養(yǎng)10 d（圖1）。各低溫階段培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)箱內(nèi)光照設(shè)置為3 個階段：6：00 am-9：00 am 和18：00 pm-20：00 pm 段為弱光照，光強(qiáng)為11000 lx；9：00 am-18：00 pm 為強(qiáng)光照，光強(qiáng)17600 lx；20：00 pm-次日6：00 am 為完全暗光。培養(yǎng)箱相對濕度為75%。

圖1 溫度處理過程Fig.1 The process of temperature treatment

1.3 測定指標(biāo)與方法

1.3.1形態(tài)生長指標(biāo) 分別在15 ℃下培養(yǎng)10 d 和5 ℃下培養(yǎng)10 d 后，測定如下指標(biāo)：

株高、分枝數(shù)：用卷尺測定每盆每株紫花苜蓿絕對株高，并統(tǒng)計(jì)主莖基部著生的分枝數(shù)。

葉片形態(tài)：測定每盆中每株紫花苜蓿頂端復(fù)葉中間葉的葉長、葉寬。

生物量：每個混播比例下取4 盆，將每盆中苜蓿的地上與地下分開，地上部分直接在105 ℃殺青30 min 后，于65 ℃烘干至恒重；地下部分清洗干凈后在105 ℃殺青30 min 后，于65 ℃烘干至恒重；最后稱地上、地下干重，計(jì)算生物量，換算成g·m-2，并計(jì)算根冠比。

根系形態(tài)：采用根系分析系統(tǒng)（WinRHIZO，REGENT，加拿大）進(jìn)行各處理單株苜蓿根系形態(tài)掃描，獲得單株總根長、根頸直徑。

1.3.2生理指標(biāo) 紫花苜蓿形態(tài)生長指標(biāo)測定同期，每個混播處理下取4 盆，將每盆中紫花苜蓿新鮮葉片和全部根頸部位分別剪下，清洗干凈，用濾紙吸干表面水分，用錫箔紙包裹投入液氮中，帶回實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)入-80 ℃低溫冰箱冷凍保存。可溶性糖含量采用蒽酮比色法測定［16］；可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍(lán)G-250 法測定［16］；游離脯氨酸含量采用茚三酮比色法測定［16］。

1.4 紫花苜蓿生長生理特性綜合評價(jià)

應(yīng)用Fuzzy 數(shù)學(xué)隸屬函數(shù)法對不同混播比例下紫花苜蓿生長生理特性進(jìn)行抗寒性綜合評價(jià)，其公式如下：

式中：X為紫花苜蓿某一指標(biāo)的測定值，Xmin，Xmax分別為各處理下此指標(biāo)的最小值和最大值，X1為各處理下此指標(biāo)的隸屬值；若指標(biāo)與抗寒性呈負(fù)相關(guān)，則隸屬函數(shù)值為1-X1；最后將各處理紫花苜蓿各指標(biāo)的隸屬值相加，求出平均值后進(jìn)行比較，平均值越大表明植物抗寒適應(yīng)性越強(qiáng)［11］。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 22.0 對不同紫花苜蓿占比下各生長和生理指標(biāo)進(jìn)行單因素方差分析，并用Duncan 法進(jìn)行多重比較（α=0.05）；采用Excel 2016 和Origin 2018 對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫花苜蓿生長特征

15 ℃階段，相比MS100%，MS70%、MS50%和MS30%紫花苜蓿株高分別降低20.1%、34.0%和21.0%（P<0.05），而分枝數(shù)分別提高18.4%、34.0%和28.2%（P<0.05）；5 ℃階段，紫花苜蓿株高隨其占比減少呈增加趨勢，且MS30%分別較MS100%和MS70%高25.8%和28.4%（P<0.05）；MS50%的紫花苜蓿分枝數(shù)最高，較MS100%提高28.1%（P<0.05）（圖2）。

圖2 2 個溫度階段紫花苜蓿在不同混播占比下的株高和分枝數(shù)Fig.2 Plant height and branch number of alfalfa at two temperature stages under different mixed proportion

15 ℃階段，紫花苜蓿葉長和葉寬在各處理下差異均不顯著（P>0.05）；5 ℃階段，MS70%、MS50%和MS30%紫花苜蓿葉長分別較MS100%高28.2%、35.5%和25.5%（P<0.05），而葉寬分別比MS100%低18.2%、24.7%和14.5%（P<0.05）。15 ℃階段，MS70%的紫花苜蓿葉寬長比明顯低于MS30%（P<0.05）；5 ℃階段，MS70%、MS50%和MS30%紫花苜蓿葉寬長比分別較MS100%降低35.7%、44.3%和30.0%（P<0.05）（圖3）。

圖3 2 個溫度階段紫花苜蓿在不同混播占比下葉長、葉寬和葉寬長比Fig.3 Leaf length，width and width/length of alfalfa at two temperature stages under different mixed proportion

15 和5 ℃階段，各組分地上生物量均隨各自占比的增加而增加，總生物量變化為：MS50%>MS30%>MS70%>MS100%，表現(xiàn)出明顯的混播優(yōu)勢。15 ℃階段，MS50%的地上總生物量分別較MS100%、MS70%和MS30%提高173.4%、62.5%和8.6%（P<0.05）；5 ℃階段，MS50%地上總生物量最高，分別較MS100%、MS70%和MS30%提高169.8%、36.7%和6.9%（P<0.05）（圖4）。

圖4 2 個溫度階段及不同混播占比下牧草地上生物量Fig.4 Aboveground biomass of forage at two temperature stages under different mixed proportion

15 ℃階段，MS50%紫花苜蓿根頸直徑為2.1 mm，較MS100%和MS70%分別增大46.8%和21.4%（P<0.05）；5 ℃階段，紫花苜蓿根頸直徑隨其占比降低依次增加，MS50%和MS30%顯著高于MS70%和MS100%（P<0.05）。15 ℃階段，隨紫花苜蓿占比減少其主根長度增加，MS30%紫花苜蓿主根長度分別較MS100%和MS70%長22.1%和12.1%（P<0.05）；5 ℃階段，MS50%分別較MS100%和MS70%長29.2%和28.4%（P<0.05）（圖5）。

圖5 2 個溫度階段紫花苜蓿在不同混播占比下根頸直徑和主根長度Fig.5 Root collar diameter and tap root length of alfalfa at two temperature stages under different mixed proportion

15 和5 ℃階段，MS70%、MS50%和MS30%下紫花苜蓿地下生物量均顯著高于MS100%處理（P<0.05）；垂穗披堿草地下生物量隨紫花苜蓿占比的減少而增加；總地下生物量表現(xiàn)為：MS50%>MS30%>MS70%>MS100%。其中，15 和5 ℃階段，MS50%下地下總生物量均最高，分別為67.64 和92.31 g·m-2，顯著高于MS100%和MS70%處理（圖6）。混播群落中紫花苜蓿根冠比隨其占比的減少而增加。其中，15 ℃階段，MS30%根冠比最高，為0.60，顯著高于其他處理（P<0.05）；5 ℃階段，MS30%紫花苜蓿根冠比為0.65，較MS100%增加58.5%（P<0.05）（圖7）。

圖6 2 個溫度階段及不同混播占比下牧草地下生物量Fig.6 Underground biomass of forage at two temperature stages under different mixed proportion

圖7 2 個溫度階段紫花苜蓿在不同混播占比下根冠比Fig.7 Root/shoot of alfalfa at two temperature stages under different mixed proportion

2.2 紫花苜?？扇苄蕴呛?/h3>

15 和5 ℃階段，葉片和根系可溶性糖含量均在MS50%最高。其中，15 ℃階段，MS50%葉片可溶性糖含量為3.63%，顯著高于其他3 個播種比例，根系可溶性糖含量于MS70%、MS50%和MS30%分別較MS100%提高13.1%、25.2%和14.0%（P<0.05）。5 ℃階段，葉片和根系可溶性糖含量在MS50%分別為9.58%和12.0%，均顯著高于其他3 個播種比例（P<0.05）（圖8）。

圖8 2 個溫度階段紫花苜蓿在不同混播占比下可溶性糖含量Fig.8 Soluble sugar content of alfalfa at two temperature stages under different mixed proportion

2.3 紫花苜蓿可溶性蛋白含量

15 ℃階段，隨紫花苜蓿占比減少，葉片中可溶性蛋白含量增加，MS30%和MS50%分別為9.88 和9.51 mg·g-1，較MS100%分別高26.5%和21.6%（P<0.05），根系可溶性蛋白含量在各紫花苜蓿占比下無差異（P>0.05）；5 ℃階段，葉片可溶性蛋白含量以MS50%最高，為24.35 mg·g-1，較MS100%高23.3%（P<0.05），根系可溶性蛋白含量在MS50%和MS30%較高，分別較MS100%顯著高69.1%、56.7%（P<0.05）（圖9）。

圖9 2 個溫度階段紫花苜蓿在不同混播占比下可溶性蛋白含量Fig.9 Soluble protein content of alfalfa at two temperature stages under different mixed proportion

2.4 紫花苜蓿脯氨酸含量

15 ℃階段，葉片脯氨酸含量在MS50%最高，為4.22 mg·g-1，較MS100%高28.7%（P<0.05），根系脯氨酸含量隨紫花苜蓿占比降低而增加，以MS30%下最高，為5.05 mg·g-1，較MS100%顯著高32.9%（P<0.05）；5 ℃階段，隨紫花苜蓿占比降低，葉片脯氨酸含量上升，MS30%最高，為7.91 mg·g-1，分別較MS100%和MS70%高33.2%和29.9%（P<0.05），根系脯氨酸含量以MS50%最高，分別較MS100%和MS70%高38.0%和27.4%（P<0.05）（圖10）。

圖10 2 個溫度階段紫花苜蓿在不同混播占比下脯氨酸含量Fig.10 Proline content of alfalfa at two temperature stages under different mixed proportion

2.5 紫花苜蓿綜合抗寒評價(jià)

從生理指標(biāo)的變化看紫花苜蓿根系較葉片敏感，因而此處選擇各紫花苜蓿占比下紫花苜蓿的生長表型和3 個根系生理指標(biāo)進(jìn)行綜合評價(jià)其抗寒性。結(jié)果表明，各紫花苜蓿占比下苜蓿的抗寒性有所不同。MS50%處理下隸屬值最高，為0.62，綜合抗寒性最強(qiáng)；其次為MS30%，隸屬值為0.53；MS100%處理的隸屬值最小，為0.26，抗寒性最差，即隨紫花苜蓿占比降低，紫花苜蓿的抗寒性能提高，本研究中紫花苜蓿在混播群落占比30%~50%時(shí)，對低溫的適應(yīng)性提高，抗寒性能提升（表1）。

表1 不同紫花苜蓿占比下各指標(biāo)綜合評價(jià)隸屬值Table 1 Comprehensive evaluation membership value of each index under different proportion of alfalfa

3 討論

3.1 混播比例對低溫下紫花苜蓿生長及產(chǎn)量的影響

豆-禾混播作為理想栽培模式，在形態(tài)、生長發(fā)育方面的互補(bǔ)優(yōu)勢下，牧草生長形態(tài)及產(chǎn)量在不同生態(tài)區(qū)域表現(xiàn)出對環(huán)境的適應(yīng)性［17-19］。本研究中，隨生長溫度從15 ℃降低到5 ℃，混播群落中紫花苜蓿的株高、分枝數(shù)、葉長及主根長未受明顯抑制，其葉寬、葉寬長比和根頸直徑等減小，這與前人在紫花苜蓿單播時(shí)的研究結(jié)果相吻合［20-22］；但本研究紫花苜蓿在占比30%~50%下表現(xiàn)較優(yōu)，這與前人在部分低海拔、高緯度寒冷地區(qū)的研究結(jié)果相似。以往寒冷地區(qū)的研究表明，在加拿大紫花苜蓿以11%~33%占比與山丹雀麥（Bromus riparius）混播時(shí)的群落產(chǎn)量較單播顯著提高16%~32%［23］，在吉林省紫花苜蓿以50%占比與羊草（Leymus chinensis）混播時(shí)群落產(chǎn)量較單播提高33%［24］，松嫩腹地紫花苜蓿與羊草混播占比各為50%時(shí)，其葉面積和生物量分別較單播提高46%和96%［25］；在部分溫帶地區(qū)，紫花苜蓿占比≥50%時(shí)，群落生長表現(xiàn)出較強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)性，如內(nèi)蒙古西遼平原紫花苜蓿與3 種禾草混播和美國西部地區(qū)紫花苜蓿與4 種禾草混播時(shí)，紫花苜蓿占比為67%~75%的群落產(chǎn)量最高［26-27］。說明紫花苜蓿與禾草的混播比例在寒冷和溫帶地區(qū)具較大差異性，其可能原因是溫度可通過調(diào)控合理混播比例來實(shí)現(xiàn)組分對資源的充分利用，進(jìn)而提高混播牧草生長對環(huán)境的適應(yīng)能力。

3.2 混播比例下紫花苜蓿生理特性對低溫的響應(yīng)

豆-禾混播合理搭配不僅在形態(tài)、生長發(fā)育方面存在互補(bǔ)，而且在營養(yǎng)資源利用方面也具有較好的互補(bǔ)性，可以通過優(yōu)化養(yǎng)分利用來提高牧草對生境的適應(yīng)性［28-29］。如寒冷脅迫下，植物積累更多滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來抵御寒冷環(huán)境［16］。本研究中，隨溫度降低混播較單播紫花苜蓿根系和葉片可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量明顯上升，根系上升幅度更大，對紫花苜蓿安全越冬貢獻(xiàn)更大。不同混播比例紫花苜蓿根系對低溫脅迫的貢獻(xiàn)不一，其中以紫花苜蓿占比50%時(shí)貢獻(xiàn)最大，且5 ℃階段均比15 ℃階段約高出1 倍；黃麗琴等［30］報(bào)道，紫花苜蓿占比33%與禾草混播時(shí)，紫花苜蓿根系可溶性糖含量最高；申曉慧等［31］以不同品種紫花苜蓿占比30%與草地羊茅混播，紫花苜蓿根系可溶性糖、可溶性蛋白及游離脯氨酸含量均隨溫度降低而增加，均于最冷月（11 月中旬）達(dá)最大值，且與單播處理差異顯著。說明低溫環(huán)境下，紫花苜蓿與禾草混播對紫花苜蓿根系抗寒物質(zhì)積累有重要影響，通過提高紫花苜蓿根系抗寒滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的大量積累，降低其根系細(xì)胞質(zhì)溶液的凝固點(diǎn)，以有效防止細(xì)胞液凝結(jié)形成小冰晶對其產(chǎn)生傷害作用，進(jìn)而提高其抗寒性能［11］。因此，紫花苜蓿與禾草混播具明顯抗寒優(yōu)勢。

3.3 紫花苜?？购跃C合評價(jià)

抗寒性是植物在寒冷環(huán)境長期適應(yīng)中通過本身遺傳變異和自然選擇獲得的一種抗寒能力，有許多其他重要的因素控制植物抗寒性［32］，僅憑單一生理指標(biāo)無法全方位反映植物抗寒性［33-34］。因此，評價(jià)植物抗寒性不僅需選擇適宜指標(biāo)，更需科學(xué)準(zhǔn)確的評價(jià)方法。當(dāng)前評價(jià)植物抗寒性常用方法主要有隸屬函數(shù)法、主成分分析、聚類分析法等，其中，隸屬函數(shù)法能全方位篩選出與抗寒性顯著相關(guān)的關(guān)鍵指標(biāo)，揭示不同植物間抗寒性差別，已廣泛運(yùn)用于老芒麥（Elymus sibiricus）［35］、垂穗披堿草［36］、燕麥（Avena sativa）［37］、紅三葉（Trifolium pratense）［38］等的抗寒抗旱性研究中。本研究運(yùn)用隸屬函數(shù)法，從紫花苜蓿形態(tài)及根系生理角度，綜合分析不同紫花苜蓿占比下紫花苜蓿的抗寒性，得出混播群落中紫花苜蓿占比30%~50%下其對低溫具較好適應(yīng)性。

4 結(jié)論

紫花苜蓿與垂穗披堿草混播較單播更能提升紫花苜蓿的抗寒性，且不同紫花苜蓿占比下紫花苜蓿形態(tài)生長和生理特征對低溫的適應(yīng)性不同。隨生長過程中溫度的持續(xù)降低，紫花苜蓿較低占比下其株高、分枝數(shù)、根頸直徑、主根長度、生物量等具較好低溫適應(yīng)性，同時(shí)可積累更多可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來抵御嚴(yán)寒，保證生長。綜合評價(jià)得出，紫花苜蓿占比50%下其抗寒性最強(qiáng)，其次是30%處理。因此，30%~50%的紫花苜蓿與垂穗披堿草混播，是研究區(qū)紫花苜蓿-禾草混播草地建植較適宜比例。