根際促生菌的篩選及其在尾礦改良中的應(yīng)用

陳意超，孫曉瑩，2，解智杰，2，周攀，張露，高雪莉，李東*，劉曉風(fēng)

（1. 中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所，四川 成都 610041；2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 100049）

尾礦廢棄地作為一種特殊的生境類型［1］，養(yǎng)分匱乏、結(jié)構(gòu)松散、持水性差以及面斜坡陡等惡劣的特性嚴(yán)重制約了礦區(qū)植被恢復(fù)。如何經(jīng)濟(jì)有效地實(shí)現(xiàn)礦砂基質(zhì)改良，攻克綠墾作物移栽定植困難、提高植被存活率已成為礦區(qū)生態(tài)修復(fù)所面臨的緊迫任務(wù)。

當(dāng)前針對(duì)尾礦改良的有效途徑并不多見，主要以污泥法和客土法為主，然而這些改良方式均存在工程量巨大的缺陷［2］。利用根際促生菌（plant growth promoting rhizobacteria，PGPR）與植物的互作機(jī)制，優(yōu)化基質(zhì)微生物群落組成、提高植物逆境抗性、改善礦砂理化性質(zhì)，為實(shí)現(xiàn)低成本尾礦改良和植被恢復(fù)提供了可能。以污染物降解，氮素固定和磷、鉀元素的活化，吲哚乙酸（indole-3-acetic acid，IAA）合成以及分泌1-氨基環(huán)丙烷羧酸（1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid，ACC）脫氨酶為主要應(yīng)用功能的植物根際促生菌已經(jīng)廣泛應(yīng)用于障礙土壤的修復(fù)與防治中［3］。例如，石油污染土地的微生物治理，生物菌肥對(duì)貧瘠土壤的改良，抗鹽、抗堿功能微生物強(qiáng)化植物對(duì)鹽堿地的修復(fù)等。不僅如此，根際促生菌還可通過(guò)胞外絡(luò)合、胞外沉淀和胞內(nèi)積累等方式實(shí)現(xiàn)對(duì)礦砂重金屬的生物鈍化以降低其對(duì)植物的毒害作用［4］。另外，根際微生物作為土壤形成過(guò)程最活躍的生物成分，它在加速土壤形成和養(yǎng)分循環(huán)，誘導(dǎo)根系產(chǎn)生更多的分泌物，進(jìn)一步改良基質(zhì)性狀等方面都有重要意義［5］。

千葉蓍（Achillea millefolium）是一種耐寒、耐旱、適應(yīng)性強(qiáng)且對(duì)栽培基質(zhì)養(yǎng)分要求較低的芳香植物，在精油提取、活性成分、醫(yī)療保健和栽培觀賞等方面具有較高的研究和應(yīng)用價(jià)值。然而，在中性、偏堿性金屬尾礦中有機(jī)質(zhì)和養(yǎng)分的極端缺乏成了限制包括千葉蓍在內(nèi)的大多數(shù)植物定植和生長(zhǎng)的主要原因［6］，因此，在利用根際促生菌作為核心改良措施的同時(shí)，適當(dāng)補(bǔ)充有機(jī)質(zhì)和養(yǎng)分同樣是確保礦砂植被恢復(fù)的關(guān)鍵。具備多孔結(jié)構(gòu)的生物炭不僅能夠?yàn)闃O端條件下的根際促生菌提供良好的生境，其較大的比表面積與高電荷密度還能吸附礦砂中的游離重金屬［7-8］。糞肥通常是礦區(qū)最為廉價(jià)的有機(jī)物料之一，它不僅能改善礦砂的物理結(jié)構(gòu)，增加有機(jī)質(zhì)與養(yǎng)分含量，提高礦砂微生物和酶活性［9-10］，與生物炭協(xié)同施用還可增強(qiáng)礦砂水肥保持能力［11］。本試驗(yàn)利用適量糞肥、生物炭、混合促生菌及其組合作為礦砂基質(zhì)改良劑，采用食藥兼?zhèn)涞慕?jīng)濟(jì)作物千葉蓍作為綠墾植被，通過(guò)分析植株生長(zhǎng)指標(biāo)、礦砂養(yǎng)分含量、酶活性和千葉蓍根際微生物群落組成，重點(diǎn)評(píng)價(jià)根際促生菌對(duì)氮素的固定作用以及對(duì)礦砂基質(zhì)中磷、鉀元素的活化與利用能力，以探尋尾礦廢棄地植被恢復(fù)與生態(tài)重建的替代措施。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

根際促生菌菌種來(lái)源：取自包頭市石拐區(qū)爬榆樹鐵尾礦庫(kù)原生植被［黃葵（Abelmoschus moschatus）、艾菊（Ginger plan）、豬毛菜（Salsola collina）、蒺藜（Tribulus terrestris）、天人菊（Gaillardia pulchella）、千葉蓍、地椒（Thymus quinquecostatus）、黃花草木樨（Melilotus suavcolen）］根際土。供試鐵尾礦砂：取自包頭市石拐區(qū)爬榆樹鐵尾礦庫(kù)（N 40°48'，E 110°14'），pH 7.51，有機(jī)質(zhì)含量為3.64 g·kg-1，堿解氮含量為2.85 mg·kg-1，速效磷含量為4.29 mg·kg-1，全磷含量為5.88 g·kg-1，速效鉀含量為49.30 mg·kg-1，全鉀含量為7.47 g·kg-1。供試糞肥：發(fā)酵羊糞，含水率為23.98%，有機(jī)質(zhì)含量為49.26%，全氮含量為8.96 g·kg-1，全磷含量為4.71 g·kg-1，全鉀含量為9.12 g·kg-1。供試生物炭：由四川大宇中和農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司提供，主要原料為農(nóng)作物秸稈，碳化溫度為500~600 ℃。供試植物：千葉蓍，由中國(guó)科學(xué)院植物研究所提供。

1.2 供試培養(yǎng)基

溶菌肉湯培養(yǎng)基（luria-bertani，LB）用于細(xì)菌的分離和保藏，配方：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，蒸餾水1000 mL，瓊脂粉12 g（液體培養(yǎng)基不加），pH 7.0~7.2。

高氏一號(hào)培養(yǎng)基用于放線菌的分離和保藏，配方：可溶性淀粉20 g，KNO31 g，K2HPO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，NaCl 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，蒸餾水1000 mL，瓊脂粉12 g（液體培養(yǎng)基不加），pH 7.4~7.6。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar，PDA）用于真菌的分離和保藏，配方：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1000 mL，瓊脂粉12 g（液體培養(yǎng)基不加）。

DF（dworkin and foster）培養(yǎng)基以及ADF 培養(yǎng)基［12］用于區(qū)別具有ACC 脫氨酶的促生菌及其活性測(cè)定，DF 培養(yǎng)基配方：（NH4）2SO42.0 g，MnSO4·7H2O 0.2 g，KH2PO44.0 g，Na2HPO46.0 g，檸檬酸2.0 g，葡萄糖2.0 g，葡萄糖酸鈉2.0 g，溶液Ⅰ與溶液Ⅱ各取0.1 mL，蒸餾水1000 mL，瓊脂粉12 g（液體培養(yǎng)基不加），pH 7.2。其中溶液Ⅰ：CuSO4·5H2O 78.22 mg，MoO310 mg，H3BO310 mg，ZnSO4·7H2O 124.6 mg，MnSO4·H2O 11.9 mg，以上溶解于100 mL 無(wú)菌蒸餾水中。溶液Ⅱ：FeSO4·7H2O 100 mg，將其溶于10 mL 已滅菌的蒸餾水中，充分振蕩。ADF培養(yǎng)基：把ACC 溶于超純水，用細(xì)菌過(guò)濾器過(guò)濾滅菌，加入到不含有（NH4）2SO4且預(yù)先滅菌的DF 培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)ACC 的終濃度為3.0 mmol·L-1。

多碳源低氮培養(yǎng)基［13］（combined carbon medium，CCM）用于分析根際菌的IAA 合成能力，配方為溶液Ⅲ：KH2PO40.2 g，NaCl 0.1 g，K2HPO40.8 g，Na2FeEDTA 28 mg，鉬酸鈉25 mg，酵母浸膏100 mg，甘露醇5 g，蔗糖5 g，乳酸鈉0.5 mL，蒸餾水900 mL；溶液Ⅳ：MgSO4·7H2O 0.2 g，CaCl2·2H2O 0.06 g，蒸餾水100 mL。溶液Ⅲ、Ⅳ分別滅菌，冷卻至50 ℃左右混合后再加入生物素（5 μg·L-1）和維生素（10 μg·L-1）各0.5 mL。

Ashby 無(wú)氮培養(yǎng)基［14］用于初篩獲取具有固氮能力的促生菌，配方：甘露醇10 g，KH2PO40.2 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，NaCl 0.2 g，CaSO4·2H2O 0.1 g，CaCO35.0 g，蒸餾水1000 mL，pH 6.8~7.0。

NFM（nitrogen free medium）液體培養(yǎng)基［15］用于定量分析促生菌的固氮酶活性，配方：蘋果酸5.0 g，KOH 4.5 g，K2HPO40.5 g，CaCl2·2H2O 0.02 g，NaCl 0.1 g，Na2MoO4·2H2O 0.002 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，生物素10 μg，0.5%溴麝香草酚藍(lán)5 mL，蒸餾水1000 mL，pH 7.0。

Pikovskaya 培養(yǎng)基［16］用于初篩判斷和定量分析促生菌的溶磷能力，配方：葡萄糖10.0 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，（NH4）2SO40.5 g，MnSO4·7H2O 0.03 g，Ca3（PO4）25.0 g，蒸餾水1000 mL，瓊脂粉12 g（液體培養(yǎng)基不加），pH 值7.2~7.4。

Александров 硅酸鹽細(xì)菌培養(yǎng)基［17］用于初篩判斷和定量分析促生菌的解鉀能力，配方：MgSO4·7H2O 0.5 g，F(xiàn)eCl3·6H2O 0.005 g，CaCO30.1 g，土壤礦物或玻璃粉0.5 g，蒸餾水1000 mL，瓊脂粉12 g（液體培養(yǎng)基不加），pH 7.0~7.5。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1根際促生菌的分離篩選 適度用力抖落植物根表土，用無(wú)菌水和無(wú)菌毛刷洗涮植物根部，得到根際土壤原液，將其稀釋105、106、107、108倍后，分別涂布于LB 培養(yǎng)基、高氏一號(hào)培養(yǎng)基以及PDA 培養(yǎng)基上，28 ℃倒置培養(yǎng)2~5 d 后，挑取不同類型的典型單菌落，反復(fù)純化后4 ℃斜面保藏。

1.3.2菌株促生特性的測(cè)定 固氮能力定性與定量分析［18］：將各分離純化后的菌株分別接種于Ashby 無(wú)氮固體培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)并觀察菌株的生長(zhǎng)情況，確定其是否具有固氮能力；將能夠在Ashby 無(wú)氮固體培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)的菌株接種于LB 培養(yǎng)基內(nèi)富集培養(yǎng)36 h 后，在無(wú)菌操作條件下，4 ℃離心5 min 收集菌體，用0.9%的生理鹽水洗滌3~4 次后，重懸于NFM 液體培養(yǎng)基中（利用培養(yǎng)基本身作參比調(diào)至OD600=1），吸取此濃度的各菌懸液5 mL 于15 mL 西林瓶后密封，抽真空充氬氣反復(fù)數(shù)次（≥5 次）后，用帶有三通閥的注射器抽出2 mL 氣體，注入等體積的乙炔（C2H2），滴蠟密封，于28 ℃，240 r·min-1水浴振蕩反應(yīng)培養(yǎng)2 h 后注入0.25 mL 30%三氯乙酸終止反應(yīng)，取100 μL 氣體用氣相色譜法分析乙烯（C2H4）的含量。C2H4測(cè)定完成后離心破碎，通過(guò)Bradford 法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，用于計(jì)算固氮酶活性（nmol C2H4·mg-1Pr·h-1）。

溶磷和解鉀能力分析［19］：將各菌株分別接種于以磷酸三鈣或礦砂為磷源的Pikovskaya 培養(yǎng)基與以鉀礦石或礦砂為鉀源的Александров 硅酸鹽細(xì)菌培養(yǎng)基中，利用未接菌處理作為空白對(duì)照，28 ℃，240 r·min-1連續(xù)培養(yǎng)3 d后，于12000 r·min-1離心5 min，取上清液分別用鉬銻抗比色法和原子吸收火焰光度法測(cè)定可溶性磷與可溶性鉀含量［20］。

1-氨基環(huán)丙烷羧酸（ACC）脫氨酶活性測(cè)定：參照孫曉瑩［21］的方法，以單位蛋白含量的細(xì)菌菌體在單位時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生α-KA（α-丁酮酸）的量，即（μmol α-KA·mg-1Pr·h-1）表示菌株ACC 脫氨酶的活性，其中α-K A 含量測(cè)定以pH=8.5 的0.1 mol·L-1Tris-HCl 緩沖溶液稀釋樣品至0.025~0.300 μmol·mL-1于540 nm 處測(cè)定的吸光度值；細(xì)胞破碎液中總蛋白含量采用Lowry 法測(cè)定。

吲哚乙酸（IAA）合成能力分析：參考Glickmann 等［22］的方法，將各根際促生菌按5%的體積比接種到含有1 g·L-1NH4NO3和100 mg·L-1L-色 氨 酸 的CCM 液 體 培 養(yǎng) 基 中，于28 ℃，240 r·min-1連 續(xù) 培 養(yǎng)3 d 后，利 用Salkowski 法測(cè)定培養(yǎng)液上清液的IAA 含量。

種子萌發(fā)試驗(yàn)：參照孫曉瑩［21］的方法，挑選外觀一致、大小均勻、成熟飽滿的千葉蓍種子進(jìn)行表面消毒（70%酒精浸泡5 min，無(wú)菌水沖洗3 次），每50 粒為1 組，均勻放置于已滅菌且鋪有3 層濾紙的平皿內(nèi)，將具有潛在促生功能的菌種發(fā)酵液分別稀釋至菌體濃度為103、105、107、109CFU·mL-1后取5 mL 稀釋液注入平皿內(nèi)將濾紙充分均勻浸濕，每個(gè)濃度設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，以滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基做對(duì)照。在濕度90%以上的28 ℃恒溫箱內(nèi)持續(xù)培養(yǎng)7 d后，測(cè)定各處理種子萌發(fā)率、幼苗根長(zhǎng)以及平均鮮重。

1.3.3菌株的分子生物學(xué)鑒定、拮抗效應(yīng)測(cè)試及組配 參照孫曉瑩［21］的方法，利用細(xì)菌DNA 提取試劑盒（北京）提取上述根際促生菌的菌體總DNA，并將其作為模板，采用通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCC TGGCTCAG-3′）和1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。將擴(kuò)增得到的PCR 產(chǎn)物移交至上海美吉生物進(jìn)行16S rDNA 菌種鑒定，將測(cè)序所得基因序列提交GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)，用BLAST 進(jìn)行序列對(duì)比分析，確定菌株的分類地位。

將分離得到的高效目標(biāo)菌株用濾紙片法進(jìn)行拮抗效應(yīng)測(cè)試，選擇高效且沒(méi)有拮抗效應(yīng)的優(yōu)良菌株組配混合促生菌液。

1.3.4礦砂改良盆栽試驗(yàn) 盆栽試驗(yàn)設(shè)9 個(gè)處理，具體處理方式見表1，每個(gè)處理重復(fù)5 盆，共45 盆，隨機(jī)排列置于溫網(wǎng)大棚內(nèi)（石拐區(qū)爬榆樹嘎查環(huán)境修復(fù)植物資源圃室外）。試驗(yàn)盆缽規(guī)格：盆口直徑23 cm，盆底直徑18 cm，高20 cm。所有生物炭（5 g）和糞肥（30 g）與去除雜質(zhì)的礦砂（5 kg）拌勻裝盆，選取長(zhǎng)勢(shì)一致的千葉蓍幼苗進(jìn)行移栽，每盆3 叢，1 叢2 株，每株接種混合促生菌液0.2 mL（利用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法確定各菌株的菌體濃度后，再分別用滅菌LB 培養(yǎng)基稀釋至105CFU·mL-1，并按照一定的比例混合均勻），移栽深度5 cm 左右，在千葉蓍生長(zhǎng)期間（2018 年11 月30-2019 年7 月21 日）及時(shí)除蟲、除草。此外，其他農(nóng)學(xué)管理措施一致（間隔4 d 澆水1 次，每盆每次250 mL）。

表1 盆栽試驗(yàn)處理Table 1 The treatments for pot experiment

1.3.5測(cè)定項(xiàng)目及方法 收獲時(shí)分別測(cè)定不同處理下千葉蓍的叢徑、株高，并以盆為單位小心地從盆中取出植株，去除根際附著不緊密的礦砂，用無(wú)菌刷收集附著緊密的部分，封入無(wú)菌袋，置于冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室，保存于-80 ℃冰箱備用。收集完根際樣品后再測(cè)定根長(zhǎng)以及地上部和根的鮮重，植株樣品于105 ℃下殺青30 min 后，于80 ℃烘至恒重（記為干重）；將盆內(nèi)礦砂混勻后適量采集，用于測(cè)定理化性質(zhì)和酶活性。

根際微生物樣品（每組處理隨機(jī)選擇其中的3 個(gè)重復(fù)）交由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，其中使用到的DNA 提取試劑盒為OMEGA soil DNA kit（美國(guó)），V3~V4 區(qū)間的擴(kuò)增引物為338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）/806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′），測(cè)序平臺(tái)為Illumina Miseq PE300。測(cè)序序列使用美吉云平臺(tái)（i-sanger）進(jìn)行質(zhì)量控制，對(duì)97%相似水平的OTU 代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析。

采用堿解擴(kuò)散法［20］測(cè)定礦砂堿解氮（1 mol·L-1NaOH）；采用凱氏定氮法［20］測(cè)定千葉蓍植株全氮（水楊酸-鋅粉）和礦砂全氮（高錳酸鉀-鐵粉）含量；采用原子吸收火焰光度法［20］測(cè)定植物樣全鉀（H2SO4-H2O2）和礦砂速效鉀（1 mol·L-1NH4OAc）含量；采用釩鉬黃比色法［20］測(cè)定植株全磷（H2SO4-H2O2）含量；采用鉬銻抗比色法［20］測(cè)定礦砂速效磷（0.5 mol·L-1NaHCO3）含量；采用苯酚-次氯酸鈉比色法［17］測(cè)定脲酶活性，以1 g 干砂24 h 催化尿素產(chǎn)生的銨態(tài)氮（NH4+-N）質(zhì)量表示，單位為（NH4+-N mg·g-1·24 h-1，37 ℃）；采用苯磷酸二鈉比色法［17］測(cè)定磷酸酶活性，以1 g 干砂24 h 催化苯磷酸二鈉產(chǎn)生的苯酚質(zhì)量表示，單位為（PhOH mg·g-1·24 h-1，37 ℃）；采用3，5-二硝基水楊酸比色法［17］測(cè)定轉(zhuǎn)化酶活性，以1 g 干砂24 h 催化蔗糖產(chǎn)生的葡萄糖質(zhì)量表示，單位為（glu.，mg·g-1·24 h-1，37 ℃）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010 統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)，方差分析采用SPSS 17.0 進(jìn)行，比較不同處理各指標(biāo)的平均值采用Duncan 法。

2 結(jié)果與分析

2.1 根際促生菌的篩選

從尾礦庫(kù)區(qū)原生植被根際土中分離得到菌落形態(tài)存在明顯不同的細(xì)菌30 株、放線菌5 株、真菌11 株，其中固氮、溶磷、解鉀、IAA 合成或ACC 脫氨酶分泌能力較優(yōu)的菌株有4 種（表2）。分別為具有固氮作用的KSB21；礦砂溶磷優(yōu)勢(shì)菌KSB1，該菌株同時(shí)具有較強(qiáng)的IAA 合成能力；能夠有效釋放鉀礦石和礦砂難溶性鉀的KSB2；以及ACC 脫氨酶分泌能力最強(qiáng)的KSB7。ACC 脫氨酶可以催化降解乙烯的前體物質(zhì)1-氨基環(huán)丙烷羧酸，從而降低植物體內(nèi)的乙烯含量，以避免逆境條件導(dǎo)致植物過(guò)度分泌乙烯抑制生長(zhǎng)，其是反映促生抗性的重要指標(biāo)。

表2 各根際促生菌的促生功能Table 2 Growth-promoting function of different plant growth promoting rhizobacteria

2.2 根際促生菌株的細(xì)胞形態(tài)特征及其分子生物學(xué)鑒定

各優(yōu)勢(shì)菌株的菌落形態(tài)如表3 所示，進(jìn)一步利用掃描電鏡觀察菌株KSB1、KSB2、KSB7 和KSB21 的細(xì)胞形態(tài)（圖1），發(fā)現(xiàn)前三者菌體特征較為相似均呈長(zhǎng)桿狀，而KSB21 菌體呈短桿狀或橢圓形。同時(shí)對(duì)上述菌株進(jìn)行16S rDNA 測(cè)序，并將所得基因序列提交GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)，用BLAST 進(jìn)行序列對(duì)比分析，結(jié)果顯示菌株KSB1、KSB2 和KSB7 均為假單胞菌屬（Pseudomonassp.）；KSB21 的16S rDNA 基因序列長(zhǎng)度為1371 bp，為根瘤菌屬（Rhizobiumsp.）。

圖1 菌株KSB1、KSB2、KSB7、KSB21 的掃描電鏡圖Fig. 1 Scanning electron microscope of KSB1，KSB2，KSB7，and KSB21

表3 菌落形態(tài)及鑒定結(jié)果Table 3 Colony morphology and identification results

2.3 根際促生菌及其組合對(duì)千葉蓍種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)的影響

由圖2 可知，低菌體濃度（103CFU·mL-1）的根際促生菌液對(duì)千葉蓍種子的萌發(fā)率與幼苗鮮重影響較小，而高菌體濃度（109CFU·mL-1）的菌液對(duì)千葉蓍種子發(fā)芽具有抑制作用。各菌株在菌體濃度為105CFU·mL-1時(shí)對(duì)千葉蓍種子萌發(fā)促進(jìn)作用相對(duì)積極，該菌體濃度下，KSB1 和KSB7 菌液處理千葉蓍種子萌發(fā)率分別達(dá)到97.50%和99.17%，顯著高于對(duì)照（P<0.05），且KSB7 菌液處理的幼苗鮮重較CK 顯著了增加11.12%（P<0.05）。

圖2 不同根際促生菌濃度對(duì)千葉蓍種子發(fā)芽率和幼苗鮮重的影響Fig. 2 Effects of growth promoting rhizobacteria cell concentration on the seed germination rate and seedling fresh weight of A.millefolium

通過(guò)拮抗試驗(yàn)表明4 種菌株之間均不存在相互抑制的作用，可進(jìn)行互配用于制備具有多種促生功能的混合促生菌液。將菌體濃度為105CFU·mL-1的KSB1、KSB2、KSB7 和KSB21 按照體積比為2∶1∶1∶1（COM1）、1∶2∶1∶1（COM2）、1∶1∶2∶1（COM3）、1∶1∶1∶2（COM4）、2∶2∶1∶1（COM5）、1∶2∶2∶1（COM6）、1∶1∶2∶2（COM7）、2∶1∶1∶2（COM8）進(jìn)行互配組合后用于對(duì)千葉蓍種子的浸種萌發(fā)。萌發(fā)試驗(yàn)結(jié)果如圖3 所示，COM3、COM4、COM6處理后的千葉蓍種子萌發(fā)率和根長(zhǎng)≥2 cm 的幼苗比例均顯著高于CK 和其他組合（P<0.05），表明這3 種組合對(duì)千葉蓍的生長(zhǎng)促進(jìn)作用更佳。在礦砂逆境條件下，各促生功能菌的配比需要根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行針對(duì)性的處理，考慮到本試驗(yàn)礦砂速效氮含量極低且根際固氮菌所固定的氮素向植物轉(zhuǎn)移的效率有限，因此盆栽試驗(yàn)選擇了混合促生菌液中固氮菌添加比例較其他組合更高的COM4。

圖3 不同根際促生菌組合處理對(duì)千葉蓍種子萌發(fā)和根長(zhǎng)的影響Fig. 3 Effects of combination treatment of different growth promoting rhizobacteria on seed germination and root length of A. millefolium

2.4 千葉蓍根際微生物的群落組成

不同處理下千葉蓍根際微生物群落組成如圖4 所示，微球菌屬（Micrococcus）是千葉蓍根際環(huán)境中主要的菌屬，其相對(duì)豐度明顯高于其他菌屬。余下的藍(lán)細(xì)菌屬（Cyanobacteria）、黃桿菌屬（Flavobacterium）、糖單孢菌 屬 （Saccharomonospora） 、 噬 氫 菌 屬（Hydrogenophaga）、鏈霉菌（Streptomyces）、鞘氨醇屬（Sphingomonas）、消化鏈球菌屬（Peptostreptococcus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、根瘤菌屬（Rhizobium）的相對(duì)豐度較高。接種根際促生菌會(huì)顯著提高假單胞菌屬和根瘤菌屬在根際環(huán)境中的豐度（P<0.05），施用糞肥會(huì)明顯增加藍(lán)細(xì)菌屬的豐度。與BⅠCF 相比，BⅡCF 處理下藍(lán)細(xì)菌屬和假單胞菌屬豐度顯著提高（P<0.05），而根瘤菌屬的豐度變化并不明顯。

圖4 不同處理對(duì)千葉蓍根際微生物群落組成的影響Fig.4 Effects of different treatment on the composition of microbial community in the rhizosphere of A. millefolium

2.5 不同改良劑對(duì)礦砂堿解氮、有機(jī)質(zhì)含量及酶活性的影響

如表4 所示，與CK 相比，接種促生菌液（B）或添加生物炭（C）對(duì)礦砂堿解氮和有機(jī)質(zhì)含量影響均不顯著；糞肥（F）處理下的堿解氮和有機(jī)質(zhì)含量較CK 分別提高了43.21%和16.24%。在添加生物炭的基礎(chǔ)上接種促生菌液（BC）不能引起礦砂堿解氮和有機(jī)質(zhì)含量的顯著變化；但在施用糞肥的基礎(chǔ)上接種促生菌液（BF）較F 能夠進(jìn)一步增加礦砂有機(jī)質(zhì)含量，這或許是因?yàn)樵诖藯l件下，根際促生菌與千葉蓍形成良好的共生關(guān)系增加了根系分泌物導(dǎo)致的。利用CF 作參比，發(fā)現(xiàn)BⅡCF 處理礦砂堿解氮和有機(jī)質(zhì)含量分別提高了8.47%和7.23%。以上結(jié)果表明，僅接種根際促生菌對(duì)礦砂養(yǎng)分含量的改善效果甚微，糞肥對(duì)根際促生菌的功能發(fā)揮存在至關(guān)重要的影響，生物炭、糞肥和根際促生菌具有協(xié)同作用，三者形成的復(fù)合改良劑具有進(jìn)一步提高礦砂有機(jī)質(zhì)含量并改善速效氮供給的作用。

表4 不同處理對(duì)礦砂養(yǎng)分含量及酶活性的影響Table 4 Effects of different treatments on nutrient content and enzyme activity of iron tailings

脲酶和磷酸酶活性可以表征礦砂有機(jī)氮、磷向有效氮、磷的轉(zhuǎn)化和供應(yīng)能力，蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性能夠反映基質(zhì)熟化程度。施用糞肥（F）較對(duì)照處理（CK）可顯著提高礦砂脲酶、磷酸酶和蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性（P<0.05），接種促生菌液僅能夠增加礦砂磷酸酶活性。各改良劑的兩兩組合處理下3 種礦砂酶活性均以BC 效果較差。通過(guò)比較BF與CF 兩處理之間的差異可知，在施用糞肥的條件下接種促生菌液更有利于礦砂磷酸酶和蔗糖轉(zhuǎn)化酶的活性提高，而在此條件下添加生物炭?jī)H能夠促進(jìn)脲酶活性增加。3 種改良因子的混合處理（BⅠCF 和BⅡCF）下，礦砂脲酶、磷酸酶和蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性較其他處理存在顯著增加（P<0.05），且BⅡCF 處理下的礦砂磷酸酶活性較BⅠCF 增加了6.90%，表明增加促生菌液接種量與提高礦砂磷酸酶活性呈正相關(guān)。

2.6 不同處理對(duì)千葉蓍生長(zhǎng)的影響

叢徑是以叢為單位測(cè)量同一物種不同叢植株的叢冠直徑，其能反映作物的生長(zhǎng)活力，也可作為綠墾恢復(fù)時(shí)種植密度的指導(dǎo)性指標(biāo)。結(jié)合圖5 和表5 可以看出，只接種促生菌液處理（B）對(duì)千葉蓍生長(zhǎng)促進(jìn)作用并不明顯，且該處理下千葉蓍的叢徑和株高較對(duì)照（CK）顯著下降（P<0.05）。這可能與礦砂速效養(yǎng)分低有關(guān)，接種的大量根際微生物在其生長(zhǎng)和繁殖過(guò)程中由于養(yǎng)分缺乏與千葉蓍植株發(fā)生了養(yǎng)分競(jìng)爭(zhēng)。生物炭（C）和促生菌液+生物炭搭配處理（BC）下千葉蓍的根較為細(xì)長(zhǎng)，分別較CK 增長(zhǎng)了17.27%和21.86%，但生物量并未增加。這或許是因?yàn)樯锾磕軌蛭降V砂中的重金屬，從而避免根冠生長(zhǎng)受抑制，但其本身蘊(yùn)含的養(yǎng)分較少難以形成茁壯的根系所致。與CK 相比，施用糞肥（F）可顯著提高千葉蓍的株高和根長(zhǎng)（P<0.05）；且含糞肥處理（BF、CF、BⅠCF、BⅡCF）的千葉蓍叢徑、株高、根長(zhǎng)、地上和地下部分鮮重均有顯著增加（P<0.05）。表明糞肥對(duì)千葉蓍生長(zhǎng)促進(jìn)作用顯著，在糞肥的基礎(chǔ)上，接種促生菌液或添加生物炭對(duì)千葉蓍生長(zhǎng)的影響更為積極。

表5 不同處理對(duì)千葉蓍生長(zhǎng)的影響Table 5 Effects of different treatments on the growth indexes of A.millefolium

圖5 不同處理對(duì)千葉蓍植株生長(zhǎng)狀況的影響Fig.5 Effects of different treatments on plant growth of A. millefolium

植株地上部與地下部的物質(zhì)分配在形態(tài)上常呈一定的比例關(guān)系，在自然條件下受到水分、光照、養(yǎng)分、溫度、激素以及人為耕作等因素的影響。而在試驗(yàn)條件下，影響千葉蓍生長(zhǎng)的各因素得到控制，養(yǎng)分（糞肥施用與否）差異則是最可能造成該比例不同的主要原因，根系作為植物獲取養(yǎng)分的主要器官，當(dāng)養(yǎng)分缺乏時(shí)優(yōu)先滿足根系生長(zhǎng)拓展根系范圍以獲取更多養(yǎng)分。通過(guò)比較不同礦砂改良劑對(duì)千葉蓍根冠比發(fā)現(xiàn)：CK、B、C、BC 處理的根冠比（0.63~0.70）顯著高于養(yǎng)分相對(duì)豐富的F、BF、CF、BⅠCF 以及BⅡCF 處理（0.49~0.55），結(jié)果表明養(yǎng)分是限制千葉蓍生長(zhǎng)的關(guān)鍵因素之一，而施用糞肥能夠有效緩解此類現(xiàn)象。

2.7 不同改良劑對(duì)盆栽系統(tǒng)氮素總量和分布的影響

各處理以盆為單位的千葉蓍植株氮總量均較低，占比不足對(duì)應(yīng)盆栽系統(tǒng)氮素總量的20%（圖6），結(jié)合礦砂堿解氮含量（表3）可說(shuō)明大部分存在于礦砂中的氮素都是植物不能直接利用的無(wú)效氮。與CK 相比，接種促生菌液（B）對(duì)千葉蓍盆栽系統(tǒng)中的氮素總量的影響并不明顯；添加生物炭（C）會(huì)造成礦砂全氮總量和盆栽系統(tǒng)氮素總量的下降；兩者復(fù)配形成的處理（BC）對(duì)千葉蓍植株氮總量、礦砂全氮總量以及盆栽系統(tǒng)氮素總量的影響均不顯著。糞肥的施用會(huì)引入氮素并增加盆栽系統(tǒng)氮素總量，試驗(yàn)結(jié)果表明F 處理的盆栽系統(tǒng)氮素總量較CK 提高了49.36%，其中礦砂全氮總量增加了47.62%，千葉蓍植株氮總量增加了58.40%。

圖6 不同改良劑對(duì)盆栽系統(tǒng)氮素總量和分布的影響Fig. 6 Effects of different modifiers on the total amount and distribution of nitrogen in pot system

以改良劑F 作參比，BF 顯著提高了千葉蓍植株氮總量（P<0.05），且盆栽系統(tǒng)中的氮素總量達(dá)539.36 mg·盆-1，較F 處理增加了11.18%，表明改良措施BF 存在向盆栽系統(tǒng)中固定氮素的因素。藍(lán)細(xì)菌屬和根瘤菌屬兩個(gè)菌屬下的大部分細(xì)菌具有固氮作用，通過(guò)對(duì)比圖4 所示的主要根際微生物種類可知，BF 藍(lán)細(xì)菌屬的豐度水平較F處理無(wú)顯著差異，但根瘤菌屬豐度卻增加了2.13 倍，因此可以認(rèn)為盆栽系統(tǒng)氮素增加的原因是KSB21 定植并發(fā)揮了固氮作用。進(jìn)一步比較BⅠCF 和BⅡCF 盆栽系統(tǒng)中氮素分布情況和總量發(fā)現(xiàn)，前者千葉蓍植株氮總量和盆栽系統(tǒng)氮素總量均顯著低于后者（P<0.05），說(shuō)明根際促生菌液接種量增加時(shí)，生物固氮的作用增強(qiáng)，同時(shí)新增氮素進(jìn)入到千葉蓍植株體內(nèi)。

2.8 不同改良劑對(duì)盆栽系統(tǒng)可利用磷、鉀總量和分布的影響

磷、鉀元素的自然轉(zhuǎn)移相對(duì)困難，因此在盆栽系統(tǒng)中它們的含量較為穩(wěn)定，試驗(yàn)過(guò)程中除施用糞肥會(huì)引起盆栽系統(tǒng)可利用磷、鉀總量增加外，根際促生菌對(duì)難溶性磷、鉀的活化作用是盆栽系統(tǒng)獲得可利用磷、鉀的另一關(guān)鍵途徑?？衫昧住⑩浽谂柙韵到y(tǒng)中一部分會(huì)轉(zhuǎn)移進(jìn)入千葉蓍植株體內(nèi)，另一部分則殘留在礦砂中。由圖7 可知，在單一改良措施中，糞肥施用（F）會(huì)明顯增加盆栽系統(tǒng)可利用磷、鉀總量，且顯著高于接種促生菌液或添加生物炭處理（P<0.05），但后兩者的混合處理（BC）對(duì)盆栽系統(tǒng)可利用磷總量較CK 顯著增加（P<0.05）。與F 相比，BF 處理礦砂有效磷和速效鉀總量分別增加9.45% 和17.11%，千葉蓍植株磷、鉀總量分別增加27.40% 和33.82%，盆栽系統(tǒng)可利用磷、鉀總量分別增加22.54%和22.00%；而在CF 處理下，僅有千葉蓍植株鉀總量和盆栽系統(tǒng)可利用鉀總量分別增加了15.61%和8.32%。以上結(jié)果說(shuō)明：在均施用糞肥的條件下，接種促生菌液有利于對(duì)礦砂難溶性磷和鉀兩種元素的活化；而添加生物炭對(duì)礦砂難溶性磷的有效性轉(zhuǎn)化卻不夠明顯，僅在一定程度上改善礦砂速效鉀的供應(yīng)。

圖7 不同改良劑對(duì)盆栽系統(tǒng)可利用磷、鉀總量和分布的影響Fig.7 Effects of different modifiers on the total amount and distribution of available phosphorus and potassium in pot system

BⅠCF 和BⅡCF 處理下盆栽系統(tǒng)可利用磷、鉀總量，無(wú)論是較CK，還是較各單一改良因子（B、C、F）均有顯著（P<0.05）增加，表明3 種改良因子的混合處理具有協(xié)同作用。將BⅠCF 和BⅡCF 兩者對(duì)比可知：增加促生菌液接種量對(duì)盆栽系統(tǒng)可利用磷、鉀總量的影響不明顯；卻顯著降低了礦砂中的速效鉀總量（P<0.05）；同時(shí)增加了千葉蓍植株鉀總量。這表明增加促生菌液接種量雖然不能夠活化更多的礦砂難溶性鉀，但能夠促進(jìn)已活化的鉀元素從礦砂向千葉蓍植株內(nèi)轉(zhuǎn)移，即增強(qiáng)了千葉蓍對(duì)鉀元素的吸收利用能力。以上結(jié)果表明：試驗(yàn)中接種的根際促生菌發(fā)揮了溶磷和解鉀作用，且增加接種量能強(qiáng)化千葉蓍對(duì)鉀元素的吸收。

3 討論

養(yǎng)分與水分條件是限制絕大多數(shù)尾礦廢棄地植被恢復(fù)的關(guān)鍵因素［23］，然而水分不足還可通過(guò)選育耐旱品種、投施保水劑或人工給水予以克服，但養(yǎng)分缺失導(dǎo)致的作物生長(zhǎng)緩慢、植株矮小、甚至枯亡等問(wèn)題，使得植被恢復(fù)建設(shè)更為棘手，如若大量施肥又會(huì)因礦砂基質(zhì)極差的保肥性能造成大量浪費(fèi)和面源污染。礦砂速效養(yǎng)分中氮、磷、鉀的含量極低，但全磷、全鉀占比較高，因此利用生物固氮、溶磷、解鉀、IAA 合成以及ACC 脫氨酶分泌等作用為核心功能的PGPR 可作為實(shí)現(xiàn)礦砂速效養(yǎng)分含量增加，促進(jìn)綠墾植被旺盛生長(zhǎng)，提高作物逆境抗性最為經(jīng)濟(jì)有效的方式。研究表明PGPR 的菌株特性和作用方式多樣［24］，對(duì)不同生境的適應(yīng)性也存在差異，所以本研究從尾礦原生植被中篩選優(yōu)良根際菌種資源，并特別探究了目標(biāo)菌株在不添加IAA 前體物質(zhì)情況下植物生長(zhǎng)激素的產(chǎn)量，礦砂直接作為底物時(shí)的溶磷、解鉀效果，不同菌體濃度對(duì)綠墾植物的促生情況，以及接種根際促生菌對(duì)植株根際微生物群落組成的影響，這都是以往相關(guān)研究涉及較少的［12，25］。需要指出的是具有促生作用的菌株并非在任何條件下都具有促生作用，如過(guò)高的菌體濃度對(duì)供試種子萌發(fā)存在抑制作用，且具有固氮作用的促生菌KSB21 在種子萌發(fā)過(guò)程中并未表現(xiàn)出顯著的促進(jìn)作用，可能原因是該固氮菌初期固定的氮素主要用于自身繁殖而非直接供給植物。

根際促生菌的固氮、溶磷、解鉀作用會(huì)增加系統(tǒng)中的氮素總量以及可利用磷、鉀總量，然而新增養(yǎng)分在基質(zhì)-作物中的存在和分布受到多種因素的影響，當(dāng)前較多基于盆栽系統(tǒng)的研究只單獨(dú)分析改良劑對(duì)基質(zhì)或作物養(yǎng)分的影響［26-27］，這種做法顯然是不全面的。盆栽系統(tǒng)雖然不是生態(tài)恢復(fù)研究的常用參考系，但該系統(tǒng)能夠更好地反映養(yǎng)分釋放、轉(zhuǎn)移以及流失的規(guī)律。利用該系統(tǒng)作比較可知，接種促生菌液（B）對(duì)盆栽系統(tǒng)中氮素總量、可利用磷、鉀總量以及千葉蓍生長(zhǎng)的影響較CK 并不明顯，僅提高了礦砂磷酸酶活性。這與部分報(bào)道指出的益生菌（共生固氮菌、菌根真菌或根際促生菌）接種對(duì)礦砂結(jié)構(gòu)改良、植株養(yǎng)分獲取和生長(zhǎng)發(fā)育存在積極作用是相悖的［28］。這是因?yàn)楸狙芯恐械V砂基質(zhì)養(yǎng)分極端匱乏，可溶性碳、氮含量低，在不添加碳、氮源的情況下試驗(yàn)初期大量接種根際促生菌容易造成微生物和植物之間的養(yǎng)分競(jìng)爭(zhēng)。一般來(lái)講，養(yǎng)分脅迫存在時(shí)會(huì)優(yōu)先滿足根系養(yǎng)分需求以擴(kuò)張根系范圍獲取更多養(yǎng)分，表現(xiàn)為根系增長(zhǎng)、根毛長(zhǎng)度和密度增加，植株矮化、葉面積變小，根冠比較高，尤以氮、磷脅迫明顯，試驗(yàn)結(jié)果顯示不含糞肥處理的根冠比顯著高于含有糞肥的處理即可作為上述論斷的支撐。

生物炭被認(rèn)為是土壤微生物寄居的佳境，在影響土壤微域性狀的同時(shí)可改善微生物的群落結(jié)構(gòu)［29］。楊僑等［30］利用0.1%~0.3%的生物炭能夠顯著增加銅尾礦砂堿解氮、有效磷含量并明顯提高作物生物量；劉博文［31］利用生物炭為載體制備的根際促生菌肥能夠?qū)ν寥栏牧己妥魑镌霎a(chǎn)起到協(xié)同增效的作用。而在本研究中，與CK相比，添加生物炭（C）對(duì)礦砂磷、鉀含量和千葉蓍的生長(zhǎng)指標(biāo)沒(méi)有明顯改善；生物炭+根際促生菌處理（BC）較CK 僅提高了礦砂磷酸酶活性和千葉蓍根長(zhǎng)。導(dǎo)致這兩種結(jié)果差異的原因，可能在于本試驗(yàn)中礦砂養(yǎng)分過(guò)于貧瘠，限制了部分根際促生菌的生長(zhǎng)繁殖和功能發(fā)揮。

糞肥可明顯增加綠墾作物的叢徑、株高、根長(zhǎng)和生物量，顯著提高礦砂速效養(yǎng)分和酶活性，這與有機(jī)肥對(duì)礦砂改良的效果存在相似性［32］。盆栽系統(tǒng)的引入使得營(yíng)養(yǎng)元素的存在和轉(zhuǎn)移可視化，供試糞肥因本身含有較多的植物養(yǎng)分，所以糞肥處理（F）盆栽系統(tǒng)中的氮素總量以及可利用磷、鉀總量都顯著高于B 和C 處理。在施用糞肥的基礎(chǔ)上，接種促生菌液（BF）或添加生物炭（CF）對(duì)礦砂速效養(yǎng)分含量、相關(guān)酶活性、千葉蓍生長(zhǎng)指標(biāo)，以及盆栽系統(tǒng)氮素固定、難溶性磷鉀活化較僅施糞肥（F）均存在一定程度的提升。究其原因，或許在于糞肥施用后，礦砂養(yǎng)分限制和理化結(jié)構(gòu)得到改善，促生菌液和生物炭的改良、促生作用開始凸顯。此外，糞肥的施用還會(huì)顯著提高礦砂中根瘤菌屬的豐度，其中該菌屬下有120 多種菌具有固氮功能。因此，糞肥施用后盆栽系統(tǒng)氮素總量的增加可能來(lái)源于糞肥本身以及部分具有固氮功能的藍(lán)細(xì)菌的固氮作用。

與BⅠCF 相比，BⅡCF 增加了一倍的根際促生菌液接種量，但千葉蓍根際微生物中根瘤菌屬的豐度水平并無(wú)明顯差異，其原因在于根瘤菌屬是異養(yǎng)型的微生物，它在根際環(huán)境中的豐度受制于千葉蓍根際分泌物的產(chǎn)量，所以其豐度并不會(huì)因接種量的增加而提高。與根瘤菌屬不同的是，藍(lán)細(xì)菌屬中的大部分藍(lán)細(xì)菌是屬于能固氮的自養(yǎng)型微生物。當(dāng)增加KSB1 和KSB2 接種量時(shí)，可活化更多的礦砂難溶性磷、鉀。這些礦質(zhì)元素一部分直接供給千葉蓍，另一部分被具有固氮作用的藍(lán)細(xì)菌吸收利用，使其豐度提高從而固定更多的氮素以表現(xiàn)出盆栽系統(tǒng)氮素總量增加現(xiàn)象。

4 結(jié)論

通過(guò)篩選尾礦自然條件下原生植被的優(yōu)良根際促生菌并將其組配成多功能的促生菌劑，再與具有基質(zhì)改良作用的生物炭和廉價(jià)糞肥結(jié)合應(yīng)用是一種因地制宜且經(jīng)濟(jì)有效的礦砂改良和植被恢復(fù)措施。

試驗(yàn)條件下，上述組合改良措施中的多功能混合促生菌發(fā)揮了其中的固氮、溶磷和解鉀作用，且加大混合促生菌液接種量會(huì)增加礦砂生物固氮的總量并強(qiáng)化千葉蓍對(duì)鉀元素的吸收利用能力。單一改良措施中糞肥的施用對(duì)綠墾作物千葉蓍的生長(zhǎng)促進(jìn)效果最佳，僅接種混合促生菌液和單獨(dú)添加生物炭對(duì)礦砂養(yǎng)分和千葉蓍的生長(zhǎng)情況不存在明顯改善作用。