不同來(lái)源豆類(lèi)親脂蛋白提取與理化性質(zhì)研究

李 楊 方 琳 齊寶坤 謝鳳英 鐘明明 許順楠

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，哈爾濱 150030)

0 引言

近年來(lái)，隨著健康飲食等觀念逐漸受到重視[1]，采用植物蛋白代替動(dòng)物蛋白也逐漸成為研究的熱點(diǎn)內(nèi)容[2]。迄今為止，食品科學(xué)中關(guān)于復(fù)雜系統(tǒng)配方的研究大多關(guān)注少數(shù)被廣泛使用的蛋白質(zhì)來(lái)源，如大豆等的研究。因此拓寬蛋白來(lái)源，形成多元化局面，成為當(dāng)今蛋白應(yīng)用和發(fā)展過(guò)程中亟待解決的問(wèn)題之一[3]。

在加工大豆蛋白的過(guò)程中主要提取的組分是大豆分離蛋白(Soybean protein isolate,SPI)，長(zhǎng)期以來(lái)，研究者們普遍認(rèn)為SPI主要由大豆球蛋白(11S)和β-伴大豆球蛋白(7S)兩種組分構(gòu)成[4]。然而近幾年，通過(guò)精細(xì)化加工調(diào)節(jié)脫脂豆粕水溶液的pH值，逐步分離出3個(gè)組分：11S蛋白、大豆親脂蛋白(Soybean lipophilic protein,SLP)和7S蛋白。因此，SPI的功能特性也應(yīng)該基于這3種蛋白質(zhì)組分的性質(zhì)來(lái)重新考慮。

黑豆是大豆中的一個(gè)分支，在成分組成、性質(zhì)和結(jié)構(gòu)功能等方面都與大豆相類(lèi)似[5]。尤其在脂肪和蛋白質(zhì)含量及比例上較為相似。親脂蛋白在豆類(lèi)中的存在多與脂類(lèi)相關(guān)，所以適當(dāng)?shù)闹?lèi)含量有利于親脂蛋白組分的存在，因而將黑豆作為制備黑豆親脂蛋白(Black bean lipophilic protein,BLP)的新來(lái)源，相比于其他豆類(lèi)在提取工藝和應(yīng)用等方面更具有優(yōu)勢(shì)[6-7]。綠豆中蛋白質(zhì)含量高于小麥、玉米、水稻等常見(jiàn)的糧食作物[8-9]。另外，其氨基酸種類(lèi)相對(duì)齊全，不同種類(lèi)氨基酸的含量比例也更適于人體吸收和利用。但是目前對(duì)于綠豆的研究，主要集中在對(duì)淀粉的研究上，對(duì)于其中的蛋白組分并沒(méi)有重視[10-11]，類(lèi)比于大豆、黑豆親脂蛋白的提取，綠豆親脂蛋白(Mung bean lipophilic protein,MLP)的提取增加了親脂蛋白的來(lái)源，也為綠豆蛋白的工業(yè)加工提供了新的思路。豌豆在豆類(lèi)生產(chǎn)總量中的占比最大，為36%。但是由于豌豆蛋白的性質(zhì)相對(duì)較差，疏水性、溶解度、乳化性等性質(zhì)方面的不利因素導(dǎo)致了豌豆蛋白在實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中受到了阻礙[12]。針對(duì)以上問(wèn)題，豌豆親脂蛋白(Pea lipophilic protein,PLP)組分的含量與蛋白質(zhì)的亞基結(jié)合方式、疏水性基團(tuán)的含量和分布等關(guān)系有待被進(jìn)一步研究。

親脂蛋白作為分離蛋白中的貯藏蛋白之一，其功能性質(zhì)在分離蛋白功能性質(zhì)表現(xiàn)上起到了一定作用，如作為表面活性劑，親脂蛋白中的磷脂成分使蛋白與脂類(lèi)物質(zhì)相互結(jié)合變得更加容易，提高油水界面張力，起到穩(wěn)定界面的能力，促進(jìn)乳狀液的形成和穩(wěn)定。目前有關(guān)親脂蛋白的相關(guān)研究?jī)H停留在大豆親脂蛋白的提取和應(yīng)用，而在黑豆、綠豆和豌豆中的親脂蛋白尚未有相關(guān)研究，多數(shù)研究?jī)H包含3種豆類(lèi)中的分離蛋白相關(guān)理化性質(zhì)和改性處理對(duì)蛋白的影響，因此本文分別從大豆、黑豆、綠豆、豌豆4種豆類(lèi)中提取親脂蛋白，并利用電泳、熱性質(zhì)、表面性能和二級(jí)結(jié)構(gòu)等對(duì)提取出來(lái)的不同來(lái)源的親脂蛋白進(jìn)行表征，從而拓寬親脂蛋白來(lái)源，進(jìn)一步分析蛋白組分，使每一組分得到充分利用，也為黑豆、綠豆和豌豆在蛋白領(lǐng)域的加工和利用提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆,東農(nóng)42號(hào)，市售；黑豆,齊黑1號(hào)，市售；綠豆，綠豐5號(hào)，市售；豌豆,中豌2號(hào)，市售；正己烷,分析純，500 mL，天津市富宇精細(xì)化工有限公司；亞硫酸鈉,分析純，淄博永業(yè)精細(xì)化工股份有限公司；氯化鈉，分析純，500 g，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鈉，分析純，500 g，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；硫酸，98%，山東東佳集團(tuán)股份有限公司；氯仿，分析純，500 mL，廣東予能實(shí)驗(yàn)室設(shè)備科技有限公司；甲醇,分析純，500 mL，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉，分析純，天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠；聚丙烯酰胺凝膠電泳試劑盒,GB/T 23528,河南興鼎化工產(chǎn)品有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HH8型恒溫水浴鍋,常州市凱航儀器有限公司；制備型冷凍干燥機(jī),寧波新芝生物科技股份有限公司；離心管,濟(jì)南來(lái)寶醫(yī)療機(jī)械有限公司；傅里葉變換紅外光譜儀,賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司；rapid MAX N exceed型杜馬斯定氮儀,關(guān)河儀器設(shè)備(上海)有限公司；電泳儀,美國(guó)伯樂(lè)公司；F98型熒光分光光度計(jì),上海棱光技術(shù)有限公司；JC-1086A型多功能酶標(biāo)分析儀,浙江聚創(chuàng)智能科技有限公司；DTA型熱重?zé)岵罘治鰞x,北京賽思蒙儀器有限公司；湘儀式離心機(jī)，湘儀離心機(jī)儀器有限公司；SL200L型視頻光學(xué)接觸角測(cè)量?jī)x，美國(guó)科諾工業(yè)有限公司；UV-5100型高性能紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海奧析科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1大豆親脂蛋白提取

參考文獻(xiàn)[13]的方法并進(jìn)行改進(jìn)，提取大豆親脂蛋白。大豆磨粉，過(guò)120目篩，向過(guò)篩后的大豆粉以液料比4 mL/g加入正己烷，螺旋槳攪拌1 h后靜置，待大豆粉完全沉降，進(jìn)行固液分離并干燥，沉淀組分即為脫脂大豆粉。將脫脂大豆粉與水以液料比8 mL/g混合，調(diào)節(jié)pH值至8，用螺旋攪拌槳攪拌1 h，以4 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心15 min，取上清液加入10 mmol/L的亞硫酸鈉，并調(diào)節(jié)pH值至5.8，同等條件下離心15 min，取清液調(diào)節(jié)pH值至5.0，加入50 mmol氯化鈉，在55℃下保溫15 min，取出保溫后的溶液調(diào)節(jié)pH值至5.5，再離心15 min，取沉淀組分進(jìn)行凍干，即得到大豆親脂蛋白。

1.3.2黑豆親脂蛋白提取

參考文獻(xiàn)[14]的方法并進(jìn)行改進(jìn)，提取出黑豆分離蛋白，并進(jìn)一步處理得到黑豆親脂蛋白，具體操作如下：黑豆磨粉過(guò)120目篩，粉碎后的黑豆以液料比6 mL/g加入正己烷，磁力攪拌1.5 h后靜置，待黑豆粉完全沉降，沉淀組分加熱干燥后即可得到脫脂黑豆粉。將脫脂黑豆粉與水以液料比11.93 mL/g混合，調(diào)節(jié)pH值至8.5，攪拌1 h混合均勻，以7 500 r/min的轉(zhuǎn)速離心20 min，取上清液調(diào)節(jié)pH值至5.8，同等條件離心20 min取上清液調(diào)節(jié)pH值至4.9，在55℃下保溫20 min后調(diào)節(jié)pH值至5.6，離心20 min，取沉淀物進(jìn)行凍干，得到黑豆親脂蛋白。

1.3.3綠豆親脂蛋白提取

參考文獻(xiàn)[15]的方法并進(jìn)行改進(jìn)，提取出綠豆分離蛋白，并進(jìn)一步處理得到綠豆親脂蛋白，具體操作如下：將綠豆磨粉，過(guò)120目篩，按照液料比5 mL/g加入正己烷，攪拌均勻并靜置，進(jìn)行脫脂，得到脫脂綠豆粉后干燥。將脫脂綠豆粉與水以料液比15 mL/g加入，調(diào)節(jié)pH值至10.0，攪拌均勻在40℃下恒溫水浴30 min，后在7 500 r/min條件下離心20 min，保留上清液并調(diào)節(jié)pH值至5.8，離心取上清液調(diào)節(jié)pH值至5.0，在60 ℃下保溫20 min，取出后調(diào)節(jié)pH值為5.5，離心15 min，得沉淀組分進(jìn)行凍干，即得到綠豆親脂蛋白組分。

1.3.4豌豆親脂蛋白提取

參考文獻(xiàn)[16]的方法并進(jìn)行改進(jìn)，提取出豌豆分離蛋白，并進(jìn)一步處理得到豌豆親脂蛋白，具體操作如下：將豌豆置于磨粉機(jī)中粉碎，過(guò)120目篩，按照液料比4 mL/g加入正己烷，用磁力攪拌器攪拌均勻，靜置1 h，取沉淀脫脂豌豆粉干燥2 h。將豌豆粉溶于25倍的水中，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至9.0，在50℃下恒溫水浴1 h，在4 000 r/min下離心30 min，取上清液調(diào)節(jié)pH值至5.8，離心取上清液在50℃下保溫30 min，調(diào)節(jié)pH值至5.0，離心20 min，取沉淀組分進(jìn)行凍干，得到豌豆親脂蛋白組分。

1.3.5不同來(lái)源親脂蛋白中組分測(cè)定

杜馬斯定氮：實(shí)驗(yàn)參照NY/T 2007—2011《谷類(lèi)、豆類(lèi)粗蛋白質(zhì)含量的測(cè)定杜馬斯燃燒法》方法,使用杜馬斯分析儀定量測(cè)定提取物中蛋白質(zhì)含量。稱(chēng)取30～50 mg試樣置于專(zhuān)用錫箔中，壓緊成餅狀并置于自動(dòng)落樣盤(pán)上。樣品在氦氣和氧氣的條件下于左爐 950℃中充分燃燒，然后進(jìn)入右爐 840℃，氧化還原管中自動(dòng)凈化，設(shè)置柱溫50℃，載氣300 mL/min，分析時(shí)間10 min，進(jìn)樣延遲時(shí)間12 s，凈化后的產(chǎn)物進(jìn)入熱島池，測(cè)定結(jié)果于FLASH 4000 系統(tǒng)軟件中自動(dòng)計(jì)算并打印結(jié)果。

脂質(zhì)含量的測(cè)定：根據(jù)文獻(xiàn)[13]的方法測(cè)定SLP、BLP、MLP和PLP粉末的脂質(zhì)含量。將粉末加入10倍質(zhì)量的氯仿-甲醇(體積比2∶1)溶劑中，并在50℃下攪拌2 h。將提取的溶液轉(zhuǎn)移到離心管中，在1 470g下離心30 min。離心后，回收上層，剩余固體用氯仿-甲醇溶劑洗滌。所有提取的溶液被匯集、蒸發(fā)，并用氮?dú)夤袒缓鬁y(cè)量質(zhì)量。脂質(zhì)含量以質(zhì)量分?jǐn)?shù)表示。

1.3.6十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳

參考文獻(xiàn)[17]的方法并進(jìn)行改進(jìn)。分析前將SLP、BLP、MLP和PLP沉淀凍干。將樣品與含有0.5 mol/L Tris-HCl緩沖液、2%十二烷基硫酸鈉、20%甘油和0.001%溴酚藍(lán)(BPB)的電泳樣品緩沖液混合，pH值為6.8。向樣品緩沖液中添加5%的2-巰基乙醇(2-ME)。將樣品和緩沖液的混合物在沸水中加熱5 min，并在9 000g、4℃條件下離心5 min。將等分試樣裝入15%的凝膠梳孔中。電泳緩沖液配比為0.025 mol/L Tris HCl、0.192 mol甘氨酸和0.001 g/mL的SDS(十二烷基磺酸鈉)。電泳后得到的凝膠用考馬斯亮藍(lán)R-250染色30 min，脫色液脫色洗滌，靜置12 h。

1.3.7差示掃描量熱法

采用文獻(xiàn)[18]的方法并改進(jìn)，測(cè)定4種蛋白的熱變性溫度。稱(chēng)取5～8 mg的SLP、BLP、MLP和PLP粉末。使用DSC-60型差示掃描量熱儀，以1℃/min的掃描速率在20～120℃的范圍內(nèi)進(jìn)行差示掃描量熱(DSC)測(cè)量。水用作參考。使用TA-60WS型熱分析系統(tǒng)軟件測(cè)定變性峰溫度。

1.3.8傅里葉變換紅外光譜

參考文獻(xiàn)[17]的方法并進(jìn)行改進(jìn)。將SLP、BLP、MLP和PLP置于含P2O5的干燥器中保存14 d以上去除水分。將無(wú)水分的分離物放在ATR晶體上并向下壓以確保良好的接觸。用干燥空氣連續(xù)吹掃光譜儀。記錄在波段600～4 000 cm-1范圍內(nèi)的光譜(分辨率4 cm-1下的平均值)，并以空池為參照。使用peakfit軟件對(duì)光譜進(jìn)行傅里葉自解卷積(FSD)、二階導(dǎo)數(shù)(SD)分析和曲線擬合程序，以定位酰胺Ⅰ(1 600～1 700 cm-1)區(qū)域中的重疊峰。以蛋白不同二級(jí)結(jié)構(gòu)的相對(duì)含量為依據(jù)，通過(guò)計(jì)算給予酰胺Ⅰ區(qū)特定亞結(jié)構(gòu)的光譜成分(高斯峰)的面積確定。

參考文獻(xiàn)[19]的測(cè)定方法并進(jìn)行改進(jìn)，進(jìn)一步驗(yàn)證二級(jí)結(jié)構(gòu)的相似性。將SLP、BLP、MLP和PLP粉末分別放置在顯微鏡下,對(duì)準(zhǔn)焦距后,采集樣品的拉曼光譜。拉曼光譜儀參數(shù)為曝光時(shí)間10 s;激光功率35 mW;采集光譜范圍200～1 800 cm-1。利用商業(yè)化的高斯(Gaussian)程序包和ADF程序包,計(jì)算4種蛋白的拉曼光譜。計(jì)算方法主要用密度泛函理論(Density functional theory,DFT)。

1.3.10表面性能測(cè)定

參考文獻(xiàn)[20]的測(cè)定方法，對(duì)4種蛋白與水相關(guān)的表面學(xué)性能進(jìn)行測(cè)定。

溶解度：將4種蛋白分散在水中，形成質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的溶液，攪拌1 h，9 000 r/min離心15 min，采用BCA法測(cè)定蛋白含量。

表面疏水性：取上述離心后的上清液，用PBS稀釋至質(zhì)量濃度為0.005、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mg/mL，將所得梯度溶液與8 mmol/L ANS(以體積比100∶1)混合，靜置3 min后測(cè)定熒光強(qiáng)度，激發(fā)光波長(zhǎng)390 nm，發(fā)射光波長(zhǎng)497 nm，狹縫5 nm，以熒光強(qiáng)度對(duì)蛋白質(zhì)量濃度作圖，初始斜率為蛋白分子的表面疏水性指數(shù)。

表面張力：將上述蛋白溶于水，以500 r/min的轉(zhuǎn)速磁力攪拌得到4種蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的溶液，在視頻光學(xué)角儀器下測(cè)定表面張力。

乳化性：參考文獻(xiàn)[21]的方法，取15 mL 0.01 g/mL待測(cè)蛋白溶液(樣品蛋白溶于pH值為7.0的0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液中)，加入金龍魚(yú)大豆油5 mL，在室溫(20℃)下，用均質(zhì)機(jī)以10 000 r/min的速度攪拌1 min，迅速?gòu)牡撞咳?，?.001 g/mL的十二烷基磺酸鈉(SDS)溶液將其稀釋100倍，然后在波長(zhǎng)550 nm處測(cè)定其吸光度A550，記為A0。攪拌30 min后取樣用SDS稀釋?zhuān)貜?fù)上述操作，測(cè)定30 min時(shí)的吸光度A30，同時(shí)采用SDS溶液作為空白對(duì)照。

乳化活性指數(shù)(EAI)計(jì)算公式為

通過(guò)Langmuir方程計(jì)算出不同壓力下儲(chǔ)層飽和吸附氣體時(shí)的氣體含量，如圖1所示，飽和氣體吸附體積隨壓力增加而增加，當(dāng)壓力超過(guò)15 MPa后，氣體含量增加幅度逐漸減小。然后使用式(2)計(jì)算不同氣體含量(包括相對(duì)應(yīng)的壓力)時(shí)的平均密度和平均體積模量，計(jì)算結(jié)果如圖2所示，可以看出，平均密度和平均體積模量都隨著氣體含量增加而減小，其中平均密度減小幅度較小，而平均體積模量的減小量在初始吸附氣體時(shí)下降較快，之后下降量逐漸減緩。

(1)

式中EAI——乳化活性指數(shù)，m2/g

N——稀釋倍數(shù)

θ——油相體積分?jǐn)?shù)

C——蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，g/mL

L——比色皿中光路長(zhǎng)度，取1 cm

乳化穩(wěn)定性指數(shù)(ESI)計(jì)算公式為

(2)

式中ESI——乳化穩(wěn)定性指數(shù)，min

At——時(shí)間t時(shí)的吸光度

t——時(shí)間，取30 min

1.3.11數(shù)據(jù)處理與分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0分析軟件和Origin 8.0軟件進(jìn)行處理，采用方差與鄧肯分析對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析(P<0.05)。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，結(jié)果取平均值或平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果

2.1 組分測(cè)定

對(duì)4種來(lái)源親脂蛋白組分含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如表1所示。從測(cè)定結(jié)果來(lái)看，提取出來(lái)的親脂蛋白中脂類(lèi)含量與原料中的脂類(lèi)含量無(wú)關(guān)，按照1.3.1～1.3.4節(jié)中的方法進(jìn)行提取后，每種親脂蛋白中殘留的脂類(lèi)質(zhì)量分?jǐn)?shù)保持在13%～14%之間，且由品種帶來(lái)的差距較小。一般情況下，為除去豆類(lèi)中的脂類(lèi)多采用正己烷進(jìn)行處理，但是正己烷只能除去其中大部分的極性脂，而對(duì)于某些中性脂卻無(wú)法脫除，導(dǎo)致蛋白產(chǎn)品純度較低，且這部分殘留脂類(lèi)也會(huì)對(duì)親脂蛋白的性質(zhì)產(chǎn)生影響，如溶解性降低、疏水性升高等。因此，為提高親脂蛋白中蛋白組分的含量，本文進(jìn)一步采用氯仿-甲醇溶劑對(duì)親脂蛋白組分進(jìn)行脫脂處理，然后再進(jìn)行凍干操作以期提高產(chǎn)物中蛋白質(zhì)組分的含量。

表1 不同來(lái)源親脂蛋白組分中各組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)Tab.1 Determination of contents of lipophilic proteins from different sources %

2.2 十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳

根據(jù)文獻(xiàn)[13]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知親脂蛋白組分的相對(duì)分子質(zhì)量主要分布在75～100 kDa之間，圖1中從左到右分別為按照上述方法提取出來(lái)的SLP、BLP、MLP和PLP。從圖1中可以看出，SLP組分中主要成分分布在75～100 kDa附近，與文獻(xiàn)[10]實(shí)驗(yàn)結(jié)果的描述保持一致。從圖1中可見(jiàn)，BLP在75～100 kDa之間有一明顯條帶，與親脂蛋白中主要組分保持一致。與SLP的電泳條帶相比，BLP的電泳條帶在63 kDa附近的一條較大豆更為明顯，說(shuō)明在黑豆中這一分子量的蛋白含量比大豆中高。在MLP的電泳條帶中，75～100 kDa之間有一條條帶，但分子量略大于常見(jiàn)親脂蛋白組分，可能是由于MLP在亞基結(jié)構(gòu)中親水性基團(tuán)含量相對(duì)較高，使得整體蛋白組分分子量偏高，這與疏水性的結(jié)果保持一致。PLP的電泳條帶在典型親脂蛋白75～100 kDa之間有兩條條帶，造成這一結(jié)果可能的原因是組成親脂蛋白的亞基在提取出來(lái)后進(jìn)行凝膠電泳的過(guò)程中，兩個(gè)亞基的分離不平衡，本應(yīng)是兩個(gè)分子量相近的亞基由于其中某些基團(tuán)連接得相對(duì)緊密，無(wú)法通過(guò)電泳實(shí)驗(yàn)的操作進(jìn)行完全分離。因此，本應(yīng)平均分為兩個(gè)相同分子量的蛋白組分被分成了兩個(gè)處于75～100 kDa之間的蛋白條帶。此外，由于親脂蛋白中磷脂的存在導(dǎo)致在染色過(guò)程中其對(duì)考馬斯亮藍(lán)不敏感，因此凝膠電泳圖當(dāng)中條帶顏色的深淺與蛋白中磷脂含量的多少存在一定關(guān)聯(lián)。從圖1中可看出，大豆和綠豆親脂蛋白條帶顯色程度相近，而黑豆和豌豆的條帶顏色深淺接近，這與蛋白組分測(cè)定中脂類(lèi)含量測(cè)定的結(jié)果相一致，磷脂含量越高，被脫除后，蛋白所占比例越高，電泳條帶越明顯。

圖1 不同來(lái)源親脂蛋白SDS-PAGEFig.1 SDS-PAGE of lipophilic proteins from different sources

2.3 差示掃描量熱

根據(jù)差示掃描量熱圖可知，樣品溫度從20℃到120℃變化的過(guò)程中SLP與MLP的質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化規(guī)律相似，這一結(jié)果與兩種親脂蛋白疏水性相似的結(jié)果保持一致，證明SLP與MLP的疏水性基團(tuán)在含量和暴露程度上基本保持一致[22]。BLP在同等溫度變化條件下質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化率較小，主要原因可能是黑豆中β-折疊含量較高，功能性基團(tuán)暴露程度低，所以隨溫度提高的質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化較小。而PLP的測(cè)定結(jié)果與BLP恰恰相反。根據(jù)圖2可知，4種親脂蛋白的熱流量吸收峰值對(duì)應(yīng)的溫度為變性溫度，因此4種蛋白的變性溫度分別為60.23、61.21、65.00、73.86℃。從變性溫度來(lái)看，SLP和BLP相似性最高，其原因在于黑豆從生物學(xué)角度分析與大豆最為相近，因此，在進(jìn)行親脂蛋白提取時(shí)得到的產(chǎn)物從多數(shù)性質(zhì)和功能上看應(yīng)為最相似，但仍然存在差異[23]。MLP和PLP的變性溫度略高于SLP和BLP，主要與蛋白結(jié)構(gòu)中β-轉(zhuǎn)角含量有關(guān)。β-轉(zhuǎn)角含量越高，蛋白的變性溫度越高，且β-轉(zhuǎn)角含量的微量變化也會(huì)引起變性溫度的極大改變[24]。

圖2 不同來(lái)源親脂蛋白熱重?zé)岵罘治鰣DFig.2 TDA of lipophilic proteins from different sources

2.4 傅里葉變換紅外光譜

圖3 不同來(lái)源親脂蛋白紅外光譜圖Fig.3 Infrared spectrogram of lipophilic proteins from different sources

親脂蛋白中二級(jí)結(jié)構(gòu)主要包括α-螺旋、β-折疊和β-轉(zhuǎn)角3種，這3種結(jié)構(gòu)主要通過(guò)碳鏈骨架上的羰基和酰胺基團(tuán)之間形成的氫鍵維持，因此可通過(guò)這3種結(jié)構(gòu)的含量了解蛋白質(zhì)中氫鍵作用力和維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的能力[25]。蛋白質(zhì)在形成立體結(jié)構(gòu)時(shí)，肽鏈?zhǔn)紫刃纬搔?螺旋和β型結(jié)構(gòu)，而后隨著蛋白質(zhì)在修飾過(guò)程中受到的外界作用逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)?種主要二級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)象，即α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲[26]。從圖3和表2來(lái)看，SLP和BLP中無(wú)規(guī)則卷曲含量相對(duì)較少，而β-折疊含量較高，證明SLP和BLP中氫鍵含量較高，因此在穩(wěn)定性上優(yōu)于MLP和PLP。根據(jù)表2也可認(rèn)為在蛋白質(zhì)修飾加工過(guò)程中，MLP和PLP中部分β-折疊結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變成為無(wú)規(guī)則卷曲，因而在含量上有所降低，穩(wěn)定性也存在差異[27]。SLP、BLP與MLP、PLP相比α-螺旋含量高而β-轉(zhuǎn)角含量低，但兩種結(jié)構(gòu)之間保持總量的穩(wěn)定，而存在個(gè)體差異。

表2 不同來(lái)源親脂蛋白中各二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量Tab.2 Content of secondary structure in lipophilic proteins from different sources %

2.5 拉曼光譜

由拉曼光譜結(jié)果可知，從整體上看SLP和MLP在三級(jí)結(jié)構(gòu)組成上相似，BLP和PLP的三級(jí)結(jié)構(gòu)含量相似，而4種親脂蛋白所含有的基團(tuán)在種類(lèi)上保持一致，而在含量上存在差異。圖4中位移750～1 000 cm-1處出現(xiàn)第1個(gè)峰，在此范圍內(nèi)主要代表C—S鍵，證明在4種蛋白中均存在一定量的二硫鍵，且在BLP和PLP中二硫鍵的含量高于SLP和MLP。位移1 250～1 500 cm-1處出現(xiàn)第2和第3個(gè)較為明顯的峰，主要體現(xiàn)蛋白中存在的R基、甲基和含氮基團(tuán)，與BLP和PLP相比，SLP和MLP中第3個(gè)峰值較小，證明在SLP和MLP中含氮基團(tuán)含量較少，與電泳中條帶的分離、蛋白展現(xiàn)出更多氮端結(jié)構(gòu)等結(jié)果保持一致[28]。位移1 600 cm-1處存在第4個(gè)較為明顯的峰，此為N—N雙鍵的峰值范圍。從圖中可知BLP中N—N雙鍵的峰面積大于SLP、MLP和PLP，證明在BLP中含氮基團(tuán)含量高于其他3種親脂蛋白，且N—N雙鍵鍵能較高，因此黑豆親脂蛋白在結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性上優(yōu)于其他3種蛋白。位移2 000～2 250 cm-1和位移2 500～2 600 cm-1區(qū)域主要表示C—N三鍵和巰基。在這部分區(qū)域中BLP和PLP的峰面積明顯大于SLP和MLP，因此BLP和PLP的穩(wěn)定性較另外兩種親脂蛋白高[29]。從巰基對(duì)應(yīng)的拉曼區(qū)域峰面積來(lái)看，MLP和PLP的巰基含量較高，因此部分結(jié)構(gòu)以游離巰基形式存在，而未形成二硫鍵，與電泳測(cè)定中蛋白組分條帶發(fā)生分離的結(jié)果保持一致。

圖4 不同來(lái)源親脂蛋白拉曼光譜Fig.4 Raman spectra lipophilic proteins from different sources

2.6 表面性能測(cè)定

2.6.1溶解度

通過(guò)測(cè)定4種豆類(lèi)來(lái)源的親脂蛋白吸光度，并在同一濃度條件下進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，不同來(lái)源親脂蛋白吸光度相似。根據(jù)計(jì)算得到SLP、BLP、MLP和PLP的溶解度分別為2.313、2.092、1.492、1.545 mg/mL，由此可知SLP和BLP結(jié)果相近，而MLP和PLP在同一濃度條件下結(jié)果也相似[30]。因此可以說(shuō)明BLP和SLP在基團(tuán)組成及結(jié)構(gòu)分布上存在相似性，而MLP和PLP在這兩方面上也相似，這與紅外光譜測(cè)定的結(jié)果保持一致。

2.6.2表面疏水性

以每種豆類(lèi)在不同濃度條件下測(cè)定的熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)作圖，得到曲線的初始斜率為相應(yīng)親脂蛋白分子的表面疏水性指數(shù)。其中BLP和MLP疏水性相似，SLP疏水性最小，PLP疏水性最大。計(jì)算得到SLP、BLP、MLP和PLP的R2分別為0.999 2、0.997 4、0.999 3和0.992 4，證明每種蛋白組內(nèi)數(shù)據(jù)測(cè)定結(jié)果可靠。稀釋中水合作用對(duì)蛋白溶解度影響較小。而同一濃度、不同來(lái)源親脂蛋白在表面疏水性這一性質(zhì)上卻存在顯著性差異，這與不同來(lái)源豆類(lèi)中含硫氨基酸以及疏水性結(jié)構(gòu)的暴露程度之間存在關(guān)系[31-32]。由表3可知，BLP和 MLP疏水性相似，雖然與SLP疏水性存在一定差異，但是總體上差異不顯著。PLP疏水性指數(shù)最大，原因在于豌豆中疏水性基團(tuán)暴露相對(duì)明顯，親脂蛋白由兩個(gè)部分分子量有差異的疏水性亞基組成，使得豌豆親脂蛋白的疏水基團(tuán)暴露得更加充分，與電泳中兩條條帶的分離結(jié)果一致。

2.6.3表面張力與乳化性

通過(guò)測(cè)定質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的4種蛋白的表面張力和乳化性，發(fā)現(xiàn)大豆和黑豆中的親脂蛋白組分表面張力無(wú)顯著差異，而綠豆和豌豆蛋白溶液的表面張力與其他兩種豆類(lèi)之間存在顯著差異，這一結(jié)果與4種蛋白表面疏水性的測(cè)定結(jié)果保持一致，因此通過(guò)表面學(xué)性能測(cè)定的結(jié)果可以證明，親脂蛋白組分在低濃度條件下即存在較強(qiáng)的界面穩(wěn)定性[32]，可以作為一種優(yōu)良的食品級(jí)乳化劑應(yīng)用。

表3 不同來(lái)源親脂蛋白表面學(xué)性能測(cè)定結(jié)果Tab.3 Determination of surface properties of lipophilic proteins from different sources

3 結(jié)束語(yǔ)

依據(jù)4種來(lái)源豆類(lèi)，首先分離相應(yīng)豆類(lèi)的分離蛋白，再?gòu)南鄳?yīng)的分離蛋白中提取該種豆類(lèi)的親脂蛋白組分。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，SLP與BLP在多數(shù)指標(biāo)中性質(zhì)都保持相近，而MLP和PLP的性質(zhì)相似。但這兩組之間存在較為顯著的差異。提取出的SLP、BLP、MLP和PLP中的蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)均在80%以上，同時(shí)與大豆親脂蛋白中最為相似的是BLP，MLP和PLP也同樣存在13%左右的脂類(lèi)。4種蛋白組分在表面學(xué)性能、組分含量、二級(jí)結(jié)構(gòu)等方面性質(zhì)相似但含量不同。所提取的4種親脂蛋白組分，為4種豆類(lèi)的深加工提供了新的方向和思路。