腸道菌群失調(diào)與結(jié)直腸癌患者降鈣素及免疫球蛋白的關(guān)系

李光 朱漢東

胃腸道是人體內(nèi)重要微生態(tài)區(qū)，由胃腸道內(nèi)的微生態(tài)菌群、機(jī)體免疫調(diào)節(jié)及胃腸道組織共同組成［1］。正常情況下，菌群、宿主及結(jié)構(gòu)組織3 者之間維持動(dòng)態(tài)平衡，維持微生態(tài)平衡［2］；微生態(tài)平衡有助于維護(hù)腸道免疫屏障，抑制致病菌，降低胃腸道組織炎癥病變［3］。腸道菌群失調(diào)，有關(guān)代謝產(chǎn)物作用于易感性宿主，誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)，進(jìn)而易引起機(jī)體內(nèi)分泌功能紊亂，增加結(jié)直腸癌增殖、轉(zhuǎn)移、擴(kuò)散的風(fēng)險(xiǎn)，產(chǎn)生不良預(yù)后［4?5］。血清降鈣素原（procalcitonin，PCT）是炎癥反應(yīng)激活的重要指標(biāo)，在結(jié)直腸癌病理發(fā)展過程中表達(dá)會(huì)顯著升高。有報(bào)道指出，免疫球蛋白G（Immunoglobulin G，IgG）、免疫球蛋白A（Immunoglobulin A，IgA）、免疫球蛋白M（Immunoglobulin M，IgM）在機(jī)體抗腫瘤免疫應(yīng)答中，具有溶解、吞噬靶細(xì)胞的作用，是免疫系統(tǒng)的重要組成部分，其含量和功能變化與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)。本研究擬分析結(jié)直腸癌患者腸道微生態(tài)的變化，探討腸道菌群失調(diào)與血清降鈣素、免疫球蛋白水平的變化，為臨床結(jié)直腸癌治療及預(yù)后提供參考。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象及分組

選取2018年6月至2021年6月在武漢市第七醫(yī)院收治的186 例結(jié)直腸癌患者的臨床資料。研究組納入標(biāo)準(zhǔn)：①病理及超聲檢查確診為結(jié)直腸癌者；②半年內(nèi)患者未進(jìn)行抗腫瘤治療，且均未有腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者；③配合各項(xiàng)檢查，并且臨床資料完整者［3，6］。研究組排除標(biāo)準(zhǔn)：①除結(jié)直腸癌外，合并其他胃腸道疾病者；②合并肝、腎功能異?；蛐?、腦血管疾病者；③合并免疫系統(tǒng)疾病者；④近1 個(gè)月內(nèi)全身或局部使用過抗菌藥物者；⑤合并微生物感染者［3，6］。

根據(jù)根據(jù)臨床體征及腸道菌群檢查結(jié)果，將186例患者分為腸道菌群失調(diào)組（n=64）與正常組（n=122）。腸道菌群失調(diào)組患者男37例，女27例；平均年齡（63.35±7.26）歲；，平均病程（3.97±1.54）年。TNM分期Ⅰ～Ⅱ期38 人，Ⅲ～Ⅳ期26 人。正常組患者男70例，女52 例；平均年齡（62.68±8.21）歲；平均病程（4.17±1.62）年。TNM 分期Ⅰ～Ⅱ期74 人，Ⅲ～Ⅳ期48 人。腸道菌群失調(diào)組患者I 度菌群失調(diào)例35 例，Ⅱ度菌群失調(diào)例29 例。兩組患者男女比例、年齡、病程及TNM 分期等一般臨床資料比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。本研究遵循的程序符合2013年新修訂的《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》要求，并且與受試者及其家屬簽署臨床研究知情同意書。

1.2 腸道菌群檢測(cè)

采用滅菌玻璃棒取患者新鮮糞便1 g，溶于99 mL 滅菌生理鹽水中，充分混勻稀釋后，將適量稀釋液加入MRS 培養(yǎng)基（由江蘇康典公司提供）中，嚴(yán)格按照說明書操作，并于37℃條件下培養(yǎng)72 h，通過菌落可數(shù)性及形態(tài)對(duì)腸道雙歧桿菌、腸球菌、乳桿菌以及真桿菌的數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)。菌群失調(diào)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：①細(xì)菌數(shù)量顯著減少，每視野下300～500 個(gè)，革蘭陽(yáng)性桿菌比例為40%～50%，革蘭陰性桿菌比例為30%，革蘭陽(yáng)性球菌比例少于10%，判定為I 度菌群失調(diào)；②細(xì)菌數(shù)量顯著減少每視野下小于300 個(gè)，革蘭陽(yáng)性桿菌比例小于30%，革蘭陰性桿菌比例小于30%，革蘭陽(yáng)性球菌的比例大于10%，判定為Ⅱ度菌群失調(diào)［6］。

參照《腸道菌群失調(diào)診斷治療建議》［7］確定患者的腸道菌群失調(diào)確診標(biāo)準(zhǔn)：①臨床體征：出現(xiàn)明顯腹脹、腹痛、腹瀉甚至發(fā)熱，或造口排泄量大量增加，且大便顏色呈墨綠色，嚴(yán)重者可導(dǎo)致麻痹性腸梗阻、敗血癥或感染性休克等合并癥出現(xiàn)；合并低蛋白血癥時(shí)可產(chǎn)生大量腹腔積液。 ②實(shí)驗(yàn)室檢查：糞便常規(guī)檢查中發(fā)現(xiàn)白細(xì)胞明顯增多，糞便涂片檢查發(fā)現(xiàn)球菌桿菌的比例發(fā)生失調(diào)，對(duì)難辨梭狀芽孢桿菌毒素進(jìn)行檢測(cè)和細(xì)菌培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)果為陽(yáng)性。 ③影像學(xué)檢查：對(duì)患者進(jìn)行腹部腹盆腔CT或者X 線檢查發(fā)現(xiàn)腸道存在明顯的積氣和擴(kuò)張，腸道內(nèi)壁可見炎癥和水腫甚至可見腹腔積液。符合其中一條或多條則可認(rèn)為腸道菌群失調(diào)。

1.3 觀察指標(biāo)

①比較兩組患者腸道雙歧桿菌、腸球菌、乳桿菌以及真桿菌的數(shù)量。②采集靜脈血4 mL，3 000 r/min 離心5 min 后取血清，采用酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme linked immunaosorbont assay，ELISA）檢測(cè)血清PCT、免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白M（IgM）水平；同時(shí)采用比色法測(cè)定兩組患者總蛋白、清蛋白。操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行，試劑盒均購(gòu)于美國(guó)R&D 公司。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理；符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用（）表示，組間比較采用成組t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用n或%表示，行χ2檢驗(yàn)；所有統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)采用雙側(cè)檢驗(yàn)，以P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 失調(diào)組與正常組患者腸道菌群計(jì)數(shù)比較

腸道菌群失調(diào)組患者雙歧桿菌、乳桿菌、真桿菌數(shù)量顯著低于正常組數(shù)量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.743、5.254、5.054，P<0.05）；腸球菌數(shù)量明顯高于正常組腸球菌數(shù)量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.134，P<0.05）。見表1。

表1 失調(diào)組與正常組患者腸道菌群計(jì)數(shù)比較［cfu/g］（±s）Table 1 Comparison of intestinal microflora count between the disorder group and the normal group［CFU/g］（±s）

表1 失調(diào)組與正常組患者腸道菌群計(jì)數(shù)比較［cfu/g］（±s）Table 1 Comparison of intestinal microflora count between the disorder group and the normal group［CFU/g］（±s）

組別腸道菌群失調(diào)組正常組t 值P 值n 64 122雙歧桿菌6.41±1.05 8.43±0.96 4.743 0.000乳桿菌6.04±0.35 7.85±0.61 5.254 0.000腸球菌7.85±1.06 6.04±0.82 4.134 0.000真桿菌6.11±0.61 8.28±0.42 5.054 0.000

2.2 失調(diào)組與正常組患者血清PCT 及免疫球蛋白水平比較

腸道菌群失調(diào)患者血清PCT、免疫球蛋白IgG、IgA 及IgM 水平均顯著高于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.342、6.453、5.255、7.433，P<0.05）。見表2。

表2 失調(diào)組與正常組患者血清PCT 及免疫球蛋白水平比較（±s）Table 2 Comparison of serum PCT and immunoglobulin levels between the disorder group and the normal group（±s）

表2 失調(diào)組與正常組患者血清PCT 及免疫球蛋白水平比較（±s）Table 2 Comparison of serum PCT and immunoglobulin levels between the disorder group and the normal group（±s）

組別腸道菌群失調(diào)組正常組t 值P 值n 64 122 PCT（ng/mL）7.35±2.13 2.13±1.25 5.342 0.000 IgG（g/L）15.72±1.86 10.12±1.02 6.453 0.000 IgA（g/L）4.17±1.16 2.47±1.21 5.255 0.000 IgM（g/L）2.27±0.83 1.42±0.91 7.433 0.000

2.3 血清PCT、免疫球蛋白水平對(duì)患者發(fā)生腸道菌群的影響

將發(fā)生腸道菌群失調(diào)作為因變量，將結(jié)果2.2 中PCT、IgG、IgA 及IgM、年齡、性別腫瘤分期作為自變量，納入多因素logistic 回歸模型中采用全變量法進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，機(jī)體中免疫球蛋白血清PCT、IgG、IgA 和IgM 的含量是影響結(jié)直腸癌病人腸道菌群失調(diào)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（均P<0.05）。見表3。

表3 發(fā)生腸道菌群失調(diào)的多因素Logistic 回歸分析Table 3 Logistic regression analysis of the intestinal dysbacteriosis multiariable

2.4 腸道菌群失調(diào)與血清PCT、免疫球蛋白的Pearson 相關(guān)性分析

Pearson 相關(guān)分析顯示，腸道雙歧桿菌、乳桿菌及真桿菌數(shù)量與患者血清PCT、免疫球蛋白IgG、IgA 及IgM 與呈負(fù)相關(guān)，而腸球菌數(shù)量、菌群失調(diào)程度與患者血清PCT、免疫球蛋白IgG、IgA 及IgM 與呈正相關(guān)。見表4。

表4 腸道菌群失調(diào)與血清PCT、免疫球蛋白的Pearson相關(guān)性分析Table 4 Pearson correlation analysis of serum PCT immunoglobulin with intestinal flora disturbance

3 討論

胃十二指腸主要菌群為乳桿菌、大腸桿菌、類桿菌和梭狀芽孢桿菌等，當(dāng)結(jié)直腸發(fā)生癌變，組織蠕動(dòng)節(jié)律減慢造成內(nèi)容物排泄減慢，結(jié)直腸內(nèi)容物長(zhǎng)期堆積，細(xì)菌滋生，厭氧菌成為優(yōu)勢(shì)菌群，此時(shí)乳桿菌及類桿菌占據(jù)優(yōu)勢(shì)［4］，腸道菌群平衡被打破，結(jié)直腸癌變、炎癥損傷加劇，如此惡性循環(huán)加速疾病進(jìn)展［5］。本研究發(fā)現(xiàn)，患者腸道菌群失衡，雙歧桿菌、乳桿菌、真桿菌等厭氧菌大量滋生。腸道內(nèi)類桿菌及梭菌數(shù)量急劇增加，導(dǎo)致β?葡萄糖醛酸酶活性升高，加快腸內(nèi)容物氧化水解，進(jìn)而產(chǎn)生毒性作用，成為腸內(nèi)源性致癌物［7?8］。此外，還有部分菌群可產(chǎn)生β?葡萄糖苷酶、偶氮還原酶，促進(jìn)二甲基肼和亞硝酸鹽等致癌物質(zhì)生成，使得腸道腫瘤惡化轉(zhuǎn)移。腸道菌群失衡后，腸道局部黏膜組織免疫應(yīng)答及炎性反應(yīng)均被激活，厭氧菌代謝產(chǎn)生活性氧或有害物質(zhì)如丙二醛等，會(huì)引起DNA 氧化損害和DNA 突變［9?10］。

結(jié)直腸癌患者菌群失調(diào)表示細(xì)菌感染導(dǎo)致腸道微生態(tài)紊亂；與此同時(shí)患者血清PCT、免疫球蛋白IgG、IgA 及IgM 均顯著高于正常組，機(jī)體PCT、免疫球蛋白代償性升高，表明免疫功能異常，提示菌群紊亂。本研究多因素回歸分析還發(fā)現(xiàn)血清PCT、IgG、IgM 和IgA 含量是影響結(jié)直腸癌病人發(fā)生腸道菌群失調(diào)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，這與張帆等人的報(bào)道一致［5］。IgG 可以通過與特定的抗原結(jié)合，并通過固定補(bǔ)體和結(jié)合巨噬細(xì)胞充分溶解細(xì)菌產(chǎn)生的有害物質(zhì)、促進(jìn)機(jī)體吞噬作用，也可以促進(jìn)其他細(xì)胞對(duì)細(xì)菌的殺傷作用；IgM 則可激活補(bǔ)體，通過補(bǔ)體介導(dǎo)促進(jìn)吞噬作用，加強(qiáng)對(duì)細(xì)菌的吞噬功能；IgA 是機(jī)體黏膜防護(hù)的重要因素之一，腸道厭氧均損傷腸道粘膜組織，而IgA 代償性升高則可減輕粘膜損傷［11?15］。

機(jī)體遭受細(xì)菌等病原菌侵害時(shí)細(xì)胞免疫及體液免疫隨之啟動(dòng)。腸道菌群失調(diào)下，腸道雙歧桿菌、乳桿菌及真桿菌數(shù)量與患者血清PCT、免疫球蛋白IgG、IgA 及IgM 與呈負(fù)相關(guān)，而腸球菌數(shù)量、菌群失調(diào)程度與患者血清PCT、免疫球蛋白IgG、IgA 及IgM 與呈正相關(guān)。這提示機(jī)體炎癥反應(yīng)激活、免疫球蛋白代償性升高可能與腸道菌群失調(diào)有關(guān)，腫瘤微環(huán)境惡化，厭氧菌侵襲腸道粘膜組織是是患者發(fā)生菌群失調(diào)的原因之一。

綜上所述，結(jié)直腸癌患者發(fā)生腸道菌群失調(diào)與患者血清PCT、免疫球蛋白相關(guān)，隨著血清PCT、IgG、IgA及IgM水平的增加，可能菌群失調(diào)程度更嚴(yán)重。