低鹽和高鹽條件下L-組氨酸對肌原纖維蛋白 結(jié)構(gòu)及體外消化特性的影響

郭秀云，徐雙意，曹思瑜，張雅瑋,*

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095；2.揚(yáng)州大學(xué)旅游烹飪學(xué)院·食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009）

食鹽作為最普通的咸味劑，對肉制品風(fēng)味、質(zhì)構(gòu)、貨架期及加工過程起著至關(guān)重要的作用。在肉制品的加工過程中，通常需要添加較高含量（3%～4%）的食鹽以獲得良好的產(chǎn)品品質(zhì)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，人們從肉制品中攝入的食鹽約占食鹽總攝入量的25%。我國是傳統(tǒng)高鹽飲食國家，過多攝入食鹽容易引發(fā)高血壓等心血管疾病，降低食鹽用量已引起足夠重視。目前，針對降低肉中食鹽用量國內(nèi)外已進(jìn)行了廣泛研究，主要通過直接降低氯化鈉（sodium chloride，NaCl）用量、利用鉀鹽、鎂鹽及鈣鹽進(jìn)行部分替代、改變加工工藝等途徑來減少食鹽的 攝入。然而降低肉中食鹽用量，或采用鉀鹽、鎂鹽或鈣鹽替代部分食鹽將影響肉品的加工特性，主要表現(xiàn)在鹽滲透速率減慢、彈性及硬度下降等。

近年來，氨基酸在肉制品中的應(yīng)用越來越受到國內(nèi)外學(xué)者們的關(guān)注，已有諸多文獻(xiàn)報(bào)道，-組氨酸（-histidine，His）作為風(fēng)味增強(qiáng)劑，在協(xié)同增強(qiáng)咸味感知的同時(shí)能夠顯著改善肌肉蛋白理化特性、凝膠特性及乳化特性，從而提高肉制品保水、質(zhì)構(gòu)、色澤等品質(zhì)特性。Zhang Yawei等研究發(fā)現(xiàn)，His對咸味具有協(xié)同增強(qiáng)的作用。Guo Xiuyun等研究發(fā)現(xiàn)，低鹽濃度溶液中，His的添加能夠引起肌球蛋白分子發(fā)生解折疊，二級結(jié)構(gòu)中的-螺旋結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變成-折疊、-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)，暴露更多的疏水基團(tuán)和巰基基團(tuán)至肌球蛋白表面，從而提高了蛋白溶解度。Hayakawa等研究發(fā)現(xiàn)，His能夠拉長肌球蛋白桿狀區(qū)域，從而使得肌球蛋白纖絲弱化，進(jìn)而增加肌球蛋白在低離子強(qiáng)度條件下的溶解度。Zhang Yawei等進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，His能夠改變肌球蛋白熱誘導(dǎo)凝膠特性，減少凝膠網(wǎng)絡(luò)中水的移動性和自由水含量，提高凝膠硬度、保水性，降低蒸煮損失。此外，Guo Xiuyun等研究表明，低鹽條件下His能夠通過改變界面肌原纖維蛋白（myofibrillar protein，MP）結(jié)構(gòu)及吸附特性進(jìn)而提高乳液的穩(wěn)定性。

隨著生活水平的日益提高，人們越來越注重產(chǎn)品的營養(yǎng)價(jià)值。肉制品作為人類膳食優(yōu)質(zhì)蛋白的主要來源，對人體具有重要的生物學(xué)意義。因而如何維持或提高肉制品的營養(yǎng)特性是研究熱點(diǎn)。蛋白質(zhì)消化率是反映食物中的蛋白質(zhì)在消化道內(nèi)被消化酶分解程度的一項(xiàng)指標(biāo)，是評價(jià)食物蛋白質(zhì)營養(yǎng)價(jià)值的重要指標(biāo)之一。而蛋白質(zhì)的消化率和營養(yǎng)價(jià)值與肉類加工及貯藏過程中發(fā)生的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變密切相關(guān)。前期研究表明，His能夠改變肌球蛋白結(jié)構(gòu)，進(jìn)而改善低鹽條件下蛋白的功能特性，而蛋白的結(jié)構(gòu)改變可能會引起其消化特性的變化，最終影響肉制品營養(yǎng)價(jià)值。但關(guān)于低鹽（0.2 mol/L）條件下His的添加對MP消化特性的影響規(guī)律及作用機(jī)制尚不清楚。

因此，本研究以高鹽（0.6 mol/L NaCl）條件作為對照，通過研究低鹽（0.2 mol/L NaCl）及高鹽條件下添加His對豬肉MP結(jié)構(gòu)及體外消化特性的影響，為研究低鹽條件下His對MP營養(yǎng)價(jià)值的影響提供依據(jù)，為低鹽肉制品的開發(fā)和應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬背最長肌購于菜大全江蘇省南京市玄武區(qū)孝陵衛(wèi)市場店。

His、胃蛋白酶、胰蛋白酶 北京索萊寶科技有限公司；NaCl、KCl、Tris、NaHPO、NaHPO、MgCl、HCl、乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）、乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸（ethylenebis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid，EGTA）均為市售分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Allegra 64R高速離心機(jī) 美國貝克曼庫爾特有限公司； T25 digital高速勻漿機(jī) 德國IKA公司；Varioskan Flash酶標(biāo)儀（多功能讀數(shù)儀） 賽默飛世爾科技有限公司；Labram HR 800顯微激光拉曼光譜儀 法國Jobin-Yvon公司；MASTERSIZER 3000激光粒度分析儀 英國馬爾文儀器有限公司；GelDoc XR＋凝膠電泳成像儀 美國Bio-Rad公司；HJ-4多頭磁力加熱攪拌器 上海越眾儀器設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 MP的提取

參考Han Minyi等的方法并稍作修改。將約300 g切碎的豬背最長肌解凍，加入4 倍體積的僵直提取緩沖液（含100 mmol/L Tris、10 mmol/L EDTA，pH 8.3），高速組織搗碎機(jī)攪碎約30 s，1 000×（＜4 ℃）離心20 min，收集沉淀。沉淀加入4 倍體積的提取緩沖液（含100 mmol/L KCl、20 mmol/L NaHPO/NaHPO、2 mmol/L MgCl、1 mmol/L EGTA，pH 7.0）溶解，高速分散10 s，1 000×、4 ℃離心10 min，收集沉淀，并重復(fù)2 次此步驟，后2 次離心前用2 層紗布過濾。沉淀加入4 倍體積的提取緩沖液（含體積分?jǐn)?shù)1% Triton X-100，pH 7.0）溶解，高速分散10 s，1 500×、4 ℃離心10 min，收集沉淀，重復(fù)1 次。沉淀加入4 倍體積0.1 mol/L KCl溶液溶解，高速分散10 s，1 500×、4 ℃離心10 min，收集沉淀，重復(fù)此步驟。沉淀加入4 倍體積蒸餾水溶解，高速分散10 s，1 500×、4 ℃離心10 min，收集沉淀得到純化的豬肉無鹽MP于塑料燒杯中，24 h內(nèi)使用。以上操作均需在冷庫（＜4 ℃）中進(jìn)行。提取的豬肉MP用雙縮脲法測定質(zhì)量濃度。

1.3.2 蛋白樣品制備

將5 g MP分別溶于50 mL不同處理溶液中，分別為0.2 mol/L NaCl、0.2 mol/L NaCl＋0.2 g/100 mL His、0.2 mol/L NaCl＋0.4 g/100 mL His、0.6 mol/L NaCl、0.6 mol/L NaCl＋0.2 g/100 mL His、0.6 mol/L NaCl＋0.4 g/100 mL His，制得6 組不同MP樣品，并將pH值調(diào)至6.5。

1.3.3 MP二級結(jié)構(gòu)的測定

采用拉曼光譜儀測定MP二級結(jié)構(gòu)。拉曼光譜所用功率為100 mW。使用前，需要通過單晶硅進(jìn)行光譜頻率校正，為使激光聚焦在載玻片上，可用50 倍長焦距鏡頭調(diào)節(jié)，以便于測試樣品。需要設(shè)置光譜參數(shù)為：開孔200 μm，光柵600 g/mm，光譜分辨率2 cm，獲取的光譜范圍400～3 600 cm，光譜數(shù)據(jù)獲取速率120 cm·min， 設(shè)定積分時(shí)間為60 s。-螺旋、-折疊、-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲的相對含量用Alix等的方法計(jì)算。

1.3.4 MP表面疏水性的測定

通過8-苯胺基-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS）熒光探針法測定MP的表面疏水性。將1 mg/mL MP樣品用0.01 mol/L磷酸緩沖液（pH 7.0）溶解，攪拌均勻，用上述緩沖液將溶液稀釋至質(zhì)量濃度0.01～0.10 g/100 mL，保持在20 ℃，靜置穩(wěn)定12 h。用移液槍分別吸取樣品2 mL，加入20 μL 8 mmol/L ANS，通過微型旋渦混合儀使其混合均勻，靜置5 min。設(shè)定參數(shù)：激發(fā)波長374 nm，狹縫校正5 nm，發(fā)射波長485 nm，狹縫校正5 nm。用熒光強(qiáng)度對蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度作曲線的斜率表示蛋白質(zhì)表面疏水性。

1.3.5 體外消化率的測定

參考Wen Siying等方法并作修改。建立體外胃-腸道消化模型，分別稱取5 mL 30 mg/mL MP溶液，加入37 mL 10 mmol/L HCl溶液，用均質(zhì)機(jī)在7 500 r/min條件下均質(zhì)30 s，隨后加入8 mL 1 mg/mL胃蛋白酶（溶于10 mmol/L HCl）。所得混合物終濃度為：蛋白質(zhì)量濃度4 mg/mL、胃蛋白酶含量4%（/，以蛋白質(zhì)量為基準(zhǔn)），pH 2.0?；旌暇鶆蚝笾糜?7 ℃水浴中酶解1 h。用1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH值為7.5以滅活胃蛋白酶，結(jié)束反應(yīng)。隨后加入相應(yīng)劑量的胰蛋白酶（4%，/，以蛋白質(zhì)量為基準(zhǔn)，pH 7.5）于37 ℃水浴中保溫消化2 h。反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)物于沸水中加熱滅酶10 min，冷卻至室溫，離心（11 000×、15 min、4 ℃），收集上清液即為體外胃腸道消化產(chǎn)物。上清液蛋白質(zhì)含量通過凱氏定氮法測定，體外消化率計(jì)算公式如下。

1.3.6 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）

參照Laemmli的方法進(jìn)行。反應(yīng)結(jié)束后，經(jīng)過胃蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶水解的每管反應(yīng)液內(nèi)分別加入4×樣品緩沖液，95 ℃下加熱10 min，室溫冷卻。取10 μL上樣，使用4%濃縮膠、12%分離膠，用考馬斯亮藍(lán)R-250染色。

1.3.7 消化產(chǎn)物粒徑的測定

參照Gatellier等方法并稍作修改。取勻漿后、胃蛋白酶酶解、胃蛋白酶和胰蛋白酶酶解后的溶液，使用激光粒度儀測定物質(zhì)粒度大小。獲取的數(shù)據(jù)如下：、、分別表示樣品的累計(jì)粒度分布數(shù)達(dá)到10%、50%、90%時(shí)所對應(yīng)的粒徑；表示體積平均徑，表示表面積平均徑。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS軟件進(jìn)行雙因素方差分析。采用鄧肯多重比較法（Duncan’s multiple range test）進(jìn)行差異顯著性分析（＜0.05）。采用Origin 8軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 MP二級結(jié)構(gòu)分析

由圖1可知，在低鹽或高鹽濃度條件下，His處理均使MP的-螺旋結(jié)構(gòu)減少，并轉(zhuǎn)變成其他二級結(jié)構(gòu)。在低鹽濃度條件下，0.2 g/100 mL His和0.4 g/100 mL His處理使得MP的-螺旋結(jié)構(gòu)相對含量由61.09%分別降至59.87%和57.33%（＜0.05）；在高鹽濃度條件下，0.2 g/100 mL His和0.4 g/100 mL His處理使得-螺旋結(jié)構(gòu)相對含量由68.45%分別降至56.58%和47.16% （＜0.05）。這與Guo Xiuyun等研究結(jié)果相一致，該研究認(rèn)為His可通過靜電相互作用與肌球蛋白中酸性氨基酸殘基結(jié)合，從而破壞肌球蛋白分子內(nèi)及分子間的離子鍵，導(dǎo)致肌球蛋白發(fā)生解折疊。同時(shí)，隨著His添加量的增加，MP的-螺旋結(jié)構(gòu)相對含量明顯降低，MP解折疊程度與His添加量之間呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性關(guān)系。

圖1 不同鹽濃度條件下His對MP二級結(jié)構(gòu)的影響Fig. 1 Effect of His on secondary structure of MP at different salt concentrations

2.2 MP表面疏水性分析

蛋白質(zhì)表面疏水性的變化情況可以用來衡量蛋白質(zhì)分子空間結(jié)構(gòu)的變化。由表1可知，MP表面疏水性隨著鹽濃度的提高而提高，這與Supanwa等的研究結(jié)果相一致。隨著鹽濃度的升高，MP開始解聚集，呈單體狀態(tài)，疏水基團(tuán)逐漸暴露。在低鹽濃度下，0.2 g/100 mL His和0.4 g/100 mL His處理使得表面疏水性分別升高21.75%和28.91%（＜0.05）；高鹽濃度下，0.2 g/100 mL His和0.4 g/100 mL His處理使得表面疏水性分別升高5.54%和10.50%（＜0.05）。說明在不同鹽濃度條件下，His處理都能明顯提高M(jìn)P的表面疏水性。His處理破壞了MP的分子結(jié)構(gòu)，使得芳香氨基酸基團(tuán)暴露至肌球蛋白表面。同時(shí)，相同鹽濃度條件下，0.4 g/100 mL His的作用顯著高于0.2 g/100 mL His （＜0.05），這與MP二級結(jié)構(gòu)變化相一致。在pH 6.5條件下，His帶有正電荷，而MP帶有負(fù)電荷。His可通過靜電作用與MP中酸性氨基酸殘基相結(jié)合，破壞維持MP二級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的分子間及分子內(nèi)離子鍵，從而導(dǎo)致MP解折疊并暴露MP分子內(nèi)以及由于蛋白聚集而埋藏的疏水基團(tuán)。王耀松等也曾研究發(fā)現(xiàn)，His在一定程度上能促進(jìn)乳清蛋白分子間解聚集、單個(gè)蛋白分子結(jié)構(gòu)展開，從而使更多的疏水性基團(tuán)外露。

表1 不同鹽濃度條件下His對MP表面疏水性的影響Table 1 Effect of His on surface hydrophobicity of MP at different salt concentrations

2.3 MP體外消化率分析

由表2可知，在胃蛋白酶消化階段，MP得到初步消化，消化率在50%左右（46.81%～51.66%）。這與馬紀(jì)兵等研究傳統(tǒng)風(fēng)干牦牛肉加工中MP氧化與體外蛋白酶消化階段消化率的變化結(jié)果一致。相比于胃蛋白酶消化階段，胰蛋白酶消化后中各樣品的消化率顯著上升 （＜0.05），說明在胰蛋白酶的作用下，MP進(jìn)一步被水解消化。這是因?yàn)樵诘鞍踪|(zhì)的胃消化階段，胃蛋白酶主要作用的部位是蛋白質(zhì)中酸性氨基酸或芳香族氨基酸所組成的肽鍵。于娜的研究表明，胃蛋白酶傾向于剪切氨基端或羧基端為芳香族氨基酸（如苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸）或亮氨酸的肽鍵，而如果某一肽鍵氨基端第3個(gè)氨基酸為堿性氨基酸（如賴氨酸、精氨酸和組氨酸）或者該肽鍵的氨基端為精氨酸時(shí)，則不能有效對此肽鍵進(jìn)行剪切。胰蛋白酶能選擇性水解蛋白質(zhì)中由賴氨酸或精氨酸的羧基所構(gòu)成的肽鏈，并能在胃蛋白酶初步消化的基礎(chǔ)上繼續(xù)消化變性的蛋白質(zhì)，因而胰蛋白酶消化后消化率顯著高于胃蛋白酶消化階段的消化率。

表2 不同鹽濃度條件下His對MP體外消化率的影響Table 2 Effect of His on in vitro digestibility of MP at different salt concentrations

此外，不論在胃蛋白酶消化階段還是胰蛋白酶消化階段，MP體外消化率隨著鹽濃度的提高而提高。且添加His處理后的MP消化率均顯著高于對照組 （＜0.05），而0.2 g/100 mL His處理組MP消化率顯著高于0.4 g/100 mL His處理組（＜0.05）。蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化會影響蛋白質(zhì)被蛋白酶水解的速率。MP結(jié)構(gòu)信息研究結(jié)果表明，0.2 g/100 mL His處理可引起MP結(jié)構(gòu)的輕度變化，使其發(fā)生部分解折疊，暴露出更多的酶切位點(diǎn)，使得胃蛋白酶、胰蛋白酶更容易與MP結(jié)合，利于酶消化，從而提高M(jìn)P體外消化率。而0.4 g/100 mL His處理組的MP解折疊程度顯著高于0.4 g/100 mL His處理組，這可能導(dǎo)致MP與胃蛋白酶、胰蛋白酶結(jié)合的位點(diǎn)被修飾，從而降低胃蛋白酶、胰蛋白酶對其水解的 敏感性，因而0.4 g/100 mL His處理組的MP體外消化率低于0.2 g/100 mL His處理組?？偠灾?，在低鹽或高鹽濃度條件下，添加His均能提高M(jìn)P的消化率，從而使更多的可溶性蛋白在胃腸道中得以釋放，進(jìn)而更有利于人體的吸收。

2.4 SDS-PAGE分析

由圖2A可知，MP經(jīng)胃蛋白酶消化后，大分子蛋白被水解，MP中的主要蛋白質(zhì)肌球蛋白重鏈和肌動蛋白均部分水解成不同多肽片段，且胃蛋白酶對肌球蛋白重鏈的水解作用強(qiáng)于對肌動蛋白的水解作用。高鹽濃度（0.6 mol/L NaCl）處理后的條帶灰度明顯低于低鹽濃度（0.2 mol/L NaCl）處理，這是由于高鹽濃度條件下蛋白溶解度高，蛋白更加分散，更易于胃蛋白酶消化。此外，His處理組的條帶灰度均明顯低于未添加His的處理組，說明His促進(jìn)了胃蛋白酶對MP的水解。由圖2B可知，MP經(jīng)胰蛋白酶進(jìn)一步水解后，大分子的蛋白或多肽均被完全水解，形成小分子的多肽或氨基酸?？傊?jīng)過胃蛋白酶、胰蛋白酶2 步消化后，不同處理組電泳條帶灰度與消化前相比發(fā)生明顯變化，顯著變淺甚至消失，蛋白發(fā)生大幅降解，這與Paolella等研究的模擬體外胃腸道消化后火腿MP的電泳結(jié)果一致。而低鹽或高鹽條件下添加His均能顯著促進(jìn)胃蛋白酶/胰蛋白酶對MP的水解，與體外消化率結(jié)果相一致。

圖2 體外消化產(chǎn)物的SDS-PAGE圖譜Fig. 2 SDS-PAGE patterns of in vitro digested MP

2.5 消化產(chǎn)物粒徑分析

由表3可知，經(jīng)胃蛋白酶消化后，高鹽濃度處理組的MP消化產(chǎn)物粒徑均顯著低于低鹽處理組，且添加His處理的MP經(jīng)消化后其粒徑指標(biāo)、、、和均顯著降低（＜0.05）。再經(jīng)過胰蛋白酶消化后，MP消化產(chǎn)物的各項(xiàng)粒徑指標(biāo)與胃蛋白酶消化后相比進(jìn)一步減小，這與詹光等的研究結(jié)果相一致。且胰蛋白酶消化結(jié)果與經(jīng)過胃蛋白酶消化后的變化趨勢一致，高鹽濃度處理組MP消化產(chǎn)物粒徑均顯著低于低鹽處理組，且添加His處理的MP經(jīng)消化后其粒徑指標(biāo)、、、和均顯著降低 （＜0.05）。如SDS-PAGE圖譜所示，經(jīng)胃蛋白酶和胰蛋白酶水解后，MP發(fā)生降解，大分子質(zhì)量蛋白被水解成小分子質(zhì)量的多肽或氨基酸，進(jìn)而使得消化產(chǎn)物粒徑下降。而His的添加能夠進(jìn)一步促進(jìn)MP水解，從而降低消化產(chǎn)物粒徑。Promeyrat等研究表明，蛋白質(zhì)疏水性與粒徑相關(guān)。經(jīng)His處理的MP表面疏水性增大，疏水基團(tuán)暴露增加，進(jìn)而提供了更多酶切位點(diǎn)，使得MP中的疏水性氨基酸基團(tuán)組成的肽鍵能被胃蛋白酶和胰蛋白酶更加高效地水解，MP降解程度更高，從而導(dǎo)致胃蛋白酶和胰蛋白酶消化后的MP粒徑小于未添加His處理組。

表3 不同鹽濃度條件下His對MP體外消化產(chǎn)物粒徑的影響Table 3 Effect of His on particle size of in vitro digested MP at different salt concentrations

3 結(jié) 論

本研究分析低鹽及高鹽條件下0、0.2、0.4 g/100 mL的His添加量對豬肉MP結(jié)構(gòu)及體外消化特性的影響。結(jié)果表明，在低鹽和高鹽條件下，His的添加均引起MP發(fā)生解折疊，從而暴露出更多酶切位點(diǎn)，促進(jìn)胃蛋白酶和胰蛋白酶對MP的酶解作用，降低酶解粒徑并提高M(jìn)P體外消化率。本研究結(jié)果為低鹽肉制品的開發(fā)和應(yīng)用提供了參考。