不同類型電場輔助冰溫貯藏對生鮮豬肉 保水性的影響

謝菲菲，張德權(quán)，徐毓謙，李 欣，方 菲，劉珊珊，邱旭東，李海濱，侯成立,*

（1.寧夏大學(xué)食品與葡萄酒學(xué)院，寧夏 銀川 750021；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所， 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全收貯運(yùn)管控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；3.滄州市農(nóng)林科學(xué)院，河北 滄州 061001； 4.北京順鑫農(nóng)業(yè)股份有限公司鵬程食品分公司，北京 101316）

我國是肉類生產(chǎn)與消費(fèi)大國，肉類總產(chǎn)量和總消費(fèi)量位居世界第一。豬肉肉質(zhì)鮮嫩，蛋白質(zhì)和脂肪含量豐富，深受消費(fèi)者喜愛。冰溫保鮮是指將肉品貯藏于0 ℃以下、冰點(diǎn)以上溫度范圍內(nèi)的貯藏技術(shù)，在保持細(xì)胞的完整性、抑制酶活性及微生物生長方面效果顯著，可有效保持肉品品質(zhì)、延長貨架期。但冰溫貯藏條件較難控制，溫度范圍較窄，限制了其大規(guī)模產(chǎn)業(yè)應(yīng)用。研究發(fā)現(xiàn)，電場可調(diào)節(jié)生鮮肉冰點(diǎn)，電場輔助冰溫貯藏保鮮技術(shù)受到廣泛關(guān)注。

目前，研究較多的電場類型為交變電場和靜電場，其中交變電場以日本DENBA鮮度保持電場裝置為代表，其電場強(qiáng)度隨時(shí)間不斷變化；而靜電場通過直流電源輸出穩(wěn)定電壓，電場強(qiáng)度不隨時(shí)間發(fā)生變化。岑劍偉等研究發(fā)現(xiàn)，高壓靜電場輔助冰溫結(jié)合氣調(diào)包裝貯藏可有效抑制羅非魚片的微生物生長，使汁液損失率及揮發(fā)性鹽基氮含量保持在較低水平，貨架期也得到有效延長。段偉文等研究發(fā)現(xiàn)，靜電場結(jié)合冰溫和氣調(diào)包裝貯藏對凡納濱對蝦的保鮮效果較好，可有效抑制貯藏期間微生物的生長繁殖及汁液流失，貨架期可達(dá)14 d。胡斐斐等研究表明，低壓交變電場輔助冷藏可有效抑制牛肉貯藏期間菌落總數(shù)和揮發(fā)性鹽基氮含量的增加，降低貯藏?fù)p失和蒸煮損失，貨架期可達(dá)9 d。綜上，已有研究表明交變電場和靜電場輔助對生鮮肉持水力有較好的保持效果，但目前關(guān)于二者的影響差異尚不明確。

因此，本研究以豬背最長肌為實(shí)驗(yàn)材料，探究不同類型電場輔助冰溫（-1.0±0.5） ℃貯藏對豬肉保水性的影響，以期為電場輔助冰溫貯藏的應(yīng)用提供理論依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

6 月齡、胴體質(zhì)量約為75 kg的4 頭杜長大公豬背最長肌購于北京順鑫農(nóng)業(yè)股份有限公司鵬程食品分公司。

BCA蛋白定量試劑盒 美國Thermo Scientific 公司；鹽酸、無水乙醇、乙酸、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑（北京）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

K型熱電偶、LK-1048U多路溫度巡檢儀 常州市藍(lán)光電子有限公司；JYH-66恒溫恒濕培養(yǎng)箱、JYH-103恒溫恒濕培養(yǎng)箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；HH-4S數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；ML204電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限 公司；DENBA-2.0鮮度保持電場裝置（由電場發(fā)生裝置（220 V、50 Hz）和放電板（140 mm×120 mm）組成，輸出電壓3 300～4 000 V、電流0.04 A） 日本Agua商事株式會社；TCM6000i高壓直流電源（輸入：220 V、50 Hz；輸出：3 800 V、1 mA） 大連泰思曼高壓電源有限公司；DHG-9140AS電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 寧波江南儀器廠；NMI20-040H-I核磁共振成像分析儀 蘇州紐邁分析儀器股份有限公司；SpectraMax 190全波長酶標(biāo)儀 美國Molecular Devices公司；Neofuge15R臺式高速冷凍離心機(jī) 上海力申科學(xué)儀器有限公司；Mini-PROTEAN Tetra System電泳設(shè)備、ChemiDocMP成像系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

杜長大公豬屠宰放血后，半胴體于-28 ℃冷風(fēng)隧道中快速冷卻1.5 h，隨后轉(zhuǎn)入0～4 ℃冷卻間冷卻12 h。冷卻結(jié)束后取一側(cè)背最長肌，去除可見脂肪和筋膜組織，裝入無菌袋后置于布滿冰袋的保溫箱（0～4 ℃）中，2 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。將每條豬背最長肌分成13 塊，每塊約70 g（5 cm×5 cm×3 cm），分為3 個(gè)處理組進(jìn)行貯藏：交變電場輔助冰溫（-1.0±0.5） ℃、靜電場輔助冰溫、普通冰溫（對照組）。分別在貯藏0、2、4、6、8 d取樣，立即進(jìn)行水分含量、貯藏?fù)p失、蒸煮損失、橫向弛豫時(shí)間的測定，并將剩余樣品置于液氮中凍存，用于蛋白質(zhì)表面疏水性及蛋白質(zhì)組成的測定。

電場裝置由電場發(fā)生裝置和放電板組成，放電板在冰溫（-1.0±0.5） ℃箱內(nèi)產(chǎn)生交變電場和靜電場，放電板水平放置，肉樣與放電板間隔20 cm平行放置。

1.3.2 指標(biāo)測定

1.3.2.1 冰點(diǎn)測定

參照荊紅彭的方法稍作修改，將生鮮豬肉切成規(guī)格約為2 cm×2 cm×1 cm肉塊，將熱電偶探頭插入肉塊中心深度約0.5 cm，用塑料托盤盛裝后放入-5 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中降溫，開啟多路溫度巡檢儀測定并記錄其溫度變化，讀數(shù)精度為0.1 ℃，每1 s記錄1 次數(shù)據(jù)。

1.3.2.2 水分含量測定

參照GB 18394—2020《畜禽肉水分限量》中的直接干燥法測定水分含量。

1.3.2.3 貯藏?fù)p失測定

稱量肉樣貯藏前后質(zhì)量，為貯藏前肉樣的質(zhì) 量（g），為貯藏后肉樣的質(zhì)量（g），貯藏?fù)p失按 式（1）計(jì)算。

1.3.2.4 蒸煮損失測定

參考Yan Tongjing等的方法對樣品規(guī)格稍作修改，稱取約25 g肉塊，質(zhì)量記為（g），放入蒸煮袋內(nèi)并密封袋口，71 ℃水浴35 min后流水冷卻30 min，取出肉樣后濾紙擦干表面水分并稱質(zhì)量，記為（g），蒸煮損失按式（2）計(jì)算。

1.3.2.5 橫向弛豫時(shí)間測定

參照王旭等的方法對肉樣規(guī)格稍作修改，將肉樣切成約2 cm×2 cm×1 cm的立方體，置于測樣管中，測定氫質(zhì)子低場核磁共振波譜。實(shí)驗(yàn)參數(shù)如下：磁場強(qiáng)度0.5 T，質(zhì)子共振頻率23 MHz，90°脈沖時(shí)間9 μs，180°脈沖時(shí)間18 μs，采樣點(diǎn)數(shù)59 990，重復(fù)時(shí)間3 000 ms，回波數(shù)2 000。將信號值進(jìn)行反演得到反演譜。

1.3.2.6 肌原纖維蛋白表面疏水性測定

1 g肉樣切碎后加入6 mL預(yù)冷的緩沖液（含0.1 mol/L Tris、0.01 mol/L二硫蘇糖醇），冰浴勻漿（15 000 r/min，15 s/次，3 次，間隔15 s）后，4 ℃、10 000×離心30 min，沉淀溶于8 mL 5 g/100 mL SDS溶液，勻漿30 s后置于80 ℃水浴加熱20 min即為肌原纖維蛋白溶液，超純水稀釋20 倍后，用BCA法測定蛋白質(zhì)量濃度，并將肌原纖維蛋白質(zhì)量溶度調(diào)至2 mg/mL，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

參考盧驍?shù)鹊姆椒?，? mL 2 mg/mL的肌原纖維蛋白溶液中加入40 μL 1 mg/mL的溴酚藍(lán)溶液，室溫下靜置15 min后離心（3 000×、15 min、4 ℃），取上清液在595 nm波長處測定吸光度。對照組為1 mL 20 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.5），肌原纖維蛋白表面疏水性以溴酚藍(lán)結(jié)合量表示，按式（3）計(jì)算。

1.3.2.7 蛋白組成測定

參考Xia Xiufang等的方法，進(jìn)行SDS-PAGE測定。采用10%分離膠和5%濃縮膠，上樣量3 μg。先在恒壓90 V電泳30 min后恒壓130 V繼續(xù)電泳，直到樣品移至分離膠底部。取出膠片后考馬斯亮藍(lán)染色12 h，脫色5 h至條帶清晰可見，拍照觀察。

1.4 數(shù)據(jù)處理

通過Excel和Origin 2018軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及作圖，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，選用Duncan’s法進(jìn)行多重比較分析， 以＜0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 生鮮豬肉冰點(diǎn)的測定

由圖1可知，在整個(gè)降溫過程中，豬肉的中心溫度在降溫初期快速下降，當(dāng)豬肉中心溫度下降到-1.7～ -1.8 ℃時(shí)溫度變化較為平緩，此后溫度繼續(xù)下降，由此確定-1.7～-1.8 ℃為豬肉的冰點(diǎn)溫度。冰溫貯藏是將肉品置于0 ℃以下、冰點(diǎn)以上的溫度范圍內(nèi)貯藏，因此選 擇-1 ℃作為豬肉冰溫貯藏的溫度。

圖1 豬肉降溫曲線Fig. 1 Cooling curve of fresh pork

2.2 不同類型電場輔助冰溫貯藏對生鮮豬肉水分含量的影響

由圖2可知，貯藏初期，生鮮豬肉的水分含量為73%，交變電場和靜電場處理組貯藏8 d分別為69%和70%，對照組降至65%。隨著貯藏時(shí)間的延長，3 個(gè)處理組水分含量呈下降趨勢。水分含量受很多因素影響，包括肌肉組織的不同處理方式和生化變化等都會引起肌肉水分的流失。貯藏4～8 d，對照組水分含量顯著低于交變電場和靜電場處理組（＜0.05），但交變電場和靜電場處理組之間無顯著差異，上述結(jié)果表明電場輔助冰溫貯藏可在一定程度上減少豬肉水分含量的損失。

圖2 不同類型電場輔助冰溫貯藏對生鮮豬肉水分含量的影響Fig. 2 Effect of different types of electric field combined with controlled freezing-point storage on water content of fresh pork

2.3 不同類型電場輔助冰溫貯藏對生鮮豬肉貯藏?fù)p失和蒸煮損失的影響

由圖3可知，隨貯藏時(shí)間的延長，3 個(gè)處理組貯藏?fù)p失呈增加趨勢，與胡斐斐等對凍藏豬肉的研究結(jié)果一致。貯藏2、6、8 d，對照組貯藏?fù)p失顯著高于交變電場和靜電場處理組（＜0.05），但交變電場和靜電場處理組之間無顯著差異。冰溫貯藏過程中，在內(nèi)源性蛋白酶系統(tǒng)的作用下，肌原纖維蛋白發(fā)生降解，導(dǎo)致肌原纖維蛋白的結(jié)構(gòu)被破壞，減弱了肌原纖維蛋白對水的束縛能力，促使水分從肌纖維內(nèi)部向外部遷移，導(dǎo)致汁液損失。

圖3 不同類型電場輔助冰溫貯藏對生鮮豬肉貯藏?fù)p失的影響Fig. 3 Effect of different types electric fields combined with controlled freezing-point storage on storage loss of fresh pork

由圖4可知，隨著貯藏時(shí)間的延長，3 個(gè)處理組蒸煮損失呈現(xiàn)先減小后增大趨勢，在蒸煮過程中，肌原纖維蛋白熱變性程度決定了肌肉的保水能力，肌纖維隨蒸煮溫度的上升完全變性，產(chǎn)生較大的壓力和張力，使得肌肉中水分不斷溢出，增大蒸煮損失。貯藏0～4 d，蒸煮損失降低可能是因?yàn)槿鈽勇懵吨糜诒鶞叵渲?，肉表面發(fā)生了風(fēng)干現(xiàn)象，蒸煮時(shí)肉塊表面水分損失較少，因此蒸煮損失降低。貯藏后期，隨貯藏時(shí)間的延長，肌原纖維蛋白束縛水能力下降，蒸煮損失增大。在整個(gè)貯藏期間，對照組蒸煮損失高于交變電場和靜電場處理組，但交變電場和靜電場處理組之間無顯著差異。

圖4 不同類型電場輔助冰溫貯藏對生鮮豬肉蒸煮損失的影響Fig. 4 Effect of different types electric field combined with controlled freezing-point storage on cooking loss of fresh pork

上述研究結(jié)果表明，電場輔助冰溫貯藏可在一定程度上減少生鮮豬肉貯藏過程中的汁液流失?？赡苁且?yàn)榧∪庵兴肿拥臍滏I結(jié)構(gòu)在外加電場的影響下不斷重復(fù)地形成與斷裂，使得水分子結(jié)構(gòu)及其與肌肉蛋白的結(jié)合狀態(tài)發(fā)生改變，降低了肌肉中水分流動性；此外，隨著電場中帶電粒子的活動，水分子與帶電粒子產(chǎn)生共振作用，使得水分子與酶的結(jié)合狀態(tài)發(fā)生改變，間接影響酶分子中心構(gòu)象的變化，最終導(dǎo)致酶鈍化和失活，從而達(dá)到穩(wěn)定肉品持水力的目的。

2.4 不同類型電場輔助冰溫貯藏對生鮮豬肉橫向弛豫 時(shí)間T2的影響

由圖5可知，3 個(gè)峰分別代表結(jié)合水（）、不易流動水（）和自由水（），峰面積比例表示3 種形式水的相對含量。由表1可知，隨著貯藏時(shí)間的延長，交變電場、靜電場處理組及對照組不易流動水弛豫峰面積比例呈降低趨勢，自由水弛豫峰面積比例呈增長趨勢?？赡苁且?yàn)樵谫A藏過程中，一系列反應(yīng)導(dǎo)致肌纖維結(jié)構(gòu)被破壞，使得不易流動水不斷遷移，自由水相對含量增加，從而導(dǎo)致汁液損失率上升；貯藏4～8 d，交變電場和靜電場處理組顯著高于對照組（＜0.05），肌肉對不易流動水的保持能力決定肉的持水力，相較于對照組，電場處理組不易流動水含量更高，說明電場處理組肉樣的持水能力更強(qiáng)；貯藏4 d和8 d，交變電場和靜電場處理組顯著低于對照組（＜0.05），靜電場處理組顯著高于交變電場處理組（＜0.05），自由水存在于肌細(xì)胞外和肌束外間隙，這部分水自由度大、與底物結(jié)合能力弱，流動性較強(qiáng)，易受貯藏溫度、時(shí)間和外力等因素的影響，自由水相對含量越高，肉的保水性越差。

圖5 不同類型電場輔助冰溫貯藏對生鮮豬肉橫向弛豫時(shí)間T2的影響Fig. 5 Effect of different types electric field combined with controlled freezing-point storage on T2 of fresh pork

表1 不同類型電場輔助冰溫貯藏對生鮮豬肉弛豫峰面積比例P2的影響Table 1 Effect of different types electric field combined with controlled freezing-point storagee on P2 of fresh pork%

2.5 不同類型電場輔助冰溫貯藏對生鮮豬肉肌原纖維 蛋白表面疏水性的影響

由圖6可知，隨著貯藏時(shí)間的延長，交變電場、靜電場處理組及對照組肌原纖維蛋白表面疏水性均呈上升趨勢，這與盧驍?shù)葘εＨ獾难芯拷Y(jié)果基本一致。貯藏初期，豬肉肌原纖維蛋白與溴酚藍(lán)結(jié)合量為8.7 μg，交變電場和靜電場處理組貯藏8 d后分別為15.8 μg和16.2 μg，對照組達(dá)到了18.8 μg。貯藏4～8 d，交變電場和靜電場處理組肌原纖維蛋白與溴酚藍(lán)結(jié)合量顯著低于對照組 （＜0.05），但2 個(gè)處理組之間無顯著差異，說明對照組蛋白質(zhì)變性程度高于交變電場和靜電場處理組。分析原因可能是肌原纖維蛋白在貯藏過程中由于多種因素的影響導(dǎo)致其分子鏈展開，使得內(nèi)部的非極性氨基酸殘基暴露，進(jìn)而導(dǎo)致肌原纖維蛋白表面疏水性上升。肌原纖維蛋白的水合能力隨肌原纖維蛋白表面疏水性的上升而減弱，部分不易流動水轉(zhuǎn)化為自由水，從而造成肉品保水能力降低。這也進(jìn)一步驗(yàn)證了弛豫峰面積比例的變化。

圖6 不同類型電場輔助冰溫貯藏對生鮮豬肉肌原纖維 蛋白表面疏水性的影響Fig. 6 Effect of different types electric field combined with controlled freezing-point storage on surface hydrophobicity of myofibrillar protein in fresh pork

2.6 不同類型電場輔助冰溫貯藏生鮮豬肉肌原纖維蛋白SDS-PAGE圖譜的變化

由圖7可知，對比0 d，隨著貯藏時(shí)間的延長，引起肌球蛋白重鏈（180 kDa）的變化，說明在貯藏過程中，細(xì)胞內(nèi)源酶系統(tǒng)會降解肌原纖維蛋白，使蛋白小分子化，產(chǎn)生更多的蛋白片段和小分子片段。有研究表明，肌球蛋白穩(wěn)定性較差，在貯藏過程中易發(fā)生降解。 與對照組相比，電場處理組在貯藏后期蛋白聚集減少，這可能是由于電場可以減少肌球蛋白重鏈的降解，維持肌球蛋白的穩(wěn)定性。-輔肌動蛋白（100 kDa）在貯藏后期出現(xiàn)，這可能是由于貯藏后期μ-鈣蛋白酶參與了肌原纖維蛋白的降解，斷裂產(chǎn)生新的小分子片段。對比冰溫處理組，電場處理組的-輔肌動蛋白條帶色澤較淺，這可能是由于外加電場影響μ-鈣蛋白酶活性，加強(qiáng)肌原纖維蛋白中各個(gè)小分子蛋白的交聯(lián)能力。肌鈣蛋白Ⅰ（20 kDa）在貯藏2 d后逐漸分解出新的肽段，在貯藏8 d時(shí)更加明顯，說明肌鈣蛋白Ⅰ在宰后貯藏期間發(fā)生降解，相較于電場處理組，對照組的條帶更加明顯，分析原因可能是電場輔助冰溫貯藏維持了肌鈣蛋白的穩(wěn)定，減緩了肌原纖維蛋白在貯藏過程中的降解。

圖7 不同類型電場輔助冰溫貯藏對生鮮豬肉肌原纖維蛋白 SDS-PAGE圖譜的影響Fig. 7 Effect of different types electric field combined with controlled freezing-point storage on SDS-PAGE profile of myofibrillar protein in fresh pork

在本研究中，交變電場和靜電場處理組不易流動水含量高于對照組，電場處理組豬肉的貯藏?fù)p失和蒸煮損失低于對照組，3 個(gè)處理組豬肉肌原纖維蛋白在貯藏期內(nèi)出現(xiàn)了不同程度降解，對照組肌原纖維蛋白的變性程度較高，說明電場輔助對豬肉的保水性有一定的維持作用。隨貯藏時(shí)間的延長，蛋白質(zhì)變性程度提升了肌原纖維蛋白網(wǎng)絡(luò)中不易流動水的自由度，不易流動水轉(zhuǎn)化為自由水，導(dǎo)致對照組較差的保水性。電場輔助冰溫貯藏維持了豬肉肌原纖維蛋白的穩(wěn)定，延緩其降解，使得電場處理組豬肉保水性較好。

2.7 不同類型電場輔助冰溫貯藏生鮮豬肉保水性指標(biāo) 聚類分析

為進(jìn)一步分析不同類型電場輔助冰溫貯藏對生鮮豬肉保水性的影響，對交變電場輔助冰溫、靜電場輔助冰溫、普通冰溫3 個(gè)處理組生鮮豬肉貯藏期間保水性相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行聚類分析。由圖8可知，依據(jù)保水性變化，貯藏2 d的3 個(gè)處理組可聚為一類，表明貯藏前期3 個(gè)處理組之間無明顯不同。貯藏4～8 d，交變電場和靜電場處理組可聚為一類，對照組聚為一類，表明在貯藏后期3 個(gè)處理組隨貯藏時(shí)間的延長保水性變化不大。整體來看，聚類分析將貯藏2～8 d的交變電場和靜電場處理組與貯藏4～8 d的對照組進(jìn)行了區(qū)分，說明交變電場和靜電場2 個(gè)處理組保水性無明顯不同，但均與對照組存在顯著差異。從縱向聚類結(jié)果可以看出，水分含量與不易流動水峰面積比例的變化趨勢相似，聚為一類，說明不易流動水含量變化與水分含量變化高度相關(guān)。

圖8 不同類型電場輔助冰溫貯藏生鮮豬肉保水性指標(biāo)聚類分析Fig. 8 Cluster analysis of water retention properties of fresh pork stored under controlled freezing point condition with different types of electric field

3 結(jié) 論

交變電場和靜電場輔助冰溫可減少生鮮豬肉貯藏過程中的汁液損失。隨著貯藏時(shí)間的延長，生鮮豬肉蒸煮損失、貯藏?fù)p失、肌原纖維蛋白表面疏水性及降解程度均呈上升趨勢，不易流動水逐漸轉(zhuǎn)化為自由水，水分流動性增加。相比對照組，交變電場和靜電場輔助冰溫貯藏可延緩肌原纖維蛋白降解及不易流動水向自由水轉(zhuǎn)化，從而提高生鮮豬肉的保水性，降低豬肉的汁液損失，但輸出電壓為3 300～4 000 V所產(chǎn)生的交變電場和輸出電壓為3 800 V所產(chǎn)生的靜電場對豬肉保水性的影響效果區(qū)別不大。