氯化鈣與高靜壓處理減鈉鹽雞肉凝膠對 小鼠生長及消化特性的影響

熊嘉皓，余 霞，鄒莉芳，陳從貴,2,*

（1.合肥工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，安徽 合肥 230601；2.農(nóng)產(chǎn)品生物化工教育部工程研究中心，安徽 合肥 230601）

肉制品中添加的食鹽（NaCl）在人們?nèi)粘Ｊ雏}攝入中占有較大的比重，而過量的鈉鹽攝入會增加患心腦血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)。但是，單純降低肉制品中的食鹽含量會損害肉制品的風(fēng)味、質(zhì)構(gòu)等品質(zhì)。肉制品的科學(xué)減鈉已成為肉類科技領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。

鈣鹽常用于改善肉的嫩度，也是低鈉鹽肉制品開發(fā)研究中常用的一種替代鹽，并可作為肉制品的營養(yǎng)強(qiáng)化劑使用，顯示出重要的生理功能，廣泛應(yīng)用于各類食品的開發(fā)。高靜壓加工（high pressure processing，HPP） 在食品行業(yè)中除了具有非熱殺菌功能之外，也是一種有效實(shí)現(xiàn)凝膠類肉制品低鹽化的前處理加工方式，可以防止低鹽化給肉制品帶來的凝膠質(zhì)構(gòu)、保水等一系列品質(zhì)劣變。

目前，低鈉鹽肉制品的研究主要集中于產(chǎn)品減鈉鹽后的品質(zhì)劣變補(bǔ)償問題，以期改善減鈉鹽肉制品食用前的品質(zhì)特性。而對于肉制品減鈉鹽后的消化、吸收、代謝等特性變化研究卻鮮有文獻(xiàn)報(bào)道。蛋白質(zhì)的消化率越高，越容易被人體吸收，意味著蛋白質(zhì)的生物利用率也越高。有研究表明，鈣鹽和HPP都會影響肉蛋白的溶解性與聚集行為，從而影響低鈉鹽凝膠肉制品的 品質(zhì)；同時(shí)，這也可能導(dǎo)致肉制品表現(xiàn)出不同的蛋白質(zhì)消化特性，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)的吸收、代謝等。前期的研究結(jié)果顯示，適當(dāng)添加量的氯化鈣（0.2%）與合適的HPP條件（200 MPa、10 min、25 ℃）會協(xié)同改善蛋白質(zhì)的溶解與凝膠特性，而這種減鈉鹽蛋白質(zhì)凝膠特性的改善是否會影響蛋白質(zhì)的體內(nèi)消化吸收及其生理功能值得探究。

本研究選擇小鼠作為實(shí)驗(yàn)動物，以經(jīng)過氯化鈣與HPP復(fù)合加工的減鈉鹽雞肉凝膠喂食小鼠，探究減鈉鹽雞肉凝膠蛋白質(zhì)在小鼠體內(nèi)的消化情況及其對小鼠生長性能的影響，為綜合提升減鈉鹽肉制品的質(zhì)量提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞胸肉（參照GB 5009.5—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測定》的凱氏定氮法、GB 5009.6—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脂肪的測定》的索氏抽提法和GB 5009.3—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測定》的直接干燥法，分別測得蛋白質(zhì)、粗脂肪和水分含量為（23.24±0.83）%、（2.11±0.47）%和（74.43±1.23）%） 濱州高盛食品有限公司。

氯化鈣、三聚磷酸鈉（食品級） 浙江一諾生物科技有限公司；氯化鈉、無水乙醇、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、磷酸鹽緩沖液（0.01 mol/L NaHPO·2HO-NaHPO·12HO，pH 7.0）（均為分析純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑（上海）有限公司；酪蛋白磷酸肽標(biāo)準(zhǔn)物（純度80%） 上海阿拉丁生物技術(shù)有限公司；BCA試劑盒 碧云天生物技術(shù)有限公司。

實(shí)驗(yàn)動物：4 周齡雄性C57BL/6小鼠 北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司。

實(shí)驗(yàn)小鼠飼料配方用料：玉米淀粉、麥芽糊精、蔗糖、大豆油、纖維素（均為食品級）；-胱氨酸、氯化膽堿、叔丁基對苯二酚、AIN-93G混合維生素（VA、VB、VB、VD、VE、VK、生物素、葉酸、煙酸、泛酸鈣、核黃素、硫胺素）、AIN-93G混合礦物質(zhì)（碳酸鈣、硫酸鉀、氧化鎂、氯化鈉、碳酸銅、碘酸鉀、碳酸錳、硒酸鈉、碳酸鋅、氯化鋰、硼酸、氟化鈉、碳酸鎳、釩酸銨、磷酸二氫鉀、一水合檸檬酸鉀、檸檬酸鐵、十二水合硫酸鉻鉀、四水合鉬酸銨、九水合硅酸鈉）（均為分析純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑（上海）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

600 MPa/0.6 L超高壓處理裝置 內(nèi)蒙古包頭科發(fā)高壓科技有限責(zé)任公司；CT14RD高速冷凍離心機(jī) 上海天美科技有限公司；SCX-8/2A絞肉機(jī) 上海雙碟廚具有限公司；AU680全自動生化分析儀 美國Beckman Coulter公司；FD-1A-50冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；DYY-6D電泳儀 北京六一生物科技有限公司； Tanon-1600凝膠成像系統(tǒng) 上海天能科技有限公司； MS-2000激光粒度儀 英國馬爾文公司；Varioskan Flash全波長酶標(biāo)儀 美國熱電公司。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)小鼠飼料配制與樣品采集

4 種雞肉凝膠粉的制備：將冷凍雞胸肉放在4 ℃環(huán)境下解凍12 h，剔去可見脂肪和筋膜，用絞肉機(jī)攪碎后稱取一定量的雞胸肉糜，按照表1的配料比例進(jìn)行配料后混合、斬拌；斬拌后的混合物真空包裝，冰浴保存1 h以內(nèi)，在25 ℃環(huán)境下200 MPa處理10 min后，放入水溫為80 ℃的水浴鍋中煮制30 min；取出并自來水冷卻后，-18 ℃冷凍，再冷凍干燥至恒質(zhì)量，粉碎后即為雞肉凝膠粉。

表1 雞肉凝膠粉配方及用量Table 1 Composition of chicken gel powders g

小鼠飼料的制備：參照美國營養(yǎng)學(xué)會AIN-93G《鼠類實(shí)驗(yàn)動物生長飼料配方標(biāo)準(zhǔn)》配制小鼠飼料，采用4 種不同的雞肉凝膠粉替代飼料配方中的酪蛋白，將其他配料加入到相應(yīng)的雞肉凝膠粉中，混勻，擠壓呈球形（直徑約2 cm），經(jīng)冷凍干燥、真空包裝、輻照殺菌后，即得到小鼠的4 種飼料，配方如下：相應(yīng)組的雞肉凝膠粉200 g、玉米淀粉397 g、麥芽糊精132 g、蔗糖100 g、大豆油70 g、纖維素50 g、-胱氨酸3 g、氯化膽堿2.5 g、AIN-93G混合礦物質(zhì)35 g、AIN-93G混合維生素10 g和叔丁基對苯二酚0.014 g。其中，4 種雞肉凝膠粉分別為：氯化鈣添加量0%＋0.1 MPa（未經(jīng)HPP）標(biāo)記為C組；氯化鈣添加量0.2%＋0.1 MPa標(biāo)記為CA組；氯化鈣添加量0%＋200 MPa（25 ℃、10 min）標(biāo)記為H組，氯化鈣添加量0.2%＋200 MPa（25 ℃、10 min） 標(biāo)記為CH組。

小鼠飼養(yǎng)：小鼠實(shí)驗(yàn)經(jīng)合肥工業(yè)大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)倫理審查委員會批準(zhǔn)（編號：HFUT2021-1008-001），飼養(yǎng)環(huán)境為SPF級動物房。小鼠置于潔凈飼養(yǎng)籠內(nèi)自由飲食、飲水，按照12 h/12 h的明暗循環(huán)；每周更換2 次墊料，溫度控制在（25.0±0.5） ℃，相對濕度控制在（50±5）%；用普通小鼠飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)2 周，將48 只實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分成4 組（12 只/組），分別使用上述4 種飼料喂養(yǎng)4 周后眼球取血、處死小鼠，取臟器和各部位脂肪，用于分析檢測。

1.3.2 體質(zhì)量和臟器質(zhì)量的測定

體質(zhì)量測定：實(shí)驗(yàn)期間，每隔7 d稱量并記錄小鼠體質(zhì)量。

脂肪組織質(zhì)量測定：小鼠取血、處死后，采集小鼠皮下脂肪組織、附睪脂肪組織，精確稱量各脂肪組織的質(zhì)量。

1.3.3 血清生化指標(biāo)的測定

取小鼠眼球血，置于1 mL滅菌離心管，4 ℃靜置12 h后，5 000×、4 ℃高速離心15 min，取離心后的上清液得到血清。將血清在全自動生化分析儀上樣測定。血清生化指標(biāo)包括總蛋白、尿素氮、甘油三酯（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、 高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）和低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）含量。

1.3.4 胃和小腸食糜醇沉蛋白組分的測定

參照Wang Yu、Wen Siying等方法，采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE）測定。精確稱量胃食糜/小腸食糜0.2 g，加入3 倍體積的無水乙醇，渦旋振蕩搖勻，10 000×、4 ℃高速離心20 min，倒去上清；向離心沉淀物中加入8 倍體積的全蛋白提取液（含4 g/100 mL SDS、0.01 mol/L磷酸鈉鹽緩沖溶液，pH 7.0），在均質(zhì)機(jī)中高速勻漿2 次（13 500 r/min，每次30 s），勻漿后的混合物離心15 min（1 500×、4 ℃）；用BCA試劑盒測定離心后上清液的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，調(diào)整蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度到1 mg/mL，與上樣緩沖液按體積比4∶1混勻，在95 ℃水浴中加熱5 min。采用4%～15%的Bis-Tris標(biāo)準(zhǔn)預(yù)制膠，Marker上樣量5 μL，其他各泳道上樣量10 μL。在80 V條件下電泳10 min，隨后在120 V條件下電泳至樣品條帶消失。使用Tanon凝膠成像儀掃描凝膠并獲得圖像。

1.3.5 胃和小腸食糜粒徑大小及分布的測定

食糜粒徑的測定參照Sun Weizheng等的方法，精確稱量胃食糜/小腸食糜0.2 g，加入4 mL生理鹽水，渦旋振蕩搖勻。采用馬爾文激光粒度儀測定混合溶液的粒徑。設(shè)定粒徑類型為非球形，密度為0.95 g/cm，分散劑為水，相對折射率和相對吸收率分別設(shè)定為1.54和0.001。以反映平均粒徑；、和分別表示樣品累計(jì)粒度分布比例達(dá)到10%、50%和90%所對應(yīng)的粒徑大小。

1.3.6 小腸食糜小肽含量的測定

參照王興等方法，精確稱量小腸食糜0.2 g，加入1 mL磷酸鈉鹽緩沖溶液（0.01 mol/L，pH 7.0），振蕩搖勻后離心20 min（12 000×、4 ℃），取上清液，按體積比1∶1加入10 g/100 mL的三氯乙酸溶液，充分混勻，4 ℃靜置10 min后離心10 min（8 000×、4 ℃）；再取上清液，加入4 倍體積的雙縮脲試劑（0.1 g/mL氫氧化鈉＋0.01 g/mL硫酸銅），充分混勻后，室溫下靜置反應(yīng)30 min，在540 nm波長處測定吸光度，并通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算混合溶液中的小肽質(zhì)量濃度。

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：精確稱量0.5 g酪蛋白磷酸肽標(biāo)準(zhǔn)物（純度80%），置于50 mL容量瓶中定容，得到質(zhì)量濃度為8 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液；分別吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL上述標(biāo)準(zhǔn)溶液置于試管中，加入超純水補(bǔ)足至1.0 mL，再加入4.0 mL雙縮脲試劑（0.1 g/mL氫氧化鈉＋0.01 g/mL硫酸銅），充分混勻后，室溫下靜置反應(yīng)30 min，在540 nm波長處測定吸光度，根據(jù)酪蛋白磷酸肽的質(zhì)量濃度及對應(yīng)的吸光度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)分析用SPSS 25.0（SPSS Inc.，Chicago，IL，USA） 軟件進(jìn)行，結(jié)果均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的差異性分析使用單因素方差分析中Tukey檢驗(yàn)，顯著性水平為0.05；使用GraphPad Prism 5軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠體質(zhì)量變化

由圖1可知，隨著飼養(yǎng)時(shí)間的延長，4 組小鼠體質(zhì)量均呈現(xiàn)依次增加的趨勢，且4 組小鼠飼養(yǎng)4 周后體質(zhì)量增量之間均無顯著差異。

圖1 4 種飲食對小鼠體質(zhì)量的影響Fig. 1 Effect of four diets with chicken gels on body mass of mice

2.2 小鼠脂肪組織質(zhì)量變化

由圖2可知，CH組小鼠的皮下脂肪質(zhì)量顯著低于C組（＜0.05），而4 組小鼠的附睪脂肪質(zhì)量之間無顯著 差異。

圖2 4 種飲食對小鼠脂肪組織質(zhì)量的影響Fig. 2 Effect of four diets with chicken gels on adipose tissue mass of mice

2.3 小鼠血清生化指標(biāo)變化

由表2可知：4 組小鼠血清中TG、TC、HDL-C和LDL-C含量均未發(fā)生顯著變化；CA組和CH組小鼠血清中的總蛋白含量顯著低于C組（＜0.05）；受壓的H組和CH組小鼠血清中尿素氮含量顯著低于未受壓的C組和 CA組（＜0.05）。

表2 4 種飲食對小鼠血清生化指標(biāo)的影響（n=6）Table 2 Effect of four diets with chicken gels on blood serum biochemical indices of mice (n = 6)

2.4 小鼠胃和小腸食糜醇沉蛋白組分變化

SDS-PAGE顯示了4 組小鼠胃、小腸食糜的蛋白質(zhì)降解情況。由圖3A可知，在經(jīng)過胃消化后的4 組食糜中均含有一部分的高分子質(zhì)量蛋白條帶（235 kDa），同時(shí)在93 kDa處也均有蛋白條帶。而由圖3B可知，通過小腸階段的進(jìn)一步消化后的食糜中，4 組高分子質(zhì)量的蛋白條帶數(shù)量顯著減少或消失，均在低分子質(zhì)量（＜72 kDa）處出現(xiàn)大量的蛋白質(zhì)片段，值得注意的是，在42～53 kDa處，H組和CH組仍有可見的蛋白條帶出現(xiàn)，而C組和 CA組都只在更小的分子質(zhì)量處有蛋白條帶。

圖3 4 種飲食對小鼠胃和小腸食糜醇沉蛋白組分SDS-PAGE圖譜的影響Fig. 3 Effect of four diets with chicken gels on SDS-PAGE patterns of ethanol-insoluble proteins from gastric and small intestinal digesta

2.5 胃和小腸食糜粒徑大小及分布

由表3可知，經(jīng)過胃消化后，受壓H組的胃食糜粒徑和顯著高于CA組（＜0.05），顯著高于C組和CH組 （＜0.05），顯著高于其他3 組（＜0.05）。經(jīng)過小腸階段消化后，食糜粒徑均呈現(xiàn)較胃消化后減小的趨勢，且H組顯著高于C組和CA組（＜0.05），CA組顯著低于H組及CH組（＜0.05），2 個(gè)受壓組（H組與CH組）顯著高于非受壓組（C組與CA組）（＜0.05）。

表3 4 種飲食對小鼠胃和小腸食糜粒徑的影響（n=6）Table 3 Effect of four diets with chicken gels on particle size of gastric and small intestine digesta (n = 6)μm

2.6 小鼠小腸食糜小肽含量變化

由圖4可知，未添加氯化鈣的受壓H組小肽含量顯著高于添加氯化鈣的CA組（＜0.05），而其他各組之間均無顯著差異。

圖4 4 種飲食對小鼠小腸食糜小肽含量的影響Fig. 4 Effect of four diets with chicken gels on peptide content of small intestinal digesta

3 討 論

已有研究結(jié)果表明，HPP可能會通過改變蛋白質(zhì)的構(gòu)象而影響蛋白酶的酶解效率，產(chǎn)生不同的蛋白消化降解結(jié)果；而食糜的消化粒徑也可以反映食物在咀嚼及消化過程中的降解程度，食糜粒徑的減小會增大其比表面積，利于促進(jìn)酶促反應(yīng)和食糜的消化。另一方面，HPP會通過影響二硫鍵和疏水相互作用等引起蛋白質(zhì)的聚集和變性；而且蛋白質(zhì)的聚集也會導(dǎo)致蛋白質(zhì)粒徑的增大和消化率的降低。從SDS-PAGE結(jié)果可以看出，相比于非受壓凝膠飼喂組，受壓組的小鼠胃和小腸食糜中53 kDa的大分子質(zhì)量蛋白條帶較寬，反映出受壓組中未被消化的蛋白質(zhì)較多；而表3中2 個(gè)受壓組（H組和CH組）的食糜粒徑大于非受壓組，也證實(shí)了受壓后的肉蛋白更加難以消化降解。由此可以推測，HPP處理可能會通過改變?nèi)獾鞍椎木奂袨榧澳z微觀結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致較大的食糜粒徑和較寬的高分子質(zhì)量條帶，降低肉蛋白的消化性；HPP也可能通過改變?nèi)獾鞍椎臉?gòu)象，減少蛋白質(zhì)與酶作用的切割位點(diǎn)，降低酶解效率，導(dǎo)致肉蛋白降解不完全。

小肽作為機(jī)體攝入蛋白質(zhì)后消化吸收的中間產(chǎn)物或終產(chǎn)物，在蛋白質(zhì)營養(yǎng)中發(fā)揮著重要作用。小腸中的小肽含量可以反映攝入蛋白質(zhì)的消化降解情況，也可以間接反映胃腸消化階段酶解蛋白質(zhì)成為小肽的蛋白酶活性。經(jīng)過胃和小腸的消化，H組所含的小肽含量顯著高于CA組，其原因可能在于HPP誘導(dǎo)的密實(shí)蛋白質(zhì)凝膠結(jié)構(gòu)會通過阻滯蛋白質(zhì)降解產(chǎn)物小肽的吸收、增大小肽進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為氨基酸等小分子的空間位阻，導(dǎo)致受壓組（H組）小肽含量增高。同時(shí)，根據(jù)CH組小肽含量相對于H組的減小趨勢，可以進(jìn)一步推測氯化鈣具有減緩HPP抑制蛋白質(zhì)消化降解的作用。

Alomaim等研究發(fā)現(xiàn)，相對于正常飲食，高鈣飲食會降低小鼠膽固醇的吸收，增加膽汁酸的排泄，并降低不飽和脂肪酸和反式脂肪酸的消化率，對降低脂肪積累產(chǎn)生積極影響。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過4 周不同飲食干預(yù)后，4 組小鼠的體質(zhì)量增量沒有因蛋白質(zhì)消化降解的區(qū)別而產(chǎn)生顯著差異；但是添加氯化鈣/HPP都會減少小鼠的皮下脂肪積累量，且飼喂添加氯化鈣的受壓CH組小鼠降低皮下脂肪積累的效果顯著，其皮下脂肪積累量顯著低于C組，說明HPP和氯化鈣具有協(xié)同減少小鼠皮下脂肪積累量的作用。

血清蛋白具有維持血液正常膠體滲透壓和pH值、運(yùn)輸多種代謝物、免疫及營養(yǎng)等多種重要生理功能，是機(jī)體蛋白質(zhì)的重要來源，而未被機(jī)體利用的蛋白質(zhì)會通過脫氨基等反應(yīng)生成尿素并最終排出體外，通過檢測血清總蛋白和尿素氮的含量，可以反映不同飲食組小鼠對于蛋白質(zhì)或氨基酸的吸收代謝情況。受壓組（H組和 CH組）更低的血清總蛋白及更高的尿素氮含量，可以反映出HPP處理會降低雞肉蛋白質(zhì)和氨基酸的利用率。

4 結(jié) 論

經(jīng)HPP加工和未經(jīng)HPP加工組蛋白質(zhì)在小鼠體內(nèi)消化降解，消化后食糜粒徑存在顯著差異，未經(jīng)HPP加工組蛋白質(zhì)在經(jīng)過胃和小腸消化后，降解成更小的片段，粒徑更小，結(jié)合血清的生化指標(biāo)，HPP處理會降低雞肉蛋白質(zhì)和氨基酸的利用率。此外，HPP和氯化鈣具有協(xié)同減少小鼠皮下脂肪積累的作用。低鈉鹽凝膠肉制品中引入氯化鈣后，在改善品質(zhì)特性的同時(shí)對攝入后的營養(yǎng)功能方面起到了積極作用，而經(jīng)過HPP加工的雞肉凝膠制品在營養(yǎng)功能方面仍存在不足，氯化鈣及HPP在低鈉鹽凝膠肉制品方面的應(yīng)用以及對于肉蛋白消化特性的機(jī)理仍需要進(jìn)一步研究。