油蒿擴(kuò)繁叢枝菌根真菌的效果及土壤條件優(yōu)化研究

山寶琴, 宋惠子, 李嘉怡, 秦爽, 凌小嬡, 李婧

油蒿擴(kuò)繁叢枝菌根真菌的效果及土壤條件優(yōu)化研究

山寶琴1,2,*, 宋惠子1, 李嘉怡1, 秦爽1, 凌小嬡1, 李婧1

1. 延安大學(xué)石油工程與環(huán)境工程學(xué)院, 陜西延安 716000 陜西省區(qū)域生物資源保育與利用工程技術(shù)研究中心，陜西延安 716000

為驗(yàn)證油蒿()作為宿主植物擴(kuò)繁AM真菌的潛能, 試驗(yàn)選用了艾蒿、三葉草、黑麥草和紫花苜蓿4種植物為對照, 采用盆栽方法研究培養(yǎng)30 d、60 d、100 d后植物根圍AM真菌孢子密度的變化, 測定了100 d后植物根系的真菌菌絲侵染率、叢枝侵染率, 并針對油蒿研究了不同類別土壤對其擴(kuò)繁的影響, 分析孢子密度與土壤理化因子的相關(guān)性。結(jié)果表明: 油蒿和艾蒿兩種植物的菌絲侵染率平均值約達(dá)40%, 顯著高于其它3種植物(23%— 25%), 表現(xiàn)出與AM真菌良好的共生性。以油蒿為宿主經(jīng)過100 d擴(kuò)繁后, 其根圍孢子密度平均達(dá)57個·10g-1干土, 顯著高于其它4種植物。油蒿擴(kuò)繁最大值出現(xiàn)在60 d, 其它4種植物雖然孢子密度隨培養(yǎng)時間的延長而增加, 但60 d—100 d增長不顯著, 建議60 d為AM真菌盆栽擴(kuò)繁最佳期限。相關(guān)分析表明植物根圍AM真菌孢子密度與真菌菌絲侵染率、土壤速效磷呈顯著正相關(guān), 但與土壤pH值呈負(fù)相關(guān)性。當(dāng)選用油蒿為宿主植物分別4種土壤類型進(jìn)行AM真菌擴(kuò)繁時, 土壤養(yǎng)份較高的腐殖質(zhì)土孢子密度最大。

叢枝菌根真菌; 植物擴(kuò)繁; 油蒿

0 前言

叢枝菌根(Arbuscular Mycorrhizal, AM)真菌屬于真菌界球菌門, 通過侵染高等植物根系后菌絲二分叉形成叢枝狀共生互惠結(jié)構(gòu)—菌根[1], 植物繁茂的根系提供了真菌生存需要的微環(huán)境, 而真菌延伸的菌絲又成為植物與土壤間的橋梁, 約有90%的陸生植物能夠利用AM真菌從土壤中獲取需要的營養(yǎng)成分, 從而提高自身的活性與抗逆性[2-3]。AM 真菌是土壤有機(jī)碳庫的主要來源之一[4-5], 菌絲能促進(jìn)土壤團(tuán)粒結(jié)構(gòu)的形成及穩(wěn)定, 對退化土壤和污染土壤修復(fù)都有一定的改善作用[6-7], 使得它在提高土壤環(huán)境質(zhì)量、穩(wěn)定生態(tài)系統(tǒng)等方面有著非常廣闊的應(yīng)用前景。因此如何批量生產(chǎn)AM 真菌, 以獲得穩(wěn)定的工程菌劑已成為菌根生物技術(shù)應(yīng)用的要點(diǎn)。

真菌和植物之間存在的雙向物質(zhì)交換是叢枝菌根互惠共生的生理基礎(chǔ)[8], AM真菌的完整生活史必須依靠宿主植物根系所提供的碳水化合物, 從而決定了真菌產(chǎn)孢過程對宿主植物的依賴性, 這使得AM真菌人工純培養(yǎng)難以突破。通過盆栽植物活體擴(kuò)繁依然是國內(nèi)目前最經(jīng)典與常用的方法[9], 周霞等[10]以玉米和紅三葉草為宿主, 江龍等[11]以煙草為宿主植物, 研究了不同擴(kuò)繁基質(zhì)對AM真菌繁殖的影響。陳寧等[12]認(rèn)為擴(kuò)繁土壤的沙土比是關(guān)鍵的培養(yǎng)因子。大量的野外研究證明, AM真菌與共生植物之間雖無嚴(yán)格的專一性, 但隨宿主植物不同, AM真菌的侵染率、產(chǎn)孢量以及菌根效應(yīng)都不同[13], 表明植物與真菌之間的共生關(guān)系有一定的相互選擇性[14]。AM真菌的擴(kuò)繁應(yīng)該首先是針對宿主植物的篩選, 李媛媛等[15]的研究首選根系發(fā)達(dá)的草本植物, 如三葉草、紫花苜蓿、煙草、黑麥草等, 那么選擇須根發(fā)達(dá)且與AM真菌有良好共生性的油蒿做為宿主植物[16], 對于獲得量大且優(yōu)質(zhì)的AM菌劑可能有更顯著的效果。

油蒿()屬于菊科蒿屬多年生草本植物, 是半固定沙地先鋒物種[17], 其根系沙埋后能通過產(chǎn)生不定根進(jìn)行無性繁殖, 根系發(fā)達(dá)且須根豐富。野外調(diào)查研究表明油蒿根系與AM真菌有極好的共生性, 且根圍AM真菌孢子密度較高[16], 因此本研究選用油蒿為宿主植物, 以AM真菌擴(kuò)繁研究的優(yōu)選植物三葉草()、黑麥草()[10, 15]及陜北荒地恢復(fù)中常見草本植物艾蒿)、紫花苜蓿()作為參照, 通過實(shí)驗(yàn)室盆栽試驗(yàn), 旨在篩選出最佳擴(kuò)繁植物, 驗(yàn)證油蒿活體擴(kuò)繁AM真菌的效果, 為叢枝菌根菌劑的制備和應(yīng)用提供新的材料和科學(xué)依據(jù), 也為退化土壤以及污染土壤的菌根修復(fù)技術(shù)尋找突破口。

1 材料與方法

1.1 研究材料

1.1.1 菌種

AM真菌自野外土壤分離后先在顯微鏡下通過形態(tài)鑒定確定優(yōu)勢屬種及占比率, 其中球囊霉屬()的約占85%、無梗囊霉屬()的約占15%。在體視鏡下篩選飽滿、有活性的真菌孢子, 植物出苗后按照50個每盆接種于植物根圍約2 cm深土壤中。

1.1.2 宿主植物

選用油蒿、艾蒿、三葉草、黑麥草和紫花苜蓿作為宿主植物, 植物種子用0.5% H2O2溶液消毒10 min, 無菌水沖洗5次, 盆栽前經(jīng)過種子發(fā)芽實(shí)驗(yàn)確定出芽率。

1.1.3 栽培基質(zhì)

①5種植物對比試驗(yàn)所用栽培基質(zhì): 為延安大學(xué)樹木園黃綿土和細(xì)沙土以3:1比例混合。土壤背景值為: 有機(jī)質(zhì)23 mg·g-1, 速效氮21.5 μg·g-1, 速效磷12.59 μg·g-1, 速效鉀160 μg·g-1, pH 7.5。

②以油蒿為唯一宿主, 不同土壤類型對比試驗(yàn): 所用基質(zhì)為4種, 其中流動沙地與半固定沙地土壤, 取自陜北毛烏素沙漠(109°10′28″E, 37°23′ 56″N )背風(fēng)緩坡沙丘的下部; 輕質(zhì)黃綿土與腐殖質(zhì)土, 取自延安大學(xué)樹木園(109°32′06″ E, 36°35′12″ N),該園是由國家林業(yè)局于 1980 年下達(dá)陜西省林科院在延安建立的我國第一個黃土高原樹木園, 引種了許多珍貴樹種, 土壤類別多樣。土壤樣品風(fēng)干后, 利用高壓滅菌法(121 ℃, 0.1 MPa)滅菌120 min。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

盆栽試驗(yàn)選取直徑為15 cm, 高25 cm的塑料制盆作為培養(yǎng)器皿, 用95%酒精對培養(yǎng)器皿進(jìn)行消毒, 然后用蒸餾水沖洗。每盆裝1.5 kg土壤基質(zhì)。播種時挑選均勻、飽滿、健康的宿主植物種子, 按照30株/盆播種, 覆蓋約2 cm的土壤, 出苗后間苗至15株/盆, 間苗后在根圍2—5cm土層接種AM菌種。5種植物, 每種植物設(shè)定三組平行樣品, 共計(jì)15盆。并且每個樣品采樣測定三次, 共計(jì)45個。實(shí)驗(yàn)期間平均溫度為22 ℃(白天)和16 ℃(夜間), 相對濕度60%。

實(shí)驗(yàn)共100 d, 分別于30 d、60 d和100 d采集一次土壤樣品, 100 d后采收植物根系。

1.3 主要測定方法

1.3.1 土壤理化因子測定: 土壤 pH采用電位法、土壤有機(jī)質(zhì)采用重鉻酸鉀容量—外加熱法、土壤速效磷測定用NaHCO3浸提—鉬銻抗比色法, 土壤速效氮含量用堿解擴(kuò)散法[18]。

1.3.2 AM真菌孢子密度: 用濕篩傾注蔗糖離心法[19]對10 g風(fēng)干土壤中的AM真菌孢子進(jìn)行分離。在體視鏡下挑取AM真菌孢子進(jìn)行計(jì)數(shù), 將每10 g風(fēng)干土中的含孢量計(jì)為孢子密度。

1.3.3 菌根侵染率測定: 將收集的根樣切成1 cm的根段, 用KOH透明—乳酸甘油酸性品紅染色法測定根組織內(nèi)菌絲的侵染發(fā)育狀況[20]。選取25條約1.0 cm長的細(xì)根壓扁后, 采用細(xì)根的面積來分別計(jì)算菌絲、叢枝和泡囊等的侵染情況, 置于Olympus BXSO型顯微鏡下觀測計(jì)算根系的菌根侵染率。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用 SPSS18.0生物統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差(One–Way ANOVA)分析和兩兩相關(guān)(Pearson)分析, Excel軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同宿主植物對AM真菌侵染率及繁殖的影響

宿主植物培養(yǎng)100 d后, 分析土壤中AM真菌孢子密度和植物根系真菌侵染率。由圖１可知, 5種植物根圍AM真菌菌絲侵染率隨物種不同差異顯著。油蒿和艾蒿兩種蒿屬植物的菌絲侵染率平均值約40%, 顯著高于黑麥草、三葉草和紫花苜蓿, 后3種植物間菌絲侵染率為23%—25%, 無顯著差異。5種植物根圍AM真菌叢枝侵染率極低, 三葉草的叢枝侵染率最高, 平均值達(dá)3.5%, 紫花苜蓿最低(0.9%), 但不同植物間差異未達(dá)顯著性。采用不同宿主植物經(jīng)過相同培養(yǎng)時間后, AM真菌孢子繁殖結(jié)果差異顯著。以油蒿為宿主經(jīng)過100d擴(kuò)繁后, 其根圍孢子密度平均達(dá)57個·10g-1干土, 而其它4種植物根圍孢子密度平均值只在20—26個·10g-1干土之間, 油蒿擴(kuò)繁效果顯著好于其它對照。

2.2 擴(kuò)繁時間對AM真菌繁殖的影響

根據(jù)30 d、60 d和100 d培養(yǎng)時間不同, 分析不同宿主植物根圍土壤中AM真菌孢子密度的變化, 結(jié)果如圖2所示, 黑麥草、三葉草、艾蒿和紫花苜蓿呈現(xiàn)同樣的規(guī)律, 都是孢子密度隨著培養(yǎng)時間的延長而增加, 最大值出現(xiàn)在100 d。其中黑麥草、艾蒿和紫花苜蓿30 d數(shù)值較低, 60 d后有顯著增長, 但60 d和100 d之間差異并不顯著。說明同時考慮擴(kuò)繁數(shù)量和時間兩個參數(shù), 60 d為最佳培養(yǎng)期限。油蒿的孢子密度隨培養(yǎng)時間先升后降, 30 d至60 d有顯著增長, 擴(kuò)繁效果極好, 但延長至100 d反而有顯著下降。試驗(yàn)中觀察到, 60 d時油蒿根圍土壤中有新產(chǎn)生的孢子囊, 以及破裂后出現(xiàn)的量大而密集的小孢子果; 100 d時新生孢子體積增大但數(shù)量減少, 很可能由于是盆栽容積有限, 土壤中養(yǎng)分競爭而導(dǎo)致的生物自疏現(xiàn)象。因此, 綜合5種植物孢子密度隨培養(yǎng)時間的變化, 60天應(yīng)該是盆栽擴(kuò)繁的最佳期限。

注: 小寫字母不同表示不同植物在ρ< 0.05水平上差異顯著; 下同。

Figure 1 Spore density and infection rate of AM fungi in the rhizosphere of host plant

2.3 不同土壤類型對油蒿擴(kuò)繁AM真菌的影響

從5種植物中選取擴(kuò)繁量最高的油蒿進(jìn)一步研究其擴(kuò)繁適宜的土壤條件。從表1中分析, 半固定沙土、固定沙土、黃綿土、腐殖質(zhì)土的營養(yǎng)物質(zhì)含量依次明顯增加, 達(dá)到顯著差異, 腐殖質(zhì)土的養(yǎng)分狀態(tài)和土壤脲酶活性最好。從圖3中分析可知, AM真菌菌種在四種不同土壤中經(jīng)共生擴(kuò)繁后第60 d時, 孢子密度的增長隨土壤類別不同也呈現(xiàn)出顯著差異, 腐殖質(zhì)土 > 黃綿土 > 固定沙土 > 半固定沙土, 與土壤中有機(jī)質(zhì)、速效氮和速效磷等的變化趨勢一致。說明盆栽擴(kuò)繁過程中, 孢子繁殖效果受到土壤養(yǎng)分及土壤酶活性的顯著影響。本研究表明, 采用油蒿擴(kuò)繁AM真菌, 營養(yǎng)豐富的腐殖質(zhì)土是最佳匹配。

圖 2 培養(yǎng)時間與AM真菌孢子密度關(guān)系

Figure 2 Relationship between spore density of AM fungi and time

表1 4種土壤類型理化性質(zhì)分析

分析不同土壤類別隨培養(yǎng)時間所展現(xiàn)的效果, 30 d時黃綿土和腐殖質(zhì)中孢子密度略高, 60 d時黃綿土和腐殖質(zhì)土顯著高于兩種沙土, 到100 d時, 腐殖質(zhì)土中的孢子密度是半固定沙土的2.3倍。

圖3 不同土壤類型對AM真菌孢子密度的影響

Figure 3 Effect of different soil types on spore density of AM fungi

2.4 相關(guān)性分析

研究于100 d后一次性采收植物根系并統(tǒng)計(jì)分析AM真菌侵染率, 因此采用100 d時土壤理化因子數(shù)據(jù)進(jìn)行兩兩相關(guān)分析。結(jié)果表明, 植物根圍AM真菌孢子密度與土壤速效磷、菌絲侵染率呈顯著正相關(guān), 與土壤pH呈顯著負(fù)相關(guān)。菌絲侵染率和土壤有機(jī)質(zhì)呈顯著負(fù)相關(guān)。叢枝侵染率與土壤速效磷呈顯著負(fù)相關(guān)。

3 討論

AM真菌與宿主植物間是一種偏利的互惠共生關(guān)系, 植物獲取土壤養(yǎng)分的難易程度決定了兩者間關(guān)系的緊密性, 油蒿長期適應(yīng)嚴(yán)酷的荒漠環(huán)境, AM真菌能有效促進(jìn)植物對有效態(tài)氮及有機(jī)磷的吸收和利用, 從而協(xié)助油蒿抵御外界不良環(huán)境。以植物活體為宿主時, 叢枝菌根真菌的擴(kuò)繁效果受制于宿主植物與菌種本身的生物特性, AM真菌作為共生真菌對宿主植物具有一定的選擇性[21], 須根發(fā)達(dá)且有良好共生性的宿主植物能為真菌孢子繁殖提供良好的微環(huán)境。菌絲在土壤中大量生長延伸了植物根系的吸收面積, 同量也是植物根系皮層細(xì)胞中物質(zhì)傳遞的器官, 叢枝是共生體物質(zhì)及信息交換的界面。作為宿主植物對AM真菌的響應(yīng), 菌根侵染率是 AM 真菌與宿主植物的共生關(guān)系的最佳體現(xiàn)。三葉草和紫花苜蓿等由于易培養(yǎng)且根系生物量大, 常常作為AM 真菌擴(kuò)繁的優(yōu)選植物[15, 22], 然而本研究中蒿屬的兩種植物菌絲侵染率顯著更高, 具備擴(kuò)繁真菌的優(yōu)良條件。以油蒿為宿主經(jīng)過100 d擴(kuò)繁后, 其根圍孢子密度平均達(dá)57個·10g-1干土, 而其它4種植物根圍孢子密度平均值只在20—26個·10g-1干土之間, 油蒿擴(kuò)繁效果顯著高于其它對照。油蒿須根繁盛, 可以占到其總根生物量的70%以上[23], 長期生長在荒漠惡劣環(huán)境中從而進(jìn)化出與叢枝菌根的相互依賴的共生策略。

表 2 AM真菌孢子密度及侵染率與其它因子相關(guān)性分析表(n=45)

注: *表示兩者之間在<0.05水平上有顯著相關(guān)性。

AM真菌生長繁殖所需的碳源均來源于宿主植物[14], AM真菌孢子繁殖需要經(jīng)過原孢子萌發(fā), 萌發(fā)管生長, 真菌與植物根系雙重識別, 菌絲延伸和營養(yǎng)傳遞等多個環(huán)節(jié)。孢子繁殖經(jīng)歷適應(yīng)期, 快速增長期然后趨于飽和, 生物種群繁殖的世代重疊連續(xù)增長近似“J”形, 即隨時間增長而增長, 但在盆栽的有限空間及資源條件下, 培養(yǎng)后期增長極緩慢。

AM 真菌為好氧性真菌, 野外調(diào)查表明孢子密度在土壤垂直剖面上最大值出現(xiàn)在 0—10 cm土層[24],因此本研究植物根圍真菌接種深度也設(shè)定在土壤表層。AM真菌孢子繁殖主要受到土壤理化條件, 植物親和性及菌絲侵染率的影響。相關(guān)分析表明植物根圍AM真菌孢子密度與土壤速效磷、菌絲侵染率呈顯著正相關(guān), 但是與土壤pH值呈負(fù)相關(guān)性。AM 真菌根外菌絲體可為土壤中的解磷細(xì)菌提供營養(yǎng)元素, 促進(jìn)其生長延伸, 從而提高土壤中磷的活化及植物對磷的吸收利用, 因此AM真菌能控制土壤中磷的流失, 降低土壤磷對植物生長的限制作用[25-26]。袁月等[27]認(rèn)為植物生長和生理指標(biāo)對不同土壤pH有積極響應(yīng), 朱紅惠等[28]和任愛天等[29]研究表明AM真菌更適于在中性偏酸的土壤中生長, 本研究中AM真菌孢子密度與土壤pH呈顯著負(fù)相關(guān), 堿性土壤對真菌繁殖有抑制作用。

菌絲是AM真菌與植物間的地下橋梁, 是物質(zhì)與信息交換的界面, 通過真菌龐大的地下菌絲網(wǎng), 植物間礦質(zhì)營養(yǎng)元素可以實(shí)現(xiàn)再分配[30]。Douds等[31]用百喜草作為宿主植物, 發(fā)現(xiàn)孢子密度和菌根的侵染率存在顯著的正相關(guān)關(guān)系, 本研究呈現(xiàn)相同的規(guī)律。

4 結(jié)論

(1) 油蒿根系發(fā)達(dá)且與AM真菌有良好的共生性, 做為宿主植物能為AM真菌孢子繁殖提供良好的微環(huán)境, 本研究數(shù)據(jù)顯示油蒿是AM真菌擴(kuò)繁的良好宿主植物。

(2) 由于植物盆栽的空間及養(yǎng)分資源有限, 兼顧到盆栽擴(kuò)繁的時間及數(shù)量效果, 以油蒿為宿主植物時建議60 d為AM真菌最佳培養(yǎng)期限。

(3) 油蒿雖然是半固定沙土先鋒物種, 但是其根圍真菌繁殖受到土壤養(yǎng)分的顯著影響。4種研究土壤中養(yǎng)份較高的腐殖質(zhì)土, 是最適合油蒿擴(kuò)繁AM真菌的土壤類別。

綜上所述, 5種供試植物間比較, 油蒿更具有做為優(yōu)良宿主植物的潛質(zhì), 值得進(jìn)一步細(xì)化研究其擴(kuò)繁條件。

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Effect ofas host plant on the propagation of arbuscular mycorrhizae fungi and soil condition optimization

SHAN Baoqin1,2,*, SONG Huizi1, LIJiayi1, QINShuang1, LING Xiaoyuan1, LI Jing1

1.School of Petroleum Engineering and Environmental Engineering, Yan’an University, Yan’an 716000, China 2.Shaanxi Provincial Engineering Technology Research Center for Conservation and Utilization of Biological Resources, Yan'an 716000, China

having lush root system and good symbiosis ability with arbuscular mycorrhizal fungi, was selected to verify potential as a host plant of AMF propagation via pot, and four other plants ()were used as controls. The spore density of AMF in the rhizosphere soil of five host plant was studied at 30 d, 60 d and 100 d, respectively. The hyphal infection rate and arbuscularinfection rate of five host plant after 100 d were measured. Effects of different soil types on AMF propagation were studied, and the correlation between spore density and soil factors was analyzed. The result showed that the average hyphae infection rate ofandwas about 40%. The spore density in the rhizosphere soil ofwas 57N·10 g soil-1,which was significantly higher than that of other plants and showed a maximum at 60 d. correlation analysis showed that spore density was positively correlated with available phosphorus in soil and hyphal infection rate of AMF. But spore density was negatively correlated with soil pH. Whenwas used as host plant, humus soil with higher soil nutrients and lower pH was the most suitable soil type for AM fungi propagation.

arbuscular mycorrhizal fungi; propagation;

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10.14108/j.cnki.1008-8873.2022.05.016

Q933

A

1008-8873(2022)05-128-06

2020-08-27;

2020-11-20

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(21866031); 陜西省區(qū)域生物資源保育與利用工程技術(shù)研究中心項(xiàng)目(sxqczx-2019-07); 陜西省延安市科技局項(xiàng)目(SL2019ZCNY-004); 陜西省大學(xué)生創(chuàng)新項(xiàng)目(S201910719066)

山寶琴(1970—), 女, 新疆烏魯木齊人, 教授, 博士, 主要從事環(huán)境微生態(tài)研究, E-mail. xiaoshanbao@163.com

山寶琴