核酸適配體熒光分子開關(guān)的啶蟲脒測(cè)定

楊麗敏, 李明明

(中國(guó)石油大學(xué)(華東) 化學(xué)工程學(xué)院，山東 青島 266580)

0 引 言

近年來，食品安全、環(huán)境監(jiān)測(cè)、重大疾病早期診斷等問題日益突出。這些問題是民生，也是政治，關(guān)乎社會(huì)和諧、國(guó)家穩(wěn)定，更在十三五時(shí)期上升為國(guó)家重大戰(zhàn)略。為此，現(xiàn)代分析化學(xué)的任務(wù)已不只限于測(cè)定物質(zhì)的組成及含量，而是需要融合科學(xué)前沿，以新的思路、觀念和方式改進(jìn)目前的分析檢測(cè)水平。

核酸適配體(簡(jiǎn)稱，適配體)作為一種人工合成的識(shí)別分子，具有高特異性、高親和性、便于化學(xué)修飾與功能化、易于大規(guī)模低成本合成等特點(diǎn)[1-3]。無機(jī)離子、有機(jī)分子、蛋白質(zhì)乃至細(xì)胞、微生物均可能存在與其對(duì)應(yīng)的適配體。因此，基于適配體的傳感檢測(cè)方法已在食品安全、臨床醫(yī)療、環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，成為分析化學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一[4-5]。將適配體前沿學(xué)術(shù)知識(shí)理論和實(shí)驗(yàn)融入分析化學(xué)理論教學(xué)和實(shí)驗(yàn)教學(xué)中，有助于推動(dòng)分析化學(xué)教學(xué)與國(guó)家需求相銜接[1,6]。

本文聚焦分析化學(xué)的實(shí)驗(yàn)教學(xué)改革，設(shè)計(jì)了實(shí)驗(yàn)“核酸適配體熒光分子開關(guān)測(cè)定茶葉中的啶蟲脒”。適配體熒光分子開關(guān)是適配體熒光傳感器最常見的策略，屬于無需基底的靶分子非標(biāo)記模式(即SFALF模式)[7]。此模式下無需將適配體固定在基底上，整個(gè)傳感過程在均相溶液中完成。傳感信號(hào)主要來自適配體-靶分子結(jié)合過程對(duì)體系產(chǎn)生的擾動(dòng)。不僅操作簡(jiǎn)單，即使動(dòng)手能力薄弱的學(xué)生依然可以輕松駕馭；而且設(shè)計(jì)靈活，可以激發(fā)學(xué)生自主探索的興趣，有助于創(chuàng)新能力的培養(yǎng)。在靶標(biāo)分析物的選擇上，關(guān)注到近年來越顯突出的茶葉中的農(nóng)藥殘留問題，特別是新煙堿類農(nóng)藥(如啶蟲脒、吡蟲啉等)超標(biāo)現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生[8]，不僅成為人體健康不可忽視的隱患，而且對(duì)茶葉行業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，本實(shí)驗(yàn)以啶蟲脒為靶分子，設(shè)計(jì)適配體熒光分子開關(guān)，建立茶葉中啶蟲脒定量分析方法，加快我國(guó)茶葉行業(yè)的轉(zhuǎn)型和升級(jí)，保障消費(fèi)者的健康。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑和儀器

啶蟲脒特異性結(jié)合適配體(即ABA)的序列來源于文獻(xiàn)[9]。實(shí)驗(yàn)所用核酸鏈均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，其序列如表1所示。啶蟲脒購自Sigma公司，Tris-鹽酸緩沖液(1 mol/L，pH7.6)購自阿拉丁試劑公司。實(shí)驗(yàn)用水均為Millipore超純水(電阻率18.2 MΩ·cm)。熒光光譜用Fluoromax-4型熒光光譜儀(法國(guó)Horiba Jobin Yvon)測(cè)定。

表1 實(shí)驗(yàn)中使用的核酸鏈

1.2 BHQ1-cDNA對(duì)FAM-ABA的光淬滅效應(yīng)測(cè)量

取8個(gè)干凈的5 mL容量瓶，分別加入500 μL濃度為0.1 μmol/L的FAM-ABA，0、50、200、300、400、500、1 000、2 000 μL濃度為0.1 μmol/L的BHQ1-cDNA，再用Tris-鹽酸緩沖液定容至5 mL。然后，置于37 °C下反應(yīng)1 h。最后，以480 nm為激發(fā)波長(zhǎng)測(cè)量系列溶液的熒光光譜。

1.3 啶蟲脒的標(biāo)準(zhǔn)曲線

取9個(gè)干凈的5 mL容量瓶，分別加入500 μL濃度為0.1 μmol/L的FAM-ABA和500 μL濃度為0.1 μmol/L的BHQ1-cDNA，37 °C下反應(yīng)1 h。再向其中分別加入500 μL不同濃度(0，0.025，0.25，0.5，2.5，5 mg/mL)的啶蟲脒溶液(丙酮為溶劑)，并用Tris-鹽酸緩沖液定容至5 mL，37 °C下反應(yīng)1 h。最后，以480 nm為激發(fā)波長(zhǎng)測(cè)量系列溶液的熒光光譜。以發(fā)射波長(zhǎng)520 nm處的熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，啶蟲脒濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，繪制啶蟲脒的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4 茶葉中啶蟲脒的檢測(cè)

在啶蟲脒測(cè)定前，首先根據(jù)文獻(xiàn)[10]進(jìn)行了樣品制備，具體操作步驟如下。取5 g茶葉放進(jìn)100 mL沸水中煮4 min，待冷卻至室溫后，過濾掉茶葉。再將濾液用0.22 μm濾膜過濾器過濾3次，收集清液。取1個(gè)干凈的5 mL容量瓶，加入500 μL濃度為50 mg/mL的啶蟲脒溶液，并用茶葉清液定容至5 mL，獲得檢測(cè)樣品。

然后，再取1個(gè)干凈的5 mL容量瓶，加入500 μL濃度為0.1 μmol/L的FAM-ABA和500 μL濃度為0.1 μmol/L的BHQ1-cDNA，37 °C下反應(yīng)1 h。再向其中加入500 μL檢測(cè)樣品溶液，并用Tris-鹽酸緩沖液定容至5 mL，37 °C下反應(yīng)1 h后，以480 nm為激發(fā)波長(zhǎng)測(cè)量溶液的熒光光譜。取發(fā)射波長(zhǎng)520 nm處的熒光強(qiáng)度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中的啶蟲脒含量。最后，用測(cè)定的啶蟲脒含量值除以理論值，計(jì)算回收率[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 熒光分子開關(guān)設(shè)計(jì)

本實(shí)驗(yàn)以“雙鏈-復(fù)合物法”構(gòu)建適配體熒光分子開關(guān)[12-13]，其原理如圖1所示。將熒光基團(tuán)FAM標(biāo)記在啶蟲脒適配體ABA的5′端，形成FAM-ABA。將淬滅基團(tuán)BHQ1標(biāo)記在適配體互補(bǔ)鏈cDNA的3′端，形成BHQ1-cDNA。當(dāng)FAM-ABA與BHQ1-cDNA雜交成雙鏈時(shí)，F(xiàn)AM和BHQ1位于雙鏈同一端，彼此靠近。在波長(zhǎng)為480 nm的激發(fā)光照射下，F(xiàn)AM發(fā)射的熒光以非輻射形式轉(zhuǎn)移至BHQ1，即發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)現(xiàn)象。在熒光光譜上可觀察到，F(xiàn)AM-ABA的熒光強(qiáng)度比它單獨(dú)存在時(shí)要低得多，即熒光發(fā)生淬滅。若樣品中存在靶分子啶蟲脒，F(xiàn)AM-ABA傾向于與其靶分子結(jié)合，而使雙鏈解離，F(xiàn)AM和BHQ1彼此遠(yuǎn)離。研究表明，F(xiàn)RET效率與熒光基團(tuán)-淬滅基團(tuán)間距離的6次方成反比[14-15]。因此，當(dāng)啶蟲脒存在時(shí)，F(xiàn)RET效應(yīng)減弱甚至消失，F(xiàn)AM-ABA的熒光部分或完全恢復(fù)。由此可見，F(xiàn)AM-ABA與BHQ1-cDNA構(gòu)成的雙鏈結(jié)構(gòu)，因啶蟲脒的存在與否，形成熒光信號(hào)的關(guān)和開。以此構(gòu)建的適配體熒光分子開關(guān)可用于啶蟲脒的測(cè)定。

圖1 適配體熒光分子開關(guān)的工作原理

2.2 BHQ1-cDNA對(duì)FAM-ABA的熒光淬滅效應(yīng)

為了驗(yàn)證BHQ1-cDNA對(duì)FAM-ABA的熒光淬滅效應(yīng)，將FAM-ABA(10 nmol/L)先與不同濃度的BHQ1-cDNA雜交后，測(cè)量系列溶液的熒光光譜。如圖2所示，在420 nm激發(fā)波長(zhǎng)下，F(xiàn)AM-ABA在520 nm處形成一熒光發(fā)射峰。隨著BHQ1-cDNA濃度從0逐漸增加到40 nmol/L，520 nm處熒光峰的強(qiáng)度逐漸降低。這說明FAM-ABA與BHQ1-cDNA雜交后，熒光發(fā)生淬滅，F(xiàn)RET現(xiàn)象發(fā)生。并且，觀察到當(dāng)BHQ1-cDNA濃度為10 nmol/L(即與FAM-ABA濃度相同)時(shí)，已有58%的熒光發(fā)生淬滅，可以用于啶蟲脒測(cè)定。

圖2 FAM-ABA(10 nmol/L)與不同濃度BHQ1-cDNA作用后，在480 nm激發(fā)波長(zhǎng)下的熒光光譜

2.3 啶蟲脒的標(biāo)準(zhǔn)曲線

為了獲得啶蟲脒的標(biāo)準(zhǔn)曲線，首先對(duì)啶蟲脒對(duì)雜交雙鏈體系的熒光強(qiáng)度影響進(jìn)行了探究。將FAM-ABA(10 nmol/L)先與BHQ1-cDNA(10 nmol/L)雜交成雙鏈后，再與濃度分別為0，2.5，25，50，250，和500 μg/mL的啶蟲脒反應(yīng)，最后，測(cè)量系列溶液的熒光光譜。如圖3所示，隨著BHQ1-cDNA濃度從0逐漸增加到500 μg/mL，520 nm處熒光峰的強(qiáng)度逐漸增高。這說明，F(xiàn)RET效應(yīng)減弱，啶蟲脒的存在可以引起FAM-ABA與BHQ1-cDNA的分離。另外，還可以注意到，即使使用500 μg/mL(相當(dāng)于2.25 mmol/L，遠(yuǎn)高于核酸的使用濃度10 nmol/L)啶蟲脒，依然不能使FAM-ABA的熒光強(qiáng)度完全恢復(fù)，推測(cè)機(jī)理可能同時(shí)存在內(nèi)濾效應(yīng)[16]。

圖3 FAM-ABA及不同濃度啶蟲脒作用下雜交雙鏈體系的熒光光譜

然后，取520 nm處熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，啶蟲脒濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，繪制啶蟲脒的標(biāo)準(zhǔn)曲線。如圖4所示，當(dāng)啶蟲脒濃度在2.5～500 μg/mL時(shí)，熒光強(qiáng)度與啶蟲脒濃度的對(duì)數(shù)值呈良好線性相關(guān)性。

圖4 熒光分子開關(guān)測(cè)定啶蟲脒的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 茶葉中啶蟲脒檢測(cè)

按照前述實(shí)驗(yàn)操作步驟制備含有啶蟲脒的茶葉樣品溶液，與雜交雙鏈體系作用后，測(cè)定體系熒光光譜。取520 nm處的熒光強(qiáng)度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中的啶蟲脒含量為50.46 μg/mL，與理論值接近，回收率計(jì)算得100.92%，說明該方法準(zhǔn)確可靠，可用于實(shí)際樣品檢測(cè)。

3 實(shí)驗(yàn)特點(diǎn)

本實(shí)驗(yàn)是科研成果反哺基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)的典型案例，具有以下突出特點(diǎn)。

(1) 強(qiáng)調(diào)科技前沿與實(shí)際問題的結(jié)合，增強(qiáng)學(xué)生服務(wù)國(guó)家社會(huì)的意識(shí)。本實(shí)驗(yàn)立足食品安全國(guó)家重大戰(zhàn)略，聚焦茶葉農(nóng)藥殘留超標(biāo)實(shí)際問題，突破傳統(tǒng)儀器分析在實(shí)際應(yīng)用中的局限，以茶葉常用農(nóng)藥啶蟲脒為靶分子，結(jié)合適配體傳感檢測(cè)前沿技術(shù)，設(shè)計(jì)適配體熒光分子開關(guān)，建立新型檢測(cè)方法。本實(shí)驗(yàn)始于實(shí)際問題，止于實(shí)際應(yīng)用，有助于提高學(xué)生利用所學(xué)解決實(shí)際問題的能力，增強(qiáng)服務(wù)社會(huì)、熱愛國(guó)家的情操和意識(shí)。

(2) 匹配學(xué)生實(shí)操基礎(chǔ)，助力學(xué)生把握科技前沿。本實(shí)驗(yàn)所需關(guān)鍵材料為FAM-ABA和BHQ1-cDNA兩條核酸鏈，屬于商業(yè)化定制材料，極易獲得。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程，除了簡(jiǎn)單的溶液配制外，不涉及任何工藝復(fù)雜的材料制備，非常便于操作，能夠與學(xué)生薄弱的實(shí)操基礎(chǔ)相匹配。在實(shí)驗(yàn)技能上不設(shè)置門檻，重在培養(yǎng)解決問題的能力，以及把握科技前沿的能力。

(3) 強(qiáng)化科研思維，培育創(chuàng)新源動(dòng)力。本實(shí)驗(yàn)流程包括：①熒光分子開關(guān)設(shè)計(jì)；②BHQ1-cDNA對(duì)FAM-ABA的熒光淬滅效應(yīng)；③啶蟲脒的標(biāo)準(zhǔn)曲線；④茶葉中啶蟲脒的檢測(cè)。其中，第①步是原理設(shè)計(jì)，“提出假設(shè)”；第②、③步是原理可行性驗(yàn)證，“小心求證”；第④步是應(yīng)用拓展。這種根據(jù)問題構(gòu)建科學(xué)假說、根據(jù)假說設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)合理求證、根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果再調(diào)整甚至重構(gòu)科學(xué)假說的教學(xué)設(shè)計(jì)，是科研思維的具體表現(xiàn)，有助于培養(yǎng)學(xué)生創(chuàng)新意識(shí)。在假設(shè)階段，啟迪學(xué)生不迷信學(xué)術(shù)權(quán)威，不盲從既有學(xué)說，敢于大膽質(zhì)疑。在求證階段，要求學(xué)生嚴(yán)格求證，唯真唯實(shí)。在應(yīng)用階段，引導(dǎo)學(xué)生融入實(shí)際應(yīng)用情景，以解決實(shí)際問題為己任。

4 結(jié) 語

本實(shí)驗(yàn)將分析化學(xué)學(xué)科研究熱點(diǎn)—適配體熒光分子開關(guān)引入本科實(shí)驗(yàn)教學(xué)，面向國(guó)家重大需求，科研思維貫穿教學(xué)始終。通過本實(shí)驗(yàn)，學(xué)生們不僅可以接觸到學(xué)科前沿，更重要的，在解決實(shí)際問題的過程中，科研思維得以塑造，科學(xué)視野得以拓展，愛國(guó)意識(shí)得以加強(qiáng)，創(chuàng)新精神得以喚醒。本實(shí)驗(yàn)將推動(dòng)分析化學(xué)突破經(jīng)典的束縛，與前沿接軌，與國(guó)家社會(huì)需求緊密銜接。