和肝湯對功能性消化不良大鼠十二指腸微炎癥的影響

趙靜怡,鄭金粟,曹 銳

(首都醫(yī)科大學附屬北京朝陽醫(yī)院中醫(yī)科，北京 100020；*通訊作者,E-mail:caorui@vip.sina.com)

功能性消化不良(functional dyspepsia，F(xiàn)D)以餐后腹脹、腹痛、早飽等為主要癥狀表現(xiàn)，是臨床的常見病[1]。FD的發(fā)病機制錯綜復雜，胃動力異常、內臟敏感性升高、十二指腸微炎癥狀態(tài)皆為其主要病理改變[2,3]。FD十二指腸微炎癥主要表現(xiàn)為肥大細胞、嗜酸性粒細胞等炎癥細胞以及炎癥因子在局部的異常表達[4-6]，并進而影響胃腸運動和感覺功能[7]?，F(xiàn)有常規(guī)西醫(yī)治療手段主要包括抑胃酸、促動力等[2]，近年膽堿酯酶抑制劑、5-HT1A激動劑、神經(jīng)調節(jié)劑等逐步用于FD的治療[3]，但其有效性和安全性仍欠滿意。

中醫(yī)藥治療FD具有良好的療效[8]。國醫(yī)大師方和謙教授從自身重視“調理肝脾”的學術思想出發(fā)，在經(jīng)方逍遙散的基礎上創(chuàng)制經(jīng)驗名方和肝湯[9]。本方治療FD效果顯著，在改善臨床總有效率、單項癥狀和降低復發(fā)率方面均優(yōu)于促動力藥對照組[10]。然而，和肝湯是否能夠改善FD十二指腸微炎癥及其機制仍需進一步研究。

既往和前期研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)D十二指腸局部炎癥相關因子和肥大細胞表達異常，而中藥干預可減輕其局部微炎癥水平[11,12]，但具體的分子生物學作用機制仍有待進一步深入研究。為了初步挖掘中藥和肝湯的治療靶點，本研究推測和肝湯的作用機制可能與緩解微炎癥狀態(tài)相關，并通過動物實驗驗證和肝湯是否通過調節(jié)炎癥因子和炎癥細胞表達，減輕十二指腸微炎癥狀態(tài)，進而對FD產(chǎn)生治療作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 18只6周齡雄性SPF級SD大鼠，體質量(200±20)g，購自北京維通利華生物技術有限公司，動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(京)2021-0006。動物使用許可證號:SYXK(京)2020-0050。所有動物飼養(yǎng)于北京邁德康納生物技術有限公司SPF動物房。動物飼養(yǎng)條件：溫度(22±1)℃，濕度50%～60%，光照/黑暗(12 h/12 h)，所有動物均可自由進食、飲水。本動物實驗獲得首都醫(yī)科大學動物倫理委員會許可(倫理編號：AEEI-2021-238)。

1.1.2 藥物 和肝湯由當歸12 g、白芍12 g、黨參9 g、白術9 g、茯苓9 g、柴胡9 g、薄荷3 g、蘇梗9 g、香附9 g、生姜3 g、大棗4枚/12 g、炙甘草6 g共12味中藥組成。選用目前公認的臨床等效劑量為和肝湯的大鼠干預劑量，和肝湯中藥飲片生藥共計102 g，計算臨床等效劑量為0.918 g生藥質量/100 g大鼠體質量，于江陰天江藥業(yè)制備和肝湯顆粒劑，每2袋顆粒含102 g生藥，研磨后加入111 ml生理鹽水充分溶化，灌胃劑生藥濃度為0.918 g/ml。

1.1.3 試劑和儀器 主要試劑：大鼠白細胞介素10(IL-10)ELISA試劑盒，泉州市睿信生物科技有限公司(貨號：RX302880R)；大鼠白細胞介素12(IL-12)ELISA試劑盒，泉州市睿信生物科技有限公司(貨號：RX302878R)；蘇木精伊紅(HE)染色試劑盒，北京索萊寶科技有限公司(貨號：G1120)；甲苯胺藍染色試劑，北京索萊寶科技有限公司(貨號：G3661)。

主要儀器：酶標儀(型號：RT-6100)，美國Rayto公司；高速冷凍離心機(型號：TGL16M)，湖南湘儀離心機儀器有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱(型號：DHP-9012)，武漢一恒蘇凈科學儀器有限公司；脫水機，武漢俊杰電子有限公司(JJ-12J)；包埋機(型號：JB-P5)，武漢俊杰電子有限公司；病理切片機(型號：RM2016)，上海徠卡儀器有限公司；正置光學顯微鏡(型號：Nikon Eclipse ci)，日本尼康；顯微成像系統(tǒng)(型號：NIKON DS-U3)，日本尼康。

1.2 分組與干預

將18只大鼠隨機分為對照組、模型組、中藥組共3組，每組6只。采用夾尾應激法[13]建立FD大鼠模型，每組5只大鼠同籠，模型組和中藥組大鼠用長海綿鉗夾大鼠尾巴遠端1/3處，以不破皮為度，令其暴怒，尋釁與其他大鼠撕打，以激怒全籠大鼠。每次刺激持續(xù)30 min。隨著打斗的加劇，大鼠可能被抓傷，為避免炎癥干擾，用0.15%碘伏涂擦受傷部位控制感染。每4 h刺激1次，每日3次，連續(xù)刺激7 d。造模結束后，中藥組給予和肝湯顆粒灌胃，每102 g生藥的免煎顆粒研磨后稀釋為111 ml液體湯劑，使其充分溶解，灌胃量為1 ml/100 g體質量，為臨床等效劑量正常組和模型組給予等容積生理鹽水灌胃，每日1次，連續(xù)灌胃7 d。中藥組及模型組在灌胃期間繼續(xù)予以夾尾，防止模型自發(fā)恢復。

1.3 一般指標檢測

①體質量：在第0天(造模開始前)、第7天(造模結束后)、第14天(干預結束后取材當天)分別測量各組大鼠的體質量。

②3 h攝食量檢測：第14天檢測大鼠3 h攝食量，檢測前禁食12 h，不禁水，檢測時給予每只大鼠鼠糧15 g，3 h后稱重并記錄剩余鼠糧，按公式計算大鼠3 h進食量：3 h進食量(g)=15 g-剩余鼠糧(g)。

③疼痛閾值評估：在造模干預結束后對各組大鼠進行疼痛閾值評估，以體現(xiàn)大鼠內臟高敏程度。參照浙江大學實驗動物中心的大鼠疼痛評估方法指南[14]，對大鼠的體質量、攝食、外觀、臨床癥狀、社會化行為和刺激反應進行評價、記錄和計分，根據(jù)評估指南中涉及的疼痛癥狀的輕中重等級分別記1分、2分、3分，無相應疼痛表現(xiàn)則記為0分，大鼠疼痛閾值的計算公式為：疼痛閾值=1-疼痛得分/總分。

1.4 實驗室檢測指標

1.4.1 取材 預先禁食不禁水24 h。于第14天進行取材，予1%戊巴比妥鈉(80 mg/kg)腹腔注射麻醉，后逐層剪開皮膚、肌肉、暴露腹腔臟器，剪取大鼠十二指腸組織，十二指腸取位于幽門下0.5 cm后約3～4 cm的組織，分別進行如下處理：用于HE染色的胃和十二指腸組織置于4%多聚甲醛中固定，后續(xù)用石蠟包埋制作石蠟切片；用于ELISA檢測的十二指腸組織置于凍存管迅速放入液氮中保存。

1.4.2 HE染色觀察大鼠十二指腸形態(tài) 取各組大鼠十二指腸組織，石蠟包埋后制備組織切片，厚度5～7 μm。脫蠟、修復抗原后進行HE染色，具體步驟如下：蘇木精液染色5 min，流水稍洗去蘇木精液1～3 s，1%鹽酸乙醇1～3 s，稍水洗10～30 s，蒸餾水洗1～2 s，0.5%伊紅液染色1～3 min，蒸餾水洗1～2 s。脫水透明、封片后顯微鏡下觀察拍照。

1.4.3 甲苯胺藍染色觀察十二指腸肥大細胞 取各組大鼠十二指腸組織，石蠟包埋后制備組織切片，厚度4 μm。脫蠟、修復抗原后進行甲苯胺藍染色，具體步驟如下：甲苯胺藍染色液(甲苯胺藍0.5 g+蒸餾水100 ml)處理10 min，蒸餾水洗凈，冰醋酸分化液(冰醋酸0.5 ml+蒸餾水100 ml)處理30 s左右，顯微鏡下觀察至顆粒清晰為止，蒸餾水洗凈。脫水透明、封片后顯微鏡下觀察拍照。

1.4.4 ELISA法檢測十二指腸抗炎因子和促炎因子含量 ELISA法分別檢測十二指腸的促炎細胞因子IL-12和抗炎細胞因子IL-10的表達水平。將大鼠十二指腸組織迅速剪碎研磨后離心，離心力：10 000g，離心半徑(R)：8.5 cm，轉速：10 444 r/min，時間10 min，取上清液。配置梯度濃度的標準品，用于制作標準曲線。將待檢樣品、標準品加入相應的96孔板中，37 ℃孵育1 h，移除封板膜，于洗滌機中洗滌5次。加入HRP標記的IL-12、IL-10抗體，37 ℃避光孵育30 min后洗滌，之后依次加入顯色底物和終止液，在10 min內于酶標儀讀取標準品、樣品的吸光值，據(jù)標準品濃度和OD值做標準曲線，據(jù)標準曲線方程計算出樣本濃度(pg/g)。

1.5 統(tǒng)計方法

2 結果

2.1 和肝湯對FD大鼠體質量的影響

結果顯示，造模開始前(第0天)各組大鼠的體質量基本一致，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；造模結束后(第7天)，中藥組、模型組大鼠體質量較正常組大鼠顯著減輕，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，且中藥組和模型組大鼠體質量基本一致，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；干預結束后(第14天)，模型組大鼠體質量仍較正常組顯著減輕，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，而中藥組大鼠體質量較模型組增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表1)。

表1 各組大鼠體質量變化比較 (n=6,g)

2.2 和肝湯對FD大鼠3 h攝食量的影響

3 h攝食量結果顯示，模型組大鼠3 h攝食量較正常組大鼠顯著減低(P<0.01)；而經(jīng)過和肝湯治療后，大鼠攝食量能力部分恢復，中藥組大鼠3 h攝食量高于模型組(P<0.01，見表2)。

表2 各組大鼠3 h攝食量和疼痛閾值評分

2.3 和肝湯對FD大鼠疼痛閾值的影響

疼痛閾值結果顯示：模型組大鼠疼痛閾值顯著低于正常組大鼠(P<0.01)；而經(jīng)過健脾理氣方治療后，大鼠疼痛情況改善，中藥組大鼠疼痛閾值高于模型組(P<0.01，見表2)。

2.4 各組大鼠十二指腸組織形態(tài)

HE染色結果顯示：各組大鼠十二指腸組織均結構完整，形態(tài)清晰，細胞排列整齊，無明顯損傷病變表現(xiàn)(見圖1)。這一結果亦符合FD不存在顯著器質性病變的傳統(tǒng)定義。

圖1 各組大鼠十二指腸組織形態(tài)結構 (HE染色，×20)Figure 1 Duodenal tissue morphology of rats in each group (HE staining, ×20)

2.5 和肝湯對FD大鼠十二指腸肥大細胞聚集的影響

甲苯胺藍染色結果顯示，鏡下觀察正常組大鼠十二指腸的固有層有少量藍紫色陽性著色反應；模型組大鼠十二指腸固有層藍紫色陽性著色更為顯著，呈強陽性反應；中藥組大鼠十二指腸固有層的陽性反應程度較模型組減弱，與正常組基本一致(見圖2)。

圖2 各組大鼠十二指腸肥大細胞聚集情況 (甲苯胺藍染色，×40)Figure 2 Duodenal mast cell aggregation of rats in each group (toluidine blue staining, ×40)

2.6 和肝湯對FD大鼠十二指腸炎癥因子和抗炎因子表達水平的影響

ELISA結果顯示，模型組大鼠十二指腸炎癥細胞因子IL-12表達水平較正常組顯著升高(P<0.01)，經(jīng)和肝湯顆粒治療后，中藥組大鼠十二指腸IL-12表達減少(P<0.01)；與此同時，模型組大鼠十二指腸抗炎細胞因子IL-10表達水平較正常組增多，經(jīng)和肝湯顆粒治療后，中藥組大鼠十二指腸抗炎因子IL-10水平進一步增加，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.01，見表3)。

表3 各組大鼠十二指腸促炎因子IL-12和抗炎因子IL-10表達水平 (pg/g)

3 討論

2016年發(fā)布的關于功能性胃腸病的羅馬Ⅳ標準中將“十二指腸微炎癥(duodenal low-grade inflammation)”這一概念列為功能性消化不良的病理改變之一，并提出十二指腸嗜酸粒細胞聚集是十二指腸微炎癥的典型病理表現(xiàn)[2]。研究顯示，F(xiàn)D患者十二指腸局部炎癥細胞和炎癥因子的聚集活化與黏膜下層神經(jīng)及神經(jīng)節(jié)的功能及結構變化相關，故目前認為十二指腸微炎癥可能是腦-腸軸功能異常的驅動因素，而十二指腸可能是引起動力感覺異常的胃腸功能調控中心[5,6,15,16]。IL-12、IL-10分別為已知的機體關鍵促炎因子和抗炎因子，在多種以免疫失衡為主要發(fā)病機制的消化系統(tǒng)疾病中扮演了關鍵角色。在FD十二指腸局部微炎癥的形成過程中，炎癥細胞因子的表達是否存在失衡以及其背后的分子生物學機制仍有待明確。因此，本研究從十二指腸微炎癥入手，以促炎細胞因子IL-12、抗炎細胞因子IL-10為關鍵靶標，探究和肝湯對FD的作用機制是否與調節(jié)炎癥因子表達，進而減輕十二指腸微炎癥狀態(tài)有關。

研究結果顯示：夾尾應激造模的FD大鼠體質量減輕，攝食量減少，疼痛閾值降低，而和肝湯顆?？梢燥@著改善FD大鼠的體質量和攝食量，部分緩解大鼠疼痛癥狀，提高疼痛閾值評分；此次，夾尾應激的FD大鼠十二指腸存在低程度炎癥，其肥大細胞在十二指腸固有層聚集，促炎細胞因子IL-12的表達增多，處于炎癥反應的輕度異常狀態(tài)，與此同時抗炎因子IL-10表達亦增多，推測因機體存在抗炎與促炎之間的免疫協(xié)調反饋，這可能有助于使十二指腸局部炎癥維持在低程度的病理狀態(tài)；而和肝湯顆粒減少肥大細胞在局部的分布，下調十二指腸炎癥細胞因子IL-12的含量，同時促進抗炎因子IL-10的表達，調整局部的免疫炎癥程度，發(fā)揮對十二指腸黏膜的保護作用。FD十二指腸局部炎癥因子和炎性細胞表達增多，刺激抗炎因子合成分泌增加，IL-10的表達量相對增多；而和肝湯治療后抗炎因子IL-10較模型組進一步增多，提示和肝湯可能在十二指腸發(fā)揮了炎癥水平調節(jié)作用，其促進抗炎因子IL-10進一步合成分泌，以抑制局部的炎癥反應，體現(xiàn)了其多靶點、雙向調節(jié)的優(yōu)勢作用。

現(xiàn)代中醫(yī)根據(jù)FD患者的臨床癥狀，將其歸屬于痞滿、胃脘痛等病范疇，并認為其病位在胃，與肝脾密切相關，而肝脾失調是病機的關鍵環(huán)節(jié)[8]。因此，從肝脾論治是中醫(yī)治療FD的核心思路，調肝理脾是其基本治法。國醫(yī)大師方和謙教授從自身重視調理肝脾的學術思想出發(fā)，基于經(jīng)方逍遙散創(chuàng)制了經(jīng)驗名方和肝湯[9]。和肝湯中當歸、白芍為君以養(yǎng)血柔肝，柴胡、薄荷、蘇梗、香附為臣以疏肝解郁、行氣寬中，黨參、茯苓、白術、生姜、大棗為佐以健脾益氣和胃，為仲景所謂“見肝之病，知肝傳脾，當先實脾”；以甘草為使以甘緩和中、調和諸藥。全方在逍遙散疏肝解郁、健脾和營的基礎上加重了培土和中之效，用于治療以肝脾失調為病機關鍵的FD具有較強的優(yōu)勢，臨床應用亦屢獲良效[10]，值得推廣和進一步深入研究。

綜上所述，本研究顯示：FD大鼠十二指腸固有層肥大細胞聚集，促炎細胞因子IL-12和抗炎細胞因子IL-10表達異常，這可能與十二指腸微炎癥狀態(tài)的形成有關；而和肝湯顆?？梢詼p少肥大細胞在十二指腸局部的分布，調整炎癥細胞因子表達水平，進而減輕十二指腸微炎癥狀態(tài)，這可能是和肝湯治療FD的作用機制之一。