miR-206通過(guò)靶向GREM1調(diào)節(jié)鼻咽癌細(xì)胞的增殖、遷移能力

邵倩倩，王曉敏，李 慧，蘇 凱，王夢(mèng)君，馬士崟*

(1蚌埠醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，蚌埠 233000；2蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科;*通訊作者,E-mail:mashiyinent@163.com)

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)是一種起源于鼻咽上皮的惡性頭頸部腫瘤，其發(fā)病率明顯具有區(qū)域性，在東南亞和北非居高不下[1,2]。根據(jù)國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)2018年的報(bào)告，全球每年有129 079例新發(fā)NPC病例和72 987例死亡[3]。大約10%的患者在原發(fā)部位有殘留或復(fù)發(fā)，15%～30%的NPC患者在根治后有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。遺傳易感性、環(huán)境致癌物和愛(ài)潑斯坦-巴爾病毒(EBV)感染被認(rèn)為是導(dǎo)致這種惡性腫瘤的重要因素。由于缺乏癥狀表現(xiàn)，大多數(shù)鼻咽癌患者被診斷為晚期，復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移已成為鼻咽癌治療失敗的主要原因[4-6]。

microRNA(miRNA)是一組豐富的22個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA，通過(guò)抑制目標(biāo)mRNA的翻譯或降解在轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)節(jié)基因的表達(dá)[7,8]。研究表明，miRNA的表達(dá)與多種癌癥有關(guān)，在腫瘤進(jìn)展中起著至關(guān)重要的作用[9,10]。因此，研究異常表達(dá)的miRNA以識(shí)別NPC治療的新的靶點(diǎn)是非常有必要的。miR-206在宮頸癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤和肝癌等多種癌癥進(jìn)程中扮演重要角色[11-13]。到目前為止，miR-206在鼻咽癌發(fā)展進(jìn)程中的作用及機(jī)制在很大程度上仍未可知。因此，本研究檢測(cè)miR-206在鼻咽癌細(xì)胞中的表達(dá)水平，探討miR-206對(duì)鼻咽癌細(xì)胞增殖與遷移的影響及相關(guān)機(jī)制，為鼻咽癌的臨床研究與治療提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

人鼻咽癌細(xì)胞株NP69、CNE2、HNE1、6-10B及5-8F均購(gòu)自中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院，凍存、培養(yǎng)于蚌埠醫(yī)學(xué)院生化藥理實(shí)驗(yàn)室。RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)及Opti-MEM培養(yǎng)基均購(gòu)于美國(guó)Gibco公司。噻唑藍(lán)(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)購(gòu)于美國(guó)Sigma公司。脂質(zhì)體Lipofectamine2000、Trizol試劑均購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司；miR-206類(lèi)似物(miR-206 mimics)和陰性對(duì)照(negative control，NC)購(gòu)于上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；SYBR Green PCR Master Mix購(gòu)自日本TaKaRa公司；RevertAid TM First Strand cDNA Synthesis Kit購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific。GREM1、N-catenin及Vimentin一抗抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 鼻咽癌細(xì)胞系NP69、CNE2、HNE1、6-10B、5-8F均使用RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，其中加入10%胎牛血清(FBS)。細(xì)胞在溫度為37 ℃、飽和濕度的含有5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 生物信息學(xué)方法分析miR-206在鼻咽癌組織中的表達(dá) 采用ENCORI數(shù)據(jù)庫(kù)分析miR-206在鼻咽癌組織和癌旁組織中的表達(dá)水平。

1.2.3 qRT-PCR檢測(cè)mRNA的表達(dá) Trizol法提取細(xì)胞總RNA，使用Prime ScriptTM第一鏈cDNA合成試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA保存于-80 ℃。miR-206以U6為內(nèi)參，GREM1以GAPDH為內(nèi)參，參照試劑盒說(shuō)明確定qRT-PCR反應(yīng)體系及條件。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，得到每孔Ct值后，計(jì)算3個(gè)復(fù)孔的平均值，按照2-ΔΔCt法相對(duì)定量計(jì)算公式計(jì)算miR-206和GREM1相對(duì)表達(dá)量。引物序列如下:miR-206的上游引物為5′-CAGATCCGATTGGAATGTAAGG-3′，下游引物為5′-TATGCTTGTTCTCGTCTCTGTGTC-3；GREM1的上游引物為5′-AAGTGACAGAATGAATCGCA-3′，下游引物為5′-CCGCTTTGACTTAATCCAAG-3′；GAPDH的上游引物為5′-AATGAAGGGGTCATTGATGG-3′，下游引物為5′-AAGGTGAAGGTCGGAGTCAA-3′。

1.2.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和分組 將鼻咽癌細(xì)胞HNE1和CNE2以每孔1×105的密度接種到6孔板中。按照制造商的說(shuō)明書(shū)，使用Lipofectamine2000與opti-MEM轉(zhuǎn)染鼻咽癌HNE1和CNE2細(xì)胞，轉(zhuǎn)染的效果通過(guò)qRT-PCR確定。根據(jù)轉(zhuǎn)染miR-206 mimics或NC將鼻咽癌細(xì)胞株HNE1(或CNE2)分為兩組，即miR-206 mimics組或NC組，進(jìn)行后續(xù)研究。

1.2.5 MTT法檢測(cè)HNE1和CNE2細(xì)胞增殖 取轉(zhuǎn)染miR-206 mimics或NC后的HNE1或CNE2細(xì)胞以1×104/ml密度接種于96孔板中，100 μl/孔，培養(yǎng)48 h細(xì)胞貼壁后，加入10 μl MTT溶液，并于37 ℃下孵育4 h。吸去每孔中的上清液，加入100 μl DMSO繼續(xù)孵育于37 ℃孵育箱中30 min。使用酶標(biāo)儀，檢測(cè)波長(zhǎng)490 nm處的吸光度(OD值)并計(jì)算細(xì)胞存活率。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.2.6 集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖 將轉(zhuǎn)染miR-206 mimics或NC后的HNE1或CNE2細(xì)胞以每孔5×103細(xì)胞密度接種在6孔板中。在含5%CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，觀察到集落形成后吸去培養(yǎng)基。使用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌6孔板兩次后，加入4%甲醛固定10 min后吸去甲醛，加入5%結(jié)晶紫染色10 min。吸去結(jié)晶紫，使用PBS沖洗后進(jìn)行集落計(jì)數(shù)。

1.2.7 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移 將轉(zhuǎn)染miR-206 mimics或NC后的HNE1或CNE2細(xì)胞種植于6孔板中，等細(xì)胞融合后，使用高壓滅菌槍頭(200 μl)在孔內(nèi)輕劃1～3道劃痕，分別在劃痕后和24 h后于顯微鏡下觀察細(xì)胞劃痕修復(fù)情況，并記錄劃痕的寬度。

1.2.8 蛋白質(zhì)印跡分析檢測(cè)蛋白表達(dá) 使用裂解緩沖液提取轉(zhuǎn)染miR-206 mimics或NC后的HNE1或CNE2細(xì)胞蛋白。采用BCA蛋白檢測(cè)試劑盒檢測(cè)不同分組蛋白樣品的濃度。將40 μg總蛋白采用8%～15%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離后轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。PVDF膜浸于5%脫脂牛奶中密封1 h，后孵于一抗中4 ℃過(guò)夜。孵育過(guò)夜后使用TBST清洗3次后將膜浸于在二抗中1 h。使用TBST清洗后加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯色、定影。采圖像處理軟件對(duì)各條帶進(jìn)行灰度值分析。

1.2.9 生物信息學(xué)方法分析GREM1在鼻咽癌組織中的表達(dá) 使用公共數(shù)據(jù)庫(kù)GEPIA分析GREM1在鼻咽癌組織及癌旁組織中的mRNA表達(dá)水平。

1.2.10 Transwell Boyden小室檢測(cè)細(xì)胞遷移 在鼻咽癌HNE1(或CNE2)細(xì)胞中，分別轉(zhuǎn)染mimics NC+vector、miR-206 mimics+vector和miR-206 mimics+GREM，分別命名為mimics NC+vector組、miR-206 mimics+vector組和miR-206 mimics+GREM組。將轉(zhuǎn)染后的HNE1(或CNE2)細(xì)胞重懸于無(wú)血清培養(yǎng)基中，調(diào)整細(xì)胞懸液中細(xì)胞密度，以8×104個(gè)細(xì)胞/室密度加入上室，底部室加入含有10% FBS的培養(yǎng)基。在5% CO2加濕培養(yǎng)箱中37 ℃下培養(yǎng)24 h后，去除上室中細(xì)胞，4%甲醛固定遷移細(xì)胞30 min后使用5%結(jié)晶紫染色10 min，并在光鏡下計(jì)數(shù)。

1.2.11 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)miR-206的靶基因 采用靶基因預(yù)測(cè)網(wǎng)站CoGeMiR、MicroRNAdb預(yù)測(cè)miR-206可能結(jié)合的靶基因。

2 結(jié)果

2.1 miR-206在鼻咽癌組織和不同鼻咽癌細(xì)胞系中表達(dá)

使用ENCORI數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)miR-206在鼻咽癌組織中低表達(dá)(見(jiàn)圖1A)。采用qRT-PCR檢測(cè)miR-206在不同鼻咽癌細(xì)胞株中的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，與NP69細(xì)胞相比，鼻咽癌細(xì)胞株CNE2、HNE1、6-10B及5-8F細(xì)胞中miR-206的表達(dá)水平均較低(P<0.05)，細(xì)胞株CNE2、HNE1及6-10B中miR-206的表達(dá)差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見(jiàn)圖1)，因此本研究選擇其中兩株細(xì)胞CNE2和HNE1進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

A. ENCORI數(shù)據(jù)庫(kù)分析miR-206在鼻咽癌組織中表達(dá)與NP69細(xì)胞比較，*P<0.05B. 鼻咽癌細(xì)胞株中miR-206的表達(dá)水平圖1 miR-206在鼻咽癌組織和細(xì)胞中表達(dá)Figure 1 Expression of miR-206 in nasopharyngeal carcinoma tissues and cells

2.2 驗(yàn)證miR-206 mimics轉(zhuǎn)染效率

在HNE1、CNE2細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-206 mimics并驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-206 mimics后，HNE1、CNE2細(xì)胞中miR-206的表達(dá)水平顯著上調(diào)(P<0.05，見(jiàn)圖2)。

與NC組相比，*P<0.05圖2 轉(zhuǎn)染miR-206 mimics后miR-206的表達(dá)Figure 2 Expression of miR-206 after transfection with miR-206 mimics

2.3 轉(zhuǎn)染miR-206 mimics對(duì)鼻咽癌細(xì)胞增殖的影響

在HNE1、CNE2細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-206 mimics 24，48，72 h后，與NC組相比，miR-206 mimics組的鼻咽癌細(xì)胞增殖能力顯著降低(P<0.05，見(jiàn)圖3)。細(xì)胞集落克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在HNE1及CNE2細(xì)胞中，miR-206 mimics組與NC組相比，形成的克隆細(xì)胞集落明顯減少(P<0.05，見(jiàn)圖4)。

與NC組相比，*P<0.05圖3 轉(zhuǎn)染miR-206 mimics對(duì)鼻咽癌細(xì)胞增殖的影響Figure 3 Effects of transfection with miR-206 mimics on proliferation of nasopharyngeal carcinoma cells

與NC組相比，*P<0.05圖4 過(guò)表達(dá)miR-206 mimics對(duì)鼻咽癌細(xì)胞克隆能力的影響Figure 4 Effects of miR-206 mimics on the clonality of nasopharyngeal carcinoma cells

2.4 轉(zhuǎn)染miR-206 mimics后對(duì)鼻咽癌細(xì)胞遷移的影響

在HNE1細(xì)胞中，miR-206 mimics組與NC組相比，細(xì)胞劃痕愈合能力減弱(P<0.05)。同樣，在CNE2細(xì)胞中，miR-206 mimics組與NC組相比，細(xì)胞愈合能力也表現(xiàn)減弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)圖5)。

與NC組相比，*P<0.05圖5 轉(zhuǎn)染miR-206 mimics后鼻咽癌細(xì)胞遷移能力受到抑制 (×100)Figure 5 Migration ability of nasopharyngeal carcinoma cells after transfection of miR-206 mimics (×100)

2.5 轉(zhuǎn)染miR-206 mimics對(duì)GREM1及N-catenin、Vimentin蛋白表達(dá)的影響

采用蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-206 mimics能顯著下調(diào)GREM1、N-catenin及Vimentin蛋白的表達(dá)水平(P<0.05，見(jiàn)圖6)。

圖6 轉(zhuǎn)染miR-206mimics對(duì)鼻咽癌細(xì)胞中GREM1及EMT相關(guān)蛋白的影響Figure 6 Expression of GREM1 and EMT-related proteins in nasopharyngeal carcinoma cells after transfection of miR-206 mimics

2.6 miR-206靶向調(diào)控GREM1的表達(dá)

使用公共數(shù)據(jù)庫(kù)GEPIA分析得出，GREM1的mRNA在519個(gè)鼻咽癌組織中的表達(dá)水平顯著高于其在44個(gè)癌旁組織中表達(dá)(P<0.05，見(jiàn)圖7)。并且，在HNE1、CNE2細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-206 mimics后，GREM1的mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.05，見(jiàn)圖8)。CoGeMiR、MicroRNAdb生物信息學(xué)網(wǎng)站預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，miR-206與GREM1 mRNA存在結(jié)合位點(diǎn)，兩者之間可能互補(bǔ)結(jié)合(見(jiàn)圖9)。以上結(jié)果表明，在鼻咽癌細(xì)胞HNE1和CNE2中，miR-206可能對(duì)GREM1具有一定的調(diào)控作用。

圖7 使用公共數(shù)據(jù)庫(kù)GEPIA分析GREM1 mRNA的表達(dá)Figure 7 Analysis of GREM1 mRNA expression using the public database GEPIA

2.7 miR-206靶向GREM1影響鼻咽癌細(xì)胞遷移能力

Transwell Boyden小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-206 mimics+GREM1組的細(xì)胞遷移數(shù)量高于miR-206mimics+vector組。在CNE2細(xì)胞中進(jìn)行相同實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，miR-206 mimics+GREM1組的細(xì)胞遷移數(shù)量同樣高于miR-206 mimics+vector組(P<0.05，見(jiàn)圖10)。

與NC組相比，*P<0.05圖8 轉(zhuǎn)染miR-206 mimics后GREM1 mRNA的表達(dá)Figure 8 Expression of GREM1 mRNA after transfection of miR-206 mimics

圖9 GREM1和miR-206之間的互補(bǔ)結(jié)合區(qū)域Figure 9 The complementary binding region between GREM1 and miR-206

與mimic NC+vector比較，*P<0.05;與miR-206 mimics+vector比較，#P<0.05圖10 miR-206靶向GREM1對(duì)鼻咽癌細(xì)胞遷移能力的影響Figure 10 Effect of miR-206 targeting GREM1 on the migration ability of nasopharyngeal carcinoma cells

3 討論

腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞之間的miRNA表達(dá)存在差異，miRNA的功能障礙可能導(dǎo)致多種人類(lèi)疾病，如癌癥、免疫功能障礙和代謝紊亂等，在其細(xì)胞分化、增殖、遷移和凋亡中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用[14]。迄今為止，多項(xiàng)研究已經(jīng)觀察到miRNA在鼻咽癌細(xì)胞增殖與轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要調(diào)控作用。如miR-18a過(guò)表達(dá)可以增強(qiáng)鼻咽癌細(xì)胞的放療敏感性，其機(jī)制與其抑制ATM表達(dá)，去除G1/S和G2/M期阻滯，誘導(dǎo)細(xì)胞自噬和凋亡有關(guān)[15]；miR-135b-5p靶向SIRT1抑制c-JUN去乙?；?，增加MMP7表達(dá)，實(shí)現(xiàn)促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞遷移和侵襲[16]。

本研究發(fā)現(xiàn)，與正常組織和細(xì)胞相比，NPC細(xì)胞系中miR-206的表達(dá)水平降低，表明miR-206在鼻咽癌中可能發(fā)揮抑癌作用。一個(gè)miRNA可以調(diào)控人類(lèi)基因組中的多個(gè)基因[17]。以前的研究已經(jīng)確定了miR-206的幾個(gè)靶點(diǎn)，如在增殖性血管瘤中下調(diào)miR-206的表達(dá)可靶向調(diào)節(jié)DNMT3A的表達(dá)，抑制腫瘤的惡性進(jìn)展；在鼻咽癌組織和細(xì)胞中，G6PD被鑒定為miR-206的直接靶基因，miR-206通過(guò)直接靶向鼻咽癌細(xì)胞中G6PD mRNA的3′-UTR來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞的遷移、侵襲能力和上皮間充質(zhì)化[18,19]。本次研究中，我們基于生物信息學(xué)技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，與正常組織相比，鼻咽癌組織中miR-206低表達(dá)，GREM1高表達(dá)。通過(guò)上調(diào)miR-206的表達(dá)可以顯著降低GREM1的表達(dá)水平。因此我們推測(cè)，GREM1可能是miR-206的潛在下游靶點(diǎn)。

GREM1已被證實(shí)在大腸癌、乳腺癌、膠質(zhì)瘤等多種癌癥中扮演重要角色，與腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力密切相關(guān)[20-22]。本次研究發(fā)現(xiàn)，GREM1可與miR-206共同作用于鼻咽癌細(xì)胞的增殖、遷移及上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化。EMT是一種動(dòng)態(tài)且可逆的細(xì)胞過(guò)程，其特征在于細(xì)胞極性和細(xì)胞內(nèi)連接的喪失以及間充質(zhì)特征的獲得，這有助于腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移[23,24]。本次研究中，上調(diào)GREM1的表達(dá)后，鼻咽癌HNE1和CNE2細(xì)胞的遷移能力顯著增強(qiáng)。而上調(diào)miR-206表達(dá)可以下調(diào)細(xì)胞中上皮標(biāo)志物N-鈣黏蛋白N-catenin和間充質(zhì)標(biāo)志物波形蛋白Vimentin的表達(dá)，并能顯著抑制細(xì)胞的遷移能力。miR-206表達(dá)的上調(diào)能抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖、遷移，并在一定程度上逆轉(zhuǎn)鼻咽癌細(xì)胞的EMT。

綜上所述，上調(diào)miR-206的表達(dá)水平可以負(fù)調(diào)控GREM1的表達(dá)從而實(shí)現(xiàn)抑制NPC細(xì)胞的增殖、遷移及EMT進(jìn)程。miR-206和GREM1可能是未來(lái)臨床診治鼻咽癌的一個(gè)潛在的靶點(diǎn)。