胰腺癌中MKK7/JNKs/c-Jun通路通過(guò)促進(jìn)施萬(wàn)細(xì)胞去分化促進(jìn)神經(jīng)浸潤(rùn)

李軍輝，張無(wú)奈，張 焱，袁慶功，王繼欣，楊文彬

(西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院普外科，西安 710004；*通訊作者,E-mail:wenbinsurgery@126.com)

胰腺癌是一種常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，主要來(lái)源于胰腺導(dǎo)管上皮。近年來(lái)，各種腫瘤的發(fā)病率均呈下降趨勢(shì)，而胰腺癌的發(fā)病率仍呈緩慢上升趨勢(shì)[1]。神經(jīng)浸潤(rùn)(perineural invasion，PNI)是指癌細(xì)胞圍繞和/或侵入浸潤(rùn)腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment，TME)的神經(jīng)，在胰腺癌中神經(jīng)浸潤(rùn)的發(fā)生率為80%～100%，是胰腺癌常見(jiàn)的不良組織學(xué)特征，與癌癥侵襲性增加相關(guān)，是手術(shù)切除后癌癥復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的主要途徑之一[2]。胰腺癌具有獨(dú)特的神經(jīng)微環(huán)境，其中可見(jiàn)神經(jīng)肥大和神經(jīng)密度增加，與促進(jìn)細(xì)胞侵襲相關(guān)。此外，胰腺癌腫瘤微環(huán)境中具有復(fù)雜的細(xì)胞類(lèi)型與信號(hào)交互，可增強(qiáng)胰腺癌的神經(jīng)浸潤(rùn)、胰腺神經(jīng)重塑和疾病進(jìn)展，包括神經(jīng)與腫瘤細(xì)胞之間的信號(hào)通路，成纖維細(xì)胞與腫瘤的交互，免疫細(xì)胞與腫瘤的交互以及腫瘤微環(huán)境中的多種基質(zhì)成分等[3]。

施萬(wàn)細(xì)胞(Schwann cells，SCs)廣泛分布在胰腺癌腫瘤微環(huán)境中，是胰腺癌患者生存不良的獨(dú)立預(yù)后因素[4]。在鼠類(lèi)和人胰腺上皮內(nèi)瘤變組織周?chē)蓹z測(cè)到施萬(wàn)細(xì)胞，這表明在胰腺癌進(jìn)展的早期階段，施萬(wàn)細(xì)胞就參與胰腺癌的發(fā)生與進(jìn)展：在胰腺癌發(fā)生的早期，就存在施萬(wàn)細(xì)胞向胰腺癌細(xì)胞的定向遷移，并且施萬(wàn)細(xì)胞的存在與神經(jīng)入侵的頻率顯著相關(guān)[5]。當(dāng)外周神經(jīng)受損時(shí)，施萬(wàn)細(xì)胞快速進(jìn)入去分化狀態(tài)，去分化施萬(wàn)細(xì)胞高表達(dá)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)，清除髓鞘周?chē)槠M織并修復(fù)神經(jīng)軸索，從而成為損傷反應(yīng)的修復(fù)中心。去分化施萬(wàn)細(xì)胞可募集炎性細(xì)胞以協(xié)助髓鞘清除，分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子以支持神經(jīng)元存活和軸突再生，使再生的軸突重新髓鞘化，最終導(dǎo)致神經(jīng)修復(fù)[6]。

施萬(wàn)細(xì)胞的去分化表現(xiàn)為活化蛋白1(activator protein-1，AP-1)的上調(diào)和髓鞘形成關(guān)鍵因子Krox-20的下調(diào)，兩者的表達(dá)受不同信號(hào)通路控制，單純的Krox-20表達(dá)下降并不足以引起施萬(wàn)細(xì)胞去分化，但AP-1的上游分子c-Jun表達(dá)增加可介導(dǎo)施萬(wàn)細(xì)胞發(fā)生去分化，提示c-Jun是施萬(wàn)細(xì)胞去分化的核心因素[7]。近期研究表明，在組織發(fā)育和疾病發(fā)生過(guò)程中，c-Jun可聯(lián)通、擴(kuò)增和整合不同信號(hào)通路，如EGFR-ERK、EGFR-RhoA-ROCK和MAP3K1-JNK等，而c-Jun增加引起的施萬(wàn)細(xì)胞去分化是c-Jun N-terminal Kinase(JNK)依賴性的[7,8]。JNK的活性發(fā)揮由信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)實(shí)現(xiàn)，主要由絲裂原活化蛋白激酶4(MKK4)和絲裂原活化蛋白激酶7(MKK7)介導(dǎo)，其中MKK7主要活化JNK，而MKK4可同時(shí)活化JNKs和p38MAPKs。MKK屬于絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)家族成員，是一種Ser/Thr蛋白激酶，可在多種不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中充當(dāng)一種共同的信號(hào)成分，在基因表達(dá)調(diào)控和細(xì)胞質(zhì)功能活動(dòng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[8-11]。

前期研究發(fā)現(xiàn)，施萬(wàn)細(xì)胞在體外可使胰腺癌細(xì)胞侵襲能力增加[12]，在此基礎(chǔ)上，本研究通過(guò)觀察胰腺癌組織中MKK7、c-Jun的表達(dá)情況及癌細(xì)胞、神經(jīng)節(jié)中MKK7對(duì)遷移能力的影響，探討在胰腺癌神經(jīng)微環(huán)境中，MKK7/JNKs/c-Jun通路對(duì)癌細(xì)胞和神經(jīng)纖維遷移的作用及對(duì)神經(jīng)浸潤(rùn)的影響，為胰腺癌神經(jīng)浸潤(rùn)的研究提供新的理論支持。

1 材料與方法

1.1 胰腺癌組織、細(xì)胞培養(yǎng)和試劑

收集西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院2020年1—12月收治的胰腺癌患者，選擇根治性手術(shù)并且病理確診為導(dǎo)管腺癌的患者22例，選擇同一患者癌組織和癌旁組織，收集石蠟切片進(jìn)行研究。本研究經(jīng)西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院研究倫理委員會(huì)審查和批準(zhǔn)。人胰腺癌細(xì)胞系PANC-1和BxPC-3購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)(中國(guó)上海)，大鼠施萬(wàn)細(xì)胞RSC96(SCs)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)(中國(guó)上海)。細(xì)胞在37 ℃恒溫且含5% CO2條件下使用含有10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素(Gibco，美國(guó))的DMEM(Gibco，USA)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

試劑：anti-GFAP(Cell Signaling Technology,3670T，美國(guó)),anti-MKK7(Sigma,MABS1202，美國(guó)),anti-GAPDH(Proteintech,60004-1-Ig，美國(guó)),anti-c-Jun(Sigma,SAB4501604，美國(guó))，anti-JNK2(Sigma,05-986，美國(guó)),二抗(Abcam，ab6721，ab6728，英國(guó))。

1.2 免疫組化檢測(cè)GFAP及MKK7在施萬(wàn)細(xì)胞中的表達(dá)

收集我院胰腺癌患者癌組織及癌旁組織標(biāo)本22例，通過(guò)HE染色檢測(cè)神經(jīng)浸潤(rùn)情況，通過(guò)免疫組化檢測(cè)施萬(wàn)細(xì)胞去分化標(biāo)記物GFAP表達(dá)。經(jīng)二甲苯Ⅰ、Ⅱ脫蠟各10 min。100%，100%，90%，80%，70%酒精各5 min。切片進(jìn)行HE染色，蘇木精染色5 min，流水沖洗。5%乙酸分化1 min，流水沖洗，用吸管滴加乙酸，布滿玻片上的組織即可，分化后顏色變淺，呈藍(lán)色。伊紅染色1 min，流水沖洗。70%，80%，90%，100%酒精各10 s，二甲苯1 min，晾干，滴上中性樹(shù)膠，封片。免疫組化步驟檢測(cè)癌組織和癌旁組織施萬(wàn)細(xì)胞MKK7以及去分化指標(biāo)GFAP的表達(dá)情況，切片中加入過(guò)氧化氫-甲醇15 min，降低內(nèi)源性過(guò)氧化物酶造成的非特異性背景染色，PBS清洗3次，每次5 min；將綿羊血清滴加在蓋玻片上，放入37 ℃烤箱孵育30 min；吸去血清，勿洗。分別加入一抗anti-GFAP(1 ∶500),anti-MKK7(1 ∶500)，于4 ℃過(guò)夜；PBS清洗3次，每次5 min；將即用型ABC液滴加在蓋玻片上，孵育30 min，PBS清洗3次，每次5 min；加入DAB顯色液作用10 min，PBS清洗3次，每次5 min；梯度酒精中脫水、二甲苯透明、中性樹(shù)脂封片。

1.3 DRG與癌細(xì)胞條件培養(yǎng)基的間接共培養(yǎng)以及與癌細(xì)胞的直接共培養(yǎng)

新生SD大鼠購(gòu)自西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，從新生大鼠中分離背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion，DRGs)，通過(guò)正常培養(yǎng)基(Con)、癌細(xì)胞條件培養(yǎng)基(CM)單獨(dú)培養(yǎng)DRG，觀察癌細(xì)胞對(duì)神經(jīng)纖維生長(zhǎng)的影響，通過(guò)癌細(xì)胞-DRG共培養(yǎng)觀察神經(jīng)對(duì)癌細(xì)胞生長(zhǎng)的趨化性。將DRG在冷PBS中洗滌，嵌入10 μl Matrigel(CORNING公司，美國(guó))于24孔板，DRGs在37 ℃恒溫且含5% CO2條件下使用含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。

DGR與癌細(xì)胞條件培養(yǎng)基的間接共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)：將DRG分別用空白培養(yǎng)基(Con)、正常癌細(xì)胞條件培養(yǎng)基(CM)或MKK7低表達(dá)癌細(xì)胞條件培養(yǎng)基(sh-CM)進(jìn)行培養(yǎng),分別培養(yǎng)0，24，48，72 h，顯微鏡下動(dòng)態(tài)觀察神經(jīng)纖維遷移距離并拍照。

DRG與癌細(xì)胞直接共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)：將DRG分別與正常癌細(xì)胞(Con)和MKK7低表達(dá)癌細(xì)胞(sh-MKK7)進(jìn)行共培養(yǎng)。在第1天，將50 μl PANC-1或BxPC-3細(xì)胞(細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)并調(diào)整至約2×106/ml)滴入24孔板中并正常培養(yǎng)以使細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。在第2天，將10 μl Matrigel(內(nèi)嵌DRG于Matrigel中)接種在癌細(xì)胞旁邊，使癌細(xì)胞邊緣與DRG邊緣距離為1 mm(在顯微鏡下通過(guò)透明刻度尺控制距離)。分別繼續(xù)培養(yǎng)0，24，48，72 h，在顯微鏡下動(dòng)態(tài)觀察神經(jīng)纖維的生長(zhǎng)距離和癌細(xì)胞向神經(jīng)節(jié)的遷移距離并拍照。應(yīng)用Image J軟件對(duì)DRG中神經(jīng)纖維遷移距離以及癌細(xì)胞向DRG的遷移距離進(jìn)行量化分析，觀察兩者之間的相互作用。

1.4 慢病毒shRNA敲低胰腺癌細(xì)胞株MKK7表達(dá)

使用包含有MKK7(GATCGACCTCAACCTGGATAT)的shRNA及嘌呤霉素抗性基因的重組逆轉(zhuǎn)錄慢病毒感染胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1和BxPC-3。用2 μg/ml嘌呤霉素(Beyotime Technology；ST551)培養(yǎng)細(xì)胞4周，并選擇抗嘌呤霉素的克隆繼續(xù)培養(yǎng)。通過(guò)Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MKK7表達(dá)，選擇MKK7下調(diào)最為明顯的2個(gè)單細(xì)胞克隆進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 蛋白質(zhì)印跡分析細(xì)胞中c-Jun,JNK2以及MKK7的表達(dá)

將胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1和BxPC-3分別接種在培養(yǎng)皿中，用含有蛋白酶抑制劑(1%抑制劑混合物和1 mmol/L PMSF)的RIPA緩沖液從培養(yǎng)細(xì)胞中提取細(xì)胞裂解物提取蛋白。用BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒(Beyotime Biotechnology)測(cè)量蛋白質(zhì)裂解物的濃度。通過(guò)SDS-PAGE分離等量的蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，并用特異性抗體進(jìn)行免疫印跡。4 ℃下與一抗(anti-c-Jun,1 ∶1 000;anti-JNK2,1 ∶1 000;anti-MKK7,1 ∶500;anti-GAPDH,1 ∶500)共孵育過(guò)夜后，將膜用二抗在37 ℃下印跡2 h。使用ECL蛋白質(zhì)印跡底物觀察結(jié)果并使用GeneBox化學(xué)發(fā)光儀(Syngene)進(jìn)行拍照。用Image J軟件(NIMH，美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院)測(cè)定膜的光密度定量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)胰腺癌細(xì)胞遷移能力變化

通過(guò)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MKK7對(duì)胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1和BxPC-3遷移能力影響。胰腺癌細(xì)胞在6孔板中生長(zhǎng)至匯合，然后使用無(wú)菌的200 μl移液管尖端人工損傷細(xì)胞單層。通過(guò)用PBS洗滌3次去除細(xì)胞碎片并拍照，記作0 h，繼續(xù)培養(yǎng)24 h和72 h，并在0，24，72 h時(shí)進(jìn)行顯微拍照，監(jiān)測(cè)細(xì)胞遷移能力。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有結(jié)果均表示為3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，不同組之間的統(tǒng)計(jì)比較通過(guò)Student’st檢驗(yàn)或one-way ANOVA進(jìn)行多重比較校正。對(duì)于所有統(tǒng)計(jì)分析，P<0.05被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。使用GraphPad Prism軟件7.0版(GraphPad Software)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果

2.1 胰腺癌組織及配對(duì)癌旁組織的免疫組化染色

為了探究構(gòu)成神經(jīng)髓鞘的施萬(wàn)細(xì)胞與胰腺癌神經(jīng)浸潤(rùn)的關(guān)系和可能機(jī)制，我們對(duì)發(fā)生神經(jīng)浸潤(rùn)的癌組織和配對(duì)的癌旁組織進(jìn)行HE染色，發(fā)現(xiàn)癌組織排列紊亂，可見(jiàn)神經(jīng)浸潤(rùn)，且神經(jīng)密度明顯高于癌旁組織(見(jiàn)圖1)。進(jìn)一步對(duì)癌組織中的神經(jīng)髓鞘施萬(wàn)細(xì)胞進(jìn)行免疫組化染色，發(fā)現(xiàn)癌組織中的施萬(wàn)細(xì)胞，其數(shù)量及去分化標(biāo)記物GFAP染色水平均明顯高于癌旁組織(見(jiàn)圖1)。進(jìn)一步的免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)，施萬(wàn)細(xì)胞MKK7表達(dá)定位于細(xì)胞核和細(xì)胞漿中，且癌組織中施萬(wàn)細(xì)胞MKK7表達(dá)量明顯高于癌旁組織(見(jiàn)圖1)。

圖1 胰腺癌組織及配對(duì)癌旁組織的免疫組化染色 (bar=100 μm)Figure 1 Immumohistochemical staining of pancreatic cancer tissue and paired adjacent tissue (bar=100 μm)

2.2 MKK7低表達(dá)胰腺癌細(xì)胞株構(gòu)建及JNK2、c-Jun表達(dá)檢測(cè)

為了探究胰腺癌中MKK7/JNK/c-Jun通路與施萬(wàn)細(xì)胞去分化以及神經(jīng)浸潤(rùn)的關(guān)系，我們采用shRNA技術(shù)構(gòu)建MKK7低表達(dá)胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1和BxPC-3，并利用嘌呤霉素抗性進(jìn)行單克隆篩選。篩選后的胰腺癌細(xì)胞株運(yùn)用Western blot檢測(cè)其MKK7及其下游通路活化程度，GAPDH作為內(nèi)參蛋白。

在PANC-1細(xì)胞株中，sh-MKK7 #1和sh-MKK7 #2細(xì)胞株中MKK7表達(dá)均下調(diào)，且sh-MKK7 #2單克隆細(xì)胞株中MKK7抑制效率更高，伴隨JNK2和c-Jun表達(dá)明顯下降(見(jiàn)圖2)，可以用于下一步實(shí)驗(yàn)。同樣方法構(gòu)建BxPC-3細(xì)胞MKK7低表達(dá)細(xì)胞株，BxPC-3細(xì)胞株中sh-MKK7 #1為下調(diào)效率較高的細(xì)胞株，JNK2和c-Jun表達(dá)也隨之下降(見(jiàn)圖2)，可以用于下一步實(shí)驗(yàn)。

圖2 Western blot檢測(cè)正常胰腺癌細(xì)胞與MKK7低表達(dá)胰腺癌細(xì)胞中c-Jun，JNK2和MKK7的表達(dá)Figure 2 Expression of c-Jun, JNK2 and MKK7 in normal pancreatic cancer cells and MKK7 low expression pancrea-tic cancer cells detected by Western blot assay

2.3 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MKK7對(duì)癌細(xì)胞遷移能力的影響

為了探究MKK7對(duì)癌細(xì)胞遷移能力的影響，我們采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)MMK7低表達(dá)胰腺癌細(xì)胞株與對(duì)照胰腺癌細(xì)胞株之間遷移能力的差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在PANC-1細(xì)胞株中，劃痕后24 h和72 h時(shí)，sh-MKK7組癌細(xì)胞劃痕間隙明顯大于對(duì)照組；在BxPC-3細(xì)胞中，劃痕后24 h和72 h時(shí)，sh-MKK7組癌細(xì)胞劃痕間隙明顯大于對(duì)照組(見(jiàn)圖3)。以上結(jié)果表明，MKK7可以增強(qiáng)胰腺癌細(xì)胞的遷移能力。

圖3 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MKK7對(duì)胰腺癌遷移能力的影響 (bar=200 μm)Figure 3 Influence of MKK7 on pancreatic cancer migration ability detected by wound healing assay (bar=200 μm)

2.4 胰腺癌MKK7對(duì)脊髓背根神經(jīng)節(jié)(DRG)神經(jīng)纖維生長(zhǎng)的影響

為了探究胰腺癌細(xì)胞MKK7通路對(duì)神經(jīng)浸潤(rùn)中神經(jīng)纖維的影響，我們首先采用胰腺癌-DRG間接共培養(yǎng)模型進(jìn)行研究。正常對(duì)照培養(yǎng)基(Con)、癌細(xì)胞條件培養(yǎng)基(CM)、MKK7低表達(dá)癌細(xì)胞條件培養(yǎng)基(sh-CM)被加入神經(jīng)節(jié)中進(jìn)行培養(yǎng)，觀察不同時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)軸索向外生長(zhǎng)的長(zhǎng)度。與正常對(duì)照培養(yǎng)基相比，PANC-1癌細(xì)胞條件培養(yǎng)基CM可明顯促使神經(jīng)軸索向外生長(zhǎng)，并增加神經(jīng)纖維密度；與正常對(duì)照培養(yǎng)基Con相比，MKK7低表達(dá)癌細(xì)胞培養(yǎng)基sh-CM同樣可促使神經(jīng)纖維生長(zhǎng)，但其促進(jìn)神經(jīng)纖維生長(zhǎng)的程度低于癌細(xì)胞條件培養(yǎng)基組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)圖4)。類(lèi)似地，與正常對(duì)照培養(yǎng)基相比，BxPC-3癌細(xì)胞條件培養(yǎng)基CM可明顯促使神經(jīng)軸索向外生長(zhǎng)，并增加神經(jīng)纖維密度；與正常對(duì)照培養(yǎng)基Con相比，MKK7低表達(dá)癌細(xì)胞培養(yǎng)基sh-CM同樣可促使神經(jīng)纖維生長(zhǎng)，但其促進(jìn)神經(jīng)纖維生長(zhǎng)的程度低于癌細(xì)胞條件培養(yǎng)基組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)圖4)。以上結(jié)果說(shuō)明，胰腺癌細(xì)胞可以通過(guò)旁分泌途徑促進(jìn)神經(jīng)節(jié)中神經(jīng)纖維的生長(zhǎng)，敲低MKK7可以抑制這一過(guò)程。

2.5 胰腺癌MKK7對(duì)癌細(xì)胞朝向神經(jīng)遷移能力的影響

為了進(jìn)一步探究MKK7對(duì)胰腺癌神經(jīng)浸潤(rùn)中癌細(xì)胞的影響，我們采用胰腺癌細(xì)胞與DRG直接共培養(yǎng)模型進(jìn)行研究。將正常胰腺癌細(xì)胞株(Con組)和MKK7低表達(dá)胰腺癌細(xì)胞株(sh-MKK7組)分別與DRG進(jìn)行直接共培養(yǎng)，并通過(guò)顯微照相記錄培養(yǎng)24，48，72 h后共培養(yǎng)模型中胰腺癌細(xì)胞向DRG的遷移距離。

與Con組比較，*P<0.05；與sh-CM組比較，#P<0.05圖4 神經(jīng)節(jié)與胰腺癌條件培養(yǎng)基共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MKK7對(duì)神經(jīng)纖維生長(zhǎng)的影響 (bar=200 μm)Figure 4 Influence of MKK7 on DRG nerve fiber growth detected by DRG and pancreatic cancer conditioned medium indirect co-culture assay (bar=200 μm)

在PANC-1與DRG直接共培養(yǎng)模型中，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，胰腺癌細(xì)胞朝向DRG遷移，且相比于Con組，sh-MKK7組癌細(xì)胞在24 h的遷移距離更短，在培養(yǎng)48 h和72 h時(shí)，與Con組相比，sh-MKK7組遷移距離更短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001 9，0.032 8，見(jiàn)圖5)。類(lèi)似地，在BxPC-3與DRG共培養(yǎng)模型中，相比于Con組，sh-MKK7組中癌細(xì)胞向DRG的遷移距離更短，在培養(yǎng)72 h時(shí)，與Con組相比，sh-MKK7組遷移距離更短(P=0.000 2，見(jiàn)圖5)。以上結(jié)果表明，在體外模型中，胰腺癌MKK7可以促進(jìn)胰腺癌神經(jīng)浸潤(rùn)，癌細(xì)胞向神經(jīng)的遷移能力。

3 討論

與Con組比較，*P<0.05圖5 神經(jīng)節(jié)與胰腺癌細(xì)胞直接共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MKK7對(duì)癌細(xì)胞朝向神經(jīng)遷移能力的影響 (bar=200 μm)Figure 5 Influence of MKK7 on the migration ability of cancer cells towards nerve detected by DRG and pancreatic cancer direct co-culture assay (bar=200 μm)

施萬(wàn)細(xì)胞(Schwann cell, SCs)廣泛分布在胰腺癌腫瘤微環(huán)境中，是胰腺癌患者生存不良的獨(dú)立預(yù)后因素[4]。SCs是外周神經(jīng)系統(tǒng)的主要神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，可通過(guò)直接接觸促進(jìn)癌癥的侵襲，誘導(dǎo)癌細(xì)胞向神經(jīng)遷移并以接觸依賴性方式促進(jìn)侵襲。接觸后，SCs在其方向上誘導(dǎo)癌細(xì)胞突起的形成并插入癌細(xì)胞之間，導(dǎo)致癌細(xì)胞擴(kuò)散，這些過(guò)程的形成取決于神經(jīng)細(xì)胞黏附分子1(neural cell adhesion molecule 1,NCAM1)在SCs表達(dá)，并最終促進(jìn)神經(jīng)浸潤(rùn)[13]。當(dāng)外周神經(jīng)受損時(shí)，施萬(wàn)細(xì)胞快速進(jìn)入去分化狀態(tài)，從而成為損傷反應(yīng)的修復(fù)中心。去分化施萬(wàn)細(xì)胞可募集炎性細(xì)胞以協(xié)助髓鞘清除，分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子以支持神經(jīng)元存活和軸突再生，使再生的軸突重新髓鞘化，最終導(dǎo)致神經(jīng)修復(fù)。當(dāng)周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)受損傷時(shí)，軸突可以以每天1～3 mm的速度再生，并重新對(duì)靶器官進(jìn)行神經(jīng)支配。研究表明，施萬(wàn)細(xì)胞在胰腺癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮“類(lèi)神經(jīng)修復(fù)樣作用”[6]。在腫瘤微環(huán)境中，施萬(wàn)細(xì)胞可被缺氧、腫瘤細(xì)胞和T細(xì)胞分泌的因子激活，發(fā)揮“類(lèi)神經(jīng)修復(fù)樣作用”[14]。本研究提示，在胰腺癌組織標(biāo)本中，施萬(wàn)細(xì)胞去分化在癌組織明顯高于癌旁組織。

c-Jun作為激活蛋白1(activator protein-1，AP-1)家族成員，是調(diào)節(jié)施萬(wàn)細(xì)胞去分化和獲得修復(fù)施萬(wàn)細(xì)胞功能的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)c-Jun的水平可能在外周神經(jīng)系統(tǒng)的許多病理學(xué)狀況中具有治療應(yīng)用[15]。而c-Jun增加引起的施萬(wàn)細(xì)胞去分化是JNK(c-Jun NH2-terminal protein kinase)依賴性的[7]。JNK的活性發(fā)揮是通過(guò)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)實(shí)現(xiàn)的，主要是MKK4和MKK7，MKK7主要活化JNK，而MKK4可同時(shí)活化JNKs和p38MAPKs。MKK屬于MAPK(mitogen-activated protein kinases, MAP激酶，MAPK)家族成員，是一種Ser/Thr蛋白激酶，可在多種不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中充當(dāng)一種共同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)成分，在基因表達(dá)調(diào)控和細(xì)胞質(zhì)功能活動(dòng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[9,10]。本研究提示，胰腺癌中施萬(wàn)細(xì)胞的去分化狀態(tài)與MKK7的表達(dá)情況密切相關(guān)，并且與DRG中神經(jīng)纖維生長(zhǎng)以及神經(jīng)浸潤(rùn)密切相關(guān)，提示其可能的調(diào)控作用。

MKK7是調(diào)節(jié)JNK級(jí)聯(lián)活性最重要的MAP2K，對(duì)多種細(xì)胞內(nèi)功能的重要性，如細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、衰老、分化、轉(zhuǎn)化、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)和腫瘤代謝。細(xì)胞和小鼠中MKK7功能的喪失破壞了維持有機(jī)穩(wěn)態(tài)所需的許多關(guān)鍵過(guò)程，如細(xì)胞凋亡、細(xì)胞形成和發(fā)育以及腫瘤發(fā)生[16]。

綜上所述，胰腺癌細(xì)胞可通過(guò)MKK7/JNKs/c-Jun通路促進(jìn)施萬(wàn)細(xì)胞去分化，并促進(jìn)癌細(xì)胞和神經(jīng)纖維的遷移，參與胰腺癌神經(jīng)浸潤(rùn)的發(fā)生發(fā)展，針對(duì)MKK7的靶向治療，有望為胰腺癌神經(jīng)浸潤(rùn)的靶向治療研究提供新的理論及實(shí)驗(yàn)支持。