胃癌中LINC00659的表達(dá)及其通過(guò)調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)通路影響胃癌細(xì)胞增殖

陶月佳，趙 媛，李 冰，徐遠(yuǎn)義，黃允寧

胃癌是人類(lèi)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一[1]，發(fā)病率位居惡性腫瘤第6位，病死率居第3位[2]。目前，超過(guò)60%的胃癌發(fā)生在東亞地區(qū)，并且隨著人口老齡化日益加重，胃癌的發(fā)病率和病死率仍在增加[3]。最近研究顯示，長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNAs, lncRNAs)在生物生長(zhǎng)、發(fā)育、衰老及死亡過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用[4]，是表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[5]。此外，一些lncRNA還是腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因子[6]。LINC00659是一種致癌lncRNA，目前對(duì)其研究并不廣泛。文獻(xiàn)報(bào)道LINC00659在結(jié)腸癌中的表達(dá)水平顯著升高，其高表達(dá)與結(jié)腸癌患者預(yù)后不良相關(guān)[7]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)LINC00659在胃癌組織和人胃癌細(xì)胞株中的表達(dá)，并探討其通過(guò)調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)通路對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響，旨在為胃癌的臨床治療提供潛在的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2020年1～11月寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院手術(shù)切除的29例胃癌組織及距癌灶切緣2～5 cm處的正常胃組織。所有患者術(shù)前均未行放、化療或免疫治療。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均知情同意。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與慢病毒感染 采用RPMI-1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清，雙抗?jié)舛葹榍嗝顾?00 U/mL、鏈霉素100 ng/mL)，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至融合度達(dá)80%～90%時(shí)，胰蛋白酶消化，常規(guī)傳代培養(yǎng)。選對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的胃癌細(xì)胞株AGS，用無(wú)血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基制備成(3～5)×105/mL的細(xì)胞懸液，接種于96孔板，保持細(xì)胞狀態(tài)良好(形態(tài)清晰、生長(zhǎng)正常、無(wú)污染)，平行感染2～3個(gè)復(fù)孔，以減小誤差。使用不含抗生素的完全培養(yǎng)基將慢病毒滴度稀釋為1×106TU/mL、1×107TU/mL、1×108TU/mL各50 μL。去除培養(yǎng)基，依次向各孔中加入不同滴度慢病毒、感染增強(qiáng)液和完全培養(yǎng)基，輕輕“8字”搖勻后放入培養(yǎng)箱。培養(yǎng)12～16 h后去除含有病毒的培養(yǎng)基，加入100 μL新鮮的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，于熒光顯微鏡下初步觀察感染效率。選擇感染效率約80%、使用慢病毒最少、細(xì)胞生長(zhǎng)良好和病毒感染復(fù)數(shù)(MOI)作為后續(xù)感染的依據(jù)，計(jì)算公式：病毒體積=(MOI×細(xì)胞數(shù)目)/病毒滴度。

人正常胃上皮細(xì)胞GES-1和人胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS、HGC-27均購(gòu)自上海中科院細(xì)胞庫(kù)。敲減組(轉(zhuǎn)染LINC00659 siRNAs)和空載組(轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照)，過(guò)表達(dá)組(轉(zhuǎn)染lv-LINC00659)和空載組(轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照)由吉?jiǎng)P基因公司(中國(guó)上海)合成。序列詳見(jiàn)表1。

表1 siRNAs及其序列

1.2.2Western blot法 當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至融合度達(dá)80%～90%時(shí)收集細(xì)胞，加RIPA裂解液在冰上裂解，反復(fù)渦旋5次后，4 ℃離心10 min，吸取上清液，并采用BCA蛋白定量法準(zhǔn)確測(cè)量蛋白濃度。加入蛋白上樣緩沖液(Lodding buffer)，100 ℃加熱10 min，取40 μg蛋白進(jìn)行10%SDS-PAGE凝膠電泳。電泳分離蛋白樣品后，轉(zhuǎn)膜至0.45 μm的PVDF膜上，用TBST稀釋?zhuān)?0%脫脂牛奶室溫下封閉1.5 h，以減少非特異性抗原決定簇的結(jié)合。封閉后加入一抗Ki-67、PCNA、PI3K、p-AKT(Ki-67和PCNA，中國(guó)武漢Proteintech公司；PI3K，ab278545，英國(guó)Abcam公司；p-AKT，Ser473，美國(guó)Cell Signaling Technology公司)，4 ℃過(guò)夜。二抗室溫孵育2 h，TBST洗3次，每次10 min。滴加顯影液于顯影儀中曝光。獲得條帶后采用Image J軟件系統(tǒng)分析灰度值。以β-tubulin和GAPDH作為內(nèi)參照物，目的蛋白/β-tubulin或GAPDH灰度值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2.3qRT-PCR 組織和細(xì)胞總RNA提取使用Trizol(Thermo Fisher Scientific)試劑，按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行總RNA提取，檢測(cè)RNA濃度和純度后，使用PrimeScript試劑(日本Takara公司，RR036A)反轉(zhuǎn)錄成cDNA(反應(yīng)條件為42 ℃ 1 h，72 ℃ 10 min)。以100 ng cDNA為模板，按熒光定量試劑盒SYBR Green Master Mix(日本Takara公司，RR820A)說(shuō)明書(shū)配制定量PCR反應(yīng)體系，操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。在熒光定量PCR儀上設(shè)置反應(yīng)條件，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行定量分析。以GAPDH為內(nèi)參，采用相對(duì)定量方法RQ=2-ΔΔCt計(jì)算LINC00659相對(duì)表達(dá)量。所有引物均由上海生工生物公司合成。LINC00659引物序列：正向5′-ACCCCTGAAGGAC CATATCCA-3′，反向5′-GGCTCGGCTGTGTCTCAAG-3′；內(nèi)參GAPDH引物序列：正向5′-CGACCACTTT GTCAAGCTCA-3′，反向5′-CCCTGTTGCTGTAGC CAAAT-3′。

1.2.4細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的AGS細(xì)胞接種于96孔板中培養(yǎng)，每次接種4個(gè)96孔板，調(diào)整細(xì)胞密度為(2～5)×105/mL，每孔加入100 μL細(xì)胞懸液，將細(xì)胞置于37 ℃、5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)24 h，至細(xì)胞貼壁。在不同時(shí)間點(diǎn)(24、48、72、96 h)，按照每孔100 μL[90 μL新鮮培養(yǎng)基+10 μL CCK-8試劑(美國(guó)APExBIO公司)]加入96孔板中，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h，用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)細(xì)胞450 nm處的吸光度(OD)值，繪制增殖曲線(xiàn)。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2.5克隆形成實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成單個(gè)懸浮細(xì)胞，接種到6孔板中(1 000個(gè)/孔)，輕輕搖勻，使細(xì)胞分散均勻。置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10～15天；當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的克隆時(shí)，終止培養(yǎng)。棄上清，用PBS小心浸洗3次；4%多聚甲醛固定30 min；棄固定液后PBS洗滌3次，加1 mL 0.1%結(jié)晶紫染色20 min，清水輕輕沖去結(jié)晶紫染液，PBS洗滌3次，空氣干燥，晾干。細(xì)胞克隆用相機(jī)拍照，并將平皿倒置記錄細(xì)胞克隆數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)使用SPSS 23.0軟件和GraphPad prism 8.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和制圖。兩組間比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌組織及人胃癌細(xì)胞株中LINC00659的表達(dá)通過(guò)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析LINC00659在胃癌組織與癌旁組織中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示LINC00659在胃癌組織中高表達(dá)(P<0.05，圖1A)。qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示：與癌旁正常組織相比，LINC00659在29例胃癌組織中表達(dá)上調(diào)(P<0.01，圖1B)。此外，與人正常胃上皮細(xì)胞GES-1相比，人胃癌細(xì)胞AGS和HGC-27中LINC00659高表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖1C)。

圖1 胃癌組織和胃癌細(xì)胞系中LINC00659的表達(dá)：A.TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析LINC00659在胃癌組織與癌旁正常組織中相對(duì)表達(dá)水平，*P<0.05；B.qRT-PCR檢測(cè)29例胃癌組織及癌旁正常組織中LINC00659相對(duì)表達(dá)水平；C. qRT-PCR檢測(cè)人正常胃上皮細(xì)胞GES-1、胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS和HGC-27中LINC00659的相對(duì)表達(dá)水平：與GES-1相比，**P<0.01

2.2 慢病毒轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞效率鑒定為明確LINC00659在胃癌中的生物學(xué)功能，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了差異表達(dá)LINC00659的慢病毒載體，并感染人胃癌細(xì)胞AGS和HGC-27，48 h后在熒光倒置顯微鏡下初步觀察轉(zhuǎn)染效率，通過(guò)qRT-PCR法檢測(cè)敲低或過(guò)表達(dá)LINC00659的轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果顯示，敲減組AGS細(xì)胞中LINC00659表達(dá)水平明顯低于空載組，而過(guò)表達(dá)組HGC-27細(xì)胞中LINC00659表達(dá)水平明顯上調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖2)。這表明慢病毒感染敲減LINC00659表達(dá)的AGS細(xì)胞模型和過(guò)表達(dá)LINC00659的HGC-27細(xì)胞模型構(gòu)建成功。

圖2 驗(yàn)證慢病毒轉(zhuǎn)染效率：A.慢病毒轉(zhuǎn)染構(gòu)建敲減LINC00659的AGS細(xì)胞模型；B.慢病毒構(gòu)建過(guò)表達(dá)LINC00659的HGC-27細(xì)胞模型

2.3 LINC00659對(duì)胃癌細(xì)胞增殖活力的影響通過(guò)CCK-8法對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)(24、48、72和96 h)AGS和HGC-27細(xì)胞增殖活力進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示，與空載組相比，敲減LINC00659組AGS細(xì)胞的增殖活力明顯降低(P<0.01，圖3A)，而過(guò)表達(dá)LINC00659組HGC-27細(xì)胞的增殖活力明顯增高(P<0.05，P<0.01，圖3B)。

圖3 CCK-8法檢測(cè)胃癌細(xì)胞的增殖活力：A.CCK-8法檢測(cè)敲減LINC00659組AGS的增殖活力；B.CCK-8法檢測(cè)過(guò)表達(dá)LINC00659組HGC-27的增殖活力；與空載組相比，*P<0.05，**P<0.01

2.4 LINC00659對(duì)胃癌細(xì)胞集落形成能力的影響為進(jìn)一步研究LINC00659對(duì)胃癌細(xì)胞增殖能力的影響，通過(guò)克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)胃癌細(xì)胞集落形成能力。結(jié)果顯示，與空載組相比，敲減LINC00659組AGS細(xì)胞集落形成能力顯著降低(P<0.01，圖4A)；過(guò)表達(dá)LINC00659可顯著促進(jìn)HGC-27的集落形成能力(P<0.01，圖4B)。

圖4 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)胃癌細(xì)胞集落形成能力：A.敲減LINC00659后AGS細(xì)胞集落形成能力；B.過(guò)表達(dá)LINC00659后HGC-27細(xì)胞集落形成能力

2.5 LINC00659對(duì)PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)Western blot法檢測(cè)胃癌細(xì)胞敲減或過(guò)表達(dá)LINC00659后胃癌細(xì)胞中PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，與空載組相比，敲減LINC00659組AGS細(xì)胞中PI3K和p-AKT蛋白表達(dá)顯著降低，增殖相關(guān)標(biāo)志物Ki-67和PCNA蛋白表達(dá)水平亦降低(圖5A、B)；相反，在胃癌HGC-27細(xì)胞中過(guò)表達(dá)LINC00659則逆轉(zhuǎn)了這一效應(yīng)(圖5C、D)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：LINC00659可能是通過(guò)調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)通路磷酸化水平影響胃癌細(xì)胞增殖。

圖5 Western blot法檢測(cè)敲減或過(guò)表達(dá)LINC00659后PI3K、p-AKT及增殖相關(guān)標(biāo)志物Ki-67和PCNA的表達(dá)：A.敲減LINC00659組AGS細(xì)胞中PI3K和p-AKT的表達(dá)；B.敲減LINC00659組AGS細(xì)胞中Ki-67和PCNA的表達(dá)；C.過(guò)表達(dá)LINC00659組HGC-27細(xì)胞中PI3K和p-AKT的表達(dá)；D.過(guò)表達(dá)LINC00659組HGC-27細(xì)胞中Ki-67和PCNA的表達(dá)

3 討論

胃癌是人類(lèi)侵襲性和致死性較高的惡性腫瘤之一[8-9]。該病發(fā)病率高，早期診斷率低且預(yù)后差，嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康[10]。因此，尋找可靠的胃癌生物標(biāo)志物對(duì)胃癌患者的診治和預(yù)后尤為重要。lncRNA作為癌癥早期篩查、預(yù)后評(píng)估以及對(duì)藥物治療反應(yīng)的生物標(biāo)志物引起廣泛關(guān)注[11-13]。如LINC00858在胃癌組織和人胃癌細(xì)胞中的表達(dá)明顯上調(diào)，并與患者預(yù)后不良有關(guān)[14]；lncRNA ROR可促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)，此外lncRNA ROR高表達(dá)可促進(jìn)胃癌細(xì)胞MRP1的表達(dá)和多藥耐藥，并與胃癌患者預(yù)后不良相關(guān)[15]。

LINC00659是一種新發(fā)現(xiàn)的lncRNA，其在腫瘤特別是胃癌中的作用機(jī)制尚不清楚。Zhou等[16]研究發(fā)現(xiàn)，癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞衍生的外泌體可將LINC00659轉(zhuǎn)運(yùn)至結(jié)腸癌細(xì)胞中，從而促進(jìn)結(jié)腸癌的進(jìn)展。Li等[17]研究證實(shí)，貝母素乙通過(guò)下調(diào)LINC00659表達(dá)上調(diào)miR-760，從而抑制結(jié)直腸癌的進(jìn)展，提示LINC00659與腫瘤的進(jìn)展相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)LINC00659在胃癌組織中高表達(dá)；通過(guò)qRT-PCR證實(shí)LINC00659在胃癌組織及人胃癌細(xì)胞株中高表達(dá)，提示LINC00659在胃癌發(fā)生、發(fā)展中可能扮演著癌基因作用。Tsai等[7]在結(jié)腸癌中的研究表明，LINC00659可促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和遷移。為探討LINC00659在胃癌中的可能作用機(jī)制，本組構(gòu)建了敲減或過(guò)表達(dá)LINC00659人胃癌細(xì)胞模型，CCK-8法及克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與空載組相比，敲減組細(xì)胞增殖和集落形成能力均被抑制，而過(guò)表達(dá)LINC00659則促進(jìn)細(xì)胞增殖和集落形成能力，與文獻(xiàn)研究結(jié)果一致。

細(xì)胞增殖是腫瘤發(fā)展的關(guān)鍵影響因素，此過(guò)程中會(huì)涉及多種信號(hào)通路，彼此交叉，形成網(wǎng)絡(luò)樣聯(lián)系[18]。近年來(lái)研究較多的有關(guān)增殖的信號(hào)通路包括：MAPK通路[19]、PI3K/AKT信號(hào)通路[20-21]、Wnt/β-catenin信號(hào)通路[22]等。其中PI3K/AKT信號(hào)通路是癌癥中重要的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)之一，該信號(hào)通路參與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[23-24]。文獻(xiàn)報(bào)道PI3K/AKT信號(hào)通路與胃癌關(guān)系密切，對(duì)細(xì)胞增殖、血管生成和存活等生理病理?xiàng)l件具有重要意義[25-26]。本研究發(fā)現(xiàn)LINC00659潛在的作用機(jī)制之一是促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖。為進(jìn)一步探討LINC00659是否通過(guò)調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)通路影響胃癌細(xì)胞的增殖，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)Western blot法檢測(cè)PI3K/AKT信號(hào)通路中PI3K、p-AKT蛋白以及增殖相關(guān)標(biāo)志物Ki-67和PCNA的表達(dá)水平，結(jié)果顯示敲減LINC00659可顯著降低PI3K、p-AKT蛋白以及增殖相關(guān)標(biāo)志物Ki-67和PCNA的表達(dá)。這一結(jié)果表明，LINC00659可能通過(guò)調(diào)控胃癌細(xì)胞中PI3K/AKT信號(hào)通路影響胃癌細(xì)胞增殖。

綜上，LINC00659在胃癌組織和胃癌細(xì)胞中高表達(dá)，其可以增強(qiáng)胃癌細(xì)胞增殖活力和集落形成能力，促進(jìn)胃癌的惡性生物學(xué)行為，是參與胃癌發(fā)生、發(fā)展的功能基因。LINC00659可能通過(guò)激活PI3K/AKT信號(hào)通路發(fā)揮作用，進(jìn)一步加深了我們對(duì)胃癌發(fā)生分子機(jī)制的認(rèn)識(shí)。LINC00659有望成為胃癌治療的新靶點(diǎn)，為胃癌治療個(gè)體化方案的定制提供參考。