金橘抗氧化活性譜效關(guān)系

鄧華明，黃華花，陳景海，王曉瑩

1. 廣東嶺南職業(yè)技術(shù)學(xué)院護(hù)理與健康學(xué)院（廣州 510663）；2. 廈門醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系/廈門市中藥生物工程重點實驗室/福建省中藥精加工與健康產(chǎn)品開發(fā)重點研究室（廈門 361023）；3. 廈門大學(xué)附屬婦女兒童醫(yī)院，廈門市婦幼保健院中藥房（廈門 361003）

隨著人們對安全性的要求不斷提高，從中藥中尋求天然抗氧化劑倍受關(guān)注，測定其抗氧化活性也成為抗氧化研究的熱門話題。

金橘（kumquat），為蕓香科植物金橘[Fortunella margarita（Lour.）Swingle]的果實，是一種具有很大開發(fā)潛力的藥用保健資源?！吨腥A本草》記載，金橘具有理氣解郁、消食化痰、醒酒的功效[1]?，F(xiàn)有研究表明[2-6]，金橘具有抗氧化作用，揮發(fā)油、萜類、黃酮類、多糖類、甾醇類等化學(xué)成分是金橘抗氧化作用的重要物質(zhì)基礎(chǔ)[7]。

金橘的抗氧化研究僅局限于有效部位，而各部位化學(xué)成分復(fù)雜，抗氧化活性成分的篩選研究工作量大，因此試驗在前期金橘指紋圖譜研究的基礎(chǔ)上[8]，探討金橘抗氧化活性的譜效關(guān)系，初步篩選與抗氧化活性密切相關(guān)的組分，為后期金橘抗氧化活性成分的篩選研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

KQ5200E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；全波長酶標(biāo)儀（Thermo Fisher Scientific Oy Ratastie 2，F(xiàn)1-01620 Vantaa，F(xiàn)inland）；電子天平CP124C[奧豪斯儀器（上海）有限公司]。

過硫酸鉀、甲醇（分析純，西隴科學(xué)股份有限公司）；2, 2’-聯(lián)氨-雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺鹽、1, 1-二苯基-2-苦基肼（上海源葉生物科技有限公司）；維生素C[石藥集團(tuán)維生藥業(yè)（石家莊）有限公司]。藥材信息見表1，經(jīng)廈門醫(yī)學(xué)院鮑紅娟副教授鑒定為金橘[Fortunella margarita（Lour.）Swingle]正品。

表1 金橘的樣品信息

1.2 研究方法

1.2.1 供試品溶液配制備

金橘果實，粉碎，過0.425 mm（40目）篩，精密稱定0.5 g，加25 mL 75%甲醇，稱定，超聲（900 W，40 kHz）30 min，放冷，再稱定，補(bǔ)足，搖勻，濾過，即得。

1.2.2 DPPH自由基清除能力測定[9]

1.2.2.1 DPPH溶液配制

取適量DPPH，精密稱定，加75%甲醇溶解并制成質(zhì)量濃度0.04 mg/mL的DPPH儲備液[10]。

1.2.2.2 DPPH自由基清除能力的測定及IC50的計算

將供試品S1～S8的質(zhì)量濃度設(shè)定為5.000，2.500，1.250，0.625，0.313和0.156 mg/mL，維生素C溶液作為陽性對照溶液。分別取維生素C溶液、供試品溶液各100 μL，加100 μL DPPH溶液，置96孔板中，混勻，室溫避光30 min。在517 nm波長處測定吸光度Ai，同時測定各供試品溶液100 μL+75%甲醇100 μL的吸光度Aj，75%甲醇100 μL+DPPH溶液100 μL的吸光度A0，清除率按式（1）計算。

因不同濃度供試品的自由基清除率與濃度不呈線性，故使用SPSS Statistics 24中Probit方法進(jìn)行回歸，擬合方程Probit（P）=截距+Bx，通過卡方檢驗得到IC50值。

1.2.3 ABTS自由基清除能力測定[11]

1.2.3.1 ABTS溶液配制

分別取適量ABTS、K2S2O4，精密稱定，用蒸餾水溶解并制成濃度7 mmol/L的ABTS和350 mmol/L K2S2O4溶液。取440 μL K2S2O4溶液加入到ABTS溶液中，搖勻，避光12～16 h，用75%甲醇稀釋至吸光度0.6～0.8。

1.2.3.2 ABTS自由基清除能力的測定及IC50的計算

供試品濃度的設(shè)定見表2。按1.2.2.2的方法在波長734 nm下測定，計算清除率及IC50。

表2 8批金橘樣品的質(zhì)量濃度

1.2.4 灰色關(guān)聯(lián)度分析法

通過Excel處理數(shù)據(jù)[12]，采用GRA法對8批金橘樣品指紋圖譜共有峰峰面積數(shù)據(jù)和自由基清除作用做統(tǒng)計分析，研究兩者的相關(guān)性。將各批次藥材的IC50設(shè)為母序列，將24個共有峰設(shè)定為子序列，1～24個共有峰分別用X1～X24表示[13]。

1.2.4.1 原始數(shù)據(jù)無量綱化

母序列、子序列分別定為A0(m)、Ai(m)，平均值分別定為，數(shù)據(jù)均值化處理，按式（2）和（3）計算，得均值化數(shù)列，新的數(shù)據(jù)中，母序列、子序列分別定為Y0(m)、Yi(m)。

1.2.4.2 求絕對差序列

按式（4）計算，得絕對差序列Δσi(m)。

1.2.4.3 求關(guān)聯(lián)系數(shù)

山東運(yùn)河區(qū)域，一般是指明清時期，京杭大運(yùn)河流經(jīng)山東境內(nèi)的部分州縣及其輻射地帶，大致包括今天的棗莊、濟(jì)寧、聊城等3個地級市，包含德州的德城、陵縣、武城、夏津、平原等縣級地區(qū)，以及菏澤市東部單縣、巨野、運(yùn)城，泰安市的東平縣，濟(jì)南市的平陰縣等近40個縣市。明代以前，在京杭運(yùn)河的重要組成部分“會通河”疏浚之前，山東運(yùn)河區(qū)域的社會經(jīng)濟(jì)水平與臨近的華北地區(qū)差別不大。隨著幾代統(tǒng)治者的大力開鑿、疏浚和重整，從元末明初到之后將近400余年的時間里，隨著運(yùn)河航運(yùn)的便利，山東運(yùn)河區(qū)域的煙草生產(chǎn)、棉花種植、果品栽培等活動也因大運(yùn)河的南北通達(dá)、易于轉(zhuǎn)售而促使地方經(jīng)濟(jì)獲得了結(jié)構(gòu)性的調(diào)整和躍升。

按式（5）計算，得相應(yīng)的關(guān)聯(lián)系數(shù)L0i(k)。其中，Δmin為最小值，Δmax為最大值，ρ為分辨系數(shù)（ρ= 0.5）。

1.2.4.4 計算關(guān)聯(lián)度

按式（6）計算，得關(guān)聯(lián)度R0i。其中，N為數(shù)據(jù)個數(shù)。

1.2.4.5 排關(guān)聯(lián)序并進(jìn)行譜效相關(guān)性

將關(guān)聯(lián)度進(jìn)行排列，形成關(guān)聯(lián)序，反映各個子序列對母序列的“貢獻(xiàn)”程度。由此可確定指紋圖譜共有峰所代表的化學(xué)成分與抗氧化活性間的聯(lián)系。

1.2.5 偏最小二乘回歸分析法

利用SIMCA-P 14.1軟件，將金橘樣品指紋圖譜共有峰的峰面積與金橘的IC50進(jìn)行PLSR分析，將共有峰峰面積定為X，藥材IC50定為Y。1～24個共有峰分別用X1～X24表示[14]。

1.2.5.1 建立工程，指定工作集

1.2.5.2 指定模型，進(jìn)行擬合

建立工程后，系統(tǒng)根據(jù)用戶已指定的因變量Y，也就是各批金橘樣品的IC50自動生成PLSR模型。

1.2.5.3 預(yù)測分析

擬合模型后，指定預(yù)測數(shù)據(jù)集，進(jìn)行擬合分析，得出結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 前期指紋圖譜研究[8]

前期指紋圖譜研究得8批金橘樣品的UPLC圖譜，見圖1。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012版）進(jìn)行分析，確定共有24個峰，見圖2。

圖1 8批金橘樣品的UPLC疊加指紋圖譜

圖2 8批金橘樣品的UPLC對照指紋圖譜

2.2 DPPH自由基清除能力測定

2.2.1 金橘樣品對DPPH自由基的清除能力測定結(jié)果

8批金橘樣品對DPPH自由基的清除能力測定結(jié)果見圖3和圖4。結(jié)果顯示，8批金橘樣品均表現(xiàn)出良好的DPPH自由基清除能力，而且清除作用隨著金橘供試品質(zhì)量濃度的升高而增強(qiáng)，同時S3和S8分別表現(xiàn)出相對最強(qiáng)和相對最弱的抗氧化作用，抗氧化活性的強(qiáng)弱順序為S3＞S4＞S7＞S1＞S2＞S5＞S6＞S8。

圖3 8批金橘樣品和VC對DPPH自由基的清除能力

圖4 8批金橘樣品和VC的DPPH自由基清除作用IC50

2.2.2 金橘指紋圖譜與DPPH自由基清除能力的譜效關(guān)系分析

2.2.2.1 灰色關(guān)聯(lián)度分析

GRA分析結(jié)果，見表3。根據(jù)關(guān)聯(lián)序，確定各色譜峰對金橘抗氧化作用貢獻(xiàn)的大小，依次為X2＞X1＞X9＞X14＞X6＞X12＞X19＞X11＞X10＞X16＞X15＞X5＞X22＞X3＞X17＞X23＞X4＞X20＞X24＞X18＞X8＞X21＞X13＞X7，其中X2、X1、X9、X14、X6、X12、X19、X11、X10、X16的相對關(guān)聯(lián)度均大于0.65，對清除自由基作用的貢獻(xiàn)較明顯。

表3 金橘樣品UPLC指紋圖譜與清除DPPH自由基活性關(guān)聯(lián)度

2.2.2.2 偏最小二乘回歸分析

PLSR分析結(jié)果，見圖5。擬合回歸方程：Y=-0.112X1-0.244X2-0.029X3+0.066X4-0.057X5+ 0.062X6+0.010X7+0.034X8-0.167X9-0.242X10+ 0.111X11-0.165X12+0.050X13-0.064X14-0.045X15- 0.001X16+0.053X17-0.005X18-0.291X19+0.078X20+ 0.001X21-0.013X22+0.008X23-0.041X24。相關(guān)系數(shù)的絕對值反映對金橘抗氧化作用的貢獻(xiàn)，絕對值越大，對金橘抗氧化貢獻(xiàn)越大；反之，絕對值越小，對金橘抗氧化作用貢獻(xiàn)越小。其中，色譜峰X1、X2、X3、X5、X9、X10、X12、X14、X15、X16、X18、X19、X22、X24呈負(fù)相關(guān)，因IC50與金橘的抗氧化作用呈負(fù)相關(guān)，所以這些色譜峰對金橘抗氧化作用有貢獻(xiàn)。

圖5 8批金橘樣品的PLSR標(biāo)準(zhǔn)化相關(guān)系數(shù)圖和VIP值圖

變量投影（VIP），是直接反映金橘指紋圖譜中的各色譜峰對金橘抗氧化活性貢獻(xiàn)程度的一個參數(shù)，VIP值越大，說明該峰所代表的化合物對金橘抗氧化作用的影響程度越高，VIP＞1時，表示對金橘抗氧化作用有顯著貢獻(xiàn)。色譜峰X19、X2、X9、X12、X10、X1、X14、X5的VIP值＞1，因此，金橘樣品指紋圖譜中X1、X2、X5、X9、X10、X12、X14所代表的化合物，可能為金橘抗氧化活性的物質(zhì)基礎(chǔ)。

2.3 ABTS自由基清除能力測定

2.3.1 金橘樣品對ABTS自由基的清除能力測定結(jié)果

8批金橘樣品對ABTS自由基的清除能力測定結(jié)果見圖6和圖7。結(jié)果顯示，8批樣品均對ABTS自由基表現(xiàn)出明顯清除作用，且清除作用隨質(zhì)量濃度升高而增強(qiáng)，同時S1和S8分別表現(xiàn)出相對最強(qiáng)和相對最弱的抗氧化作用，抗氧化活性的強(qiáng)弱順序為S1＞S3＞S4＞S2＞S5＞S6＞S7＞S8。

圖6 8批金橘樣品和VC對ABTS自由基的清除能力

圖7 8批金橘樣品和VC的ABTS自由基清除作用IC50

2.3.2 金橘指紋圖譜與ABTS自由基清除能力的譜效關(guān)系分析

2.3.2.1 灰色關(guān)聯(lián)度分析

GRA分析結(jié)果，見表4。依據(jù)關(guān)聯(lián)序，確定各色譜峰對金橘抗氧化作用貢獻(xiàn)程度，順序依次為X19＞X2＞X16＞X20＞X17＞X23＞X22＞X24＞X21＞X8＞X18＞X3＞X13＞X15＞X5＞X11＞X10＞X1＞X4＞X6＞X7＞X5＞X14＞X19，其中X19、X2、X16、X20、X17、X23、X22、X24、X21的相對關(guān)聯(lián)度均大于0.8，對清除自由基作用的貢獻(xiàn)較明顯。

表4 金橘樣品UPLC指紋圖譜與清除ABTS自由基活性關(guān)聯(lián)度

2.3.2.2 偏最小二乘回歸分析

PLSR分析結(jié)果，見圖8。擬合回歸方程：Y= -0.066X1-0.612X2-0.034X3+0.272X4+0.090X5+0.231X6- 0.000 2X7-0.546X8+0.095X9-0.356X10+0.005X11+ 0.003X12+0.028X13-0.223X14+0.156X15-0.111X16+ 0.066X17-0.126X18-0.241X19+0.094X20-0.068X21+ 0.004X22+0.099X23+0.020X24。回歸系數(shù)為負(fù)數(shù)的色譜峰是抗氧化能力的貢獻(xiàn)峰，其中，色譜峰X1、X2、X3、X7、X8、X10、X14、X16、X18、X19、X21呈負(fù)相關(guān)，對金橘抗氧化作用有貢獻(xiàn)。

圖8 8批金橘樣品的PLSR標(biāo)準(zhǔn)化相關(guān)系數(shù)圖和VIP值圖

色譜峰X2、X19、X10、X8、X1、X14、X11的VIP值＞1，因此，金橘樣品指紋圖譜中X1、X2、X8、X10、X14、X19代表的化合物可能為金橘抗氧化活性的物質(zhì)基礎(chǔ)。

3 討論與結(jié)論

3.1 分析方法的選擇

灰色關(guān)聯(lián)度分析法是衡量各因素之間關(guān)系的統(tǒng)計方法，對數(shù)據(jù)的要求較為低，而且可以減少由于數(shù)據(jù)不對稱帶來的影響，偏最小二乘回歸分析法是集多種方法于一身的統(tǒng)計方法，可以較好地解決樣本少于變量個數(shù)的問題。這2種方法都是通過統(tǒng)計各色譜峰峰面積與藥效間的聯(lián)系，評價兩者的相關(guān)性和貢獻(xiàn)值大小的統(tǒng)計方法，上述2種方法均是構(gòu)建中藥譜效關(guān)系常用、有效的方法，同時選用2種方法進(jìn)行分析，結(jié)果更全面、客觀。

3.2 DPPH儲備液濃度的確定

預(yù)試驗過程中，制備的DPPH儲備液質(zhì)量濃度為0.08 mg/mL，此時所測得的金橘供試品均未表現(xiàn)出抗氧化活性，說明可能DPPH儲備液濃度過高，導(dǎo)致各濃度金橘供試品自由基清除率偏低，未表現(xiàn)出良好的抗氧化活性，因此將DPPH儲備液的質(zhì)量濃度調(diào)整為0.04 mg/mL，結(jié)果表現(xiàn)出良好的抗氧化活性。

試驗在前期指紋圖譜研究的基礎(chǔ)上，通過DPPH自由基清除法和ABTS自由基清除法評價8批不同產(chǎn)地的金橘樣品的抗氧化活性，采用GRA和PLSR構(gòu)建金橘抗氧化活性的譜效關(guān)系。GRA和PLSR結(jié)果均表明，X2、X19的峰面積與DPPH和ABTS自由基清除能力呈正相關(guān)，可能為金橘抗氧化的貢獻(xiàn)峰，其代表的化合物可能為金橘抗氧化活性的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。該試驗為后期金橘抗氧化活性成分的篩選研究提供參考，為金橘的深度研究及產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。