羊精液保存冷凍稀釋液的研究進(jìn)展

朱大偉，羅聯(lián)鋒，徐策義，馬舒藍(lán)，張煜欣，胡建宏*

(1. 西北農(nóng)林科技大學(xué) 動物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2. 陜西省寶雞市金臺區(qū)科技創(chuàng)新服務(wù)中心，陜西 寶雞 721000)

隨著人工授精技術(shù)越來越廣泛的應(yīng)用以及生產(chǎn)中對優(yōu)秀種公畜精液的需要，對精液保存技術(shù)提出了更高要求。精液保存技術(shù)是指將精液與提前準(zhǔn)備好的稀釋液按照一定比例混合后，再按照專業(yè)的操作步驟對混合后的精液進(jìn)行處理，以獲得長期保存的效果。通過對公羊精液的保存能提高對優(yōu)秀種公羊精液的利用率，充分發(fā)揮種公羊的生產(chǎn)效率，使用人工保存精液進(jìn)行人工授精還可以減少公、母畜的接觸進(jìn)而減少疾病傳播的可能性，提高養(yǎng)殖場生物安全。本文通過分析精液組成、精子特性和稀釋液的成分，對精液保存稀釋液的研究提供參考。

1 精液組成與精子特性

精液可分為精子和精漿兩部分。精漿是由雄性生殖系統(tǒng)的副性腺產(chǎn)生的構(gòu)成精子生存微環(huán)境的液體，不僅對精子在雌性生殖道內(nèi)的運動起運輸作用，而且能為精卵結(jié)合過程提供營養(yǎng)物質(zhì)。宋國欣等研究表明，在公羊的精漿中存在的多種蛋白都與精子受精能力相關(guān)，例如BSP蛋白能在精子冷凍過程中使酪氨酸磷酸化水平下降而提高精子活力；伴侶蛋白能通過保護(hù)細(xì)胞內(nèi)的肌動蛋白和微管蛋白的折疊而提高解凍后精子的運動能力。劉浩等研究表明，精漿中的微量元素如鋅、鐵等的含量與精子受精能力呈正相關(guān)。鋅、鐵含量偏低的個體不論是精子活力還是精子濃度都不及正常個體，此外精漿中的微量元素還能減少精子在體外受到的氧化損傷。

不同降溫速率對精子活力的影響不同，降溫過慢會使精子細(xì)胞內(nèi)處于高滲狀態(tài)容易漲破，而降溫過快使細(xì)胞內(nèi)結(jié)成大量冰晶，損傷細(xì)胞器和膜結(jié)構(gòu)。烏日漢等對戴瑞羊的研究顯示，60 ℃/min的降溫速率使凍后精子質(zhì)膜完整率、線粒體膜完整率和人工授精后胚胎卵裂率都保持較高水平。精子的生物特性表現(xiàn)為精子本身作為一個具有新陳代謝能力的生命體，對抗菌藥物也具有敏感性，在配置保存液時加入的抗菌藥物即使?jié)舛容^低也會影響精子的活力，因此在稀釋液中使用抗菌藥時應(yīng)考慮到對精子的毒害作用。精子由頭部、頸部和尾部3部分組成，其中頭部為卵圓形，略扁，是細(xì)胞核和頂體存在的部位，頂體內(nèi)存在的頂體酶、透明質(zhì)酸酶等酶類對于精子穿過透明帶完成受精過程具有重要作用；精子頸部是精子中最易受到損傷的部位，主要起連接精子頭部和尾部的作用；精子尾部存在大量線粒體，是精子進(jìn)行運動和能量代謝的主要部位，又可分為主段、尾段2部分。

2 精液保存稀釋液成分

精液保存稀釋液一般包括緩沖物質(zhì)、抗凍物質(zhì)、抗菌物質(zhì)和抗氧化物質(zhì)4種成分。緩沖物質(zhì)可以保持精子內(nèi)外滲透壓穩(wěn)定，防止精子形態(tài)發(fā)生改變；抗凍物質(zhì)可以減少在低溫狀態(tài)下的精子損傷，延長精子壽命；抗菌物質(zhì)能抑制細(xì)菌的生長，提高精子活力；抗氧化物質(zhì)則是防止精子在體外環(huán)境被氧化。

2.1 緩沖物質(zhì)

精漿中本身存在一定量的緩沖物質(zhì)用以維持精子正常的生理功能，但是當(dāng)精液被稀釋后，精液中的滲透壓平衡被破壞，若不額外加入緩沖物質(zhì)則精子將會死亡。因此，從20世紀(jì)40年代開始科學(xué)家就研究精液稀釋時可以使用的緩沖物質(zhì)。目前用作精液稀釋液中的緩沖物質(zhì)主要有三羥甲基氨基甲烷(Tris)、檸檬酸鈉等。Tris對精子基本沒有毒害作用又具有良好的緩沖性、利尿性和滲透性，因此通常與檸檬酸鈉、糖類等一起廣泛應(yīng)用于精液的保存，且最佳濃度一般為250～400 mol/L。Ike Osuagwuh等在公羊精液上的研究表明，Tris與葡萄糖組合使用的效果較果糖和蔗糖等更好，制作的凍精輸精受胎率最高可達(dá)57%，因此目前Tris-葡萄糖配方是較為常見的冷凍稀釋液配方。宣小龍等對夏洛萊羊的研究也顯示，在稀釋液中添加一定量的檸檬酸鈉不僅能夠使精液的pH值保持在6.8左右，給精子提供一個接近新鮮精液pH的環(huán)境，使解凍后的精子活力高達(dá)48%，而且檸檬酸鈉還能使卵黃分散，促進(jìn)精子運動。

2.2 抗凍物質(zhì)

冷凍過程中的精子易受到冷應(yīng)激，導(dǎo)致其超微結(jié)構(gòu)以及功能產(chǎn)生損傷，這些損傷會使精子無法與卵子結(jié)合發(fā)生受精作用，而抗凍物質(zhì)在冷凍過程中會優(yōu)先從精子表面被去除，而減少精子受到的損傷，起到保護(hù)作用，因此在精液冷凍過程中添加冷凍保護(hù)劑具有極其重要的作用。目前使用的抗凍物質(zhì)主要分為滲透性抗凍物質(zhì)和非滲透性抗凍物質(zhì)兩大類。

滲透性抗凍物質(zhì)如甘油、乙二醇等，能夠在冷凍過程中進(jìn)入精子細(xì)胞內(nèi)部，增加細(xì)胞滲透壓，降低冰核溫度和冰晶尺寸，從而對細(xì)胞起到保護(hù)作用。非滲透性抗凍物質(zhì)如大豆卵磷脂、十二烷基硫酸鈉等存在于溶液中，通過避免解凍時溶劑進(jìn)入精子細(xì)胞內(nèi)漲破細(xì)胞起到保護(hù)作用。

甘油(丙三醇)是一種滲透性抗凍物質(zhì)，能進(jìn)入精子細(xì)胞內(nèi)，通過與細(xì)胞內(nèi)的水分脫出或結(jié)合，使水處于過冷狀態(tài)，減少冷凍過程中冰晶的形成。曹訪等通過向湖羊精液稀釋液中加入不同濃度乙二醇、丙三醇、甲醇、二甲基亞砜等保護(hù)劑，測定冷凍-解凍后精子活率，發(fā)現(xiàn)以5%丙三醇作為冷凍保護(hù)劑效果最佳，能使解凍后精子活率達(dá)到39.5%。但是甘油具有粘稠性，會阻礙精子在子宮內(nèi)的移動，同時甘油在常溫下對精子有毒害作用，濃度過高時會增加精子的畸形率，因此甘油在綿羊顆粒法精液保存中常使用的濃度一般為3%～4%，而細(xì)管法冷凍常用濃度為6%～9%。

乙二醇可通過兩種方式發(fā)揮抗凍作用：一是乙二醇能在溫度降到零度以下時增加水跨膜運輸?shù)幕罨?，解凍時調(diào)節(jié)精子細(xì)胞內(nèi)部的水運輸過程，減少精子細(xì)胞在冷凍過程中形成冰晶；二是乙二醇能夠通過保護(hù)精子細(xì)胞內(nèi)的超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶等具有抗氧化作用的物質(zhì)，減少精子在冷凍過程中產(chǎn)生的活性氧自由基，提高精子細(xì)胞冷凍過程中的抗氧化應(yīng)激能力。

卵黃是羊精液冷凍保存過程中的重要物質(zhì)之一，卵黃中的磷脂酰膽堿和低密度脂蛋白(LDL)都能作為冷凍-解凍過程中的抗凍物質(zhì)減少低溫對精子的損傷，提高精子活力、頂體完整率和質(zhì)膜完整率等指標(biāo)。此外卵黃還能降低甘油濃度，減少甘油對精子的損害。

大豆卵磷脂作為一種對精子無害的非滲透性抗凍物質(zhì)，被公認(rèn)為可在精液冷凍保存中代替甘油。范文華等研究表明，在稀釋液中加入2%的大豆卵磷脂就能起到與加入20%卵黃相同的保護(hù)效果，而同時使用10%卵黃+2%的大豆卵磷脂對精子的保護(hù)效果更好。劉文江等的研究表明，在山羊精液稀釋液中加入1 g/L的大豆卵磷脂對精子細(xì)胞膜完整性的提高效果最佳，對頂體完整率沒有顯著影響。但是大豆卵磷脂難溶于水，若解凍后在體外保存時間過長可能會導(dǎo)致精子發(fā)生凝集死亡現(xiàn)象，限制了大豆卵磷脂在精液保存中的應(yīng)用。

十二烷基硫酸鈉(SDS)作為一種表面活性劑，在精液冷凍過程中能保護(hù)和修補精子的膜結(jié)構(gòu)。宋玉坤等研究發(fā)現(xiàn)，添加1%的SDS后精子活率和直線運動率顯著高于對照組，而畸形精子率偏低。此外高線粒體膜電位的精子比例雖沒有明顯增加，但表現(xiàn)出上升趨勢。

在精子的冷凍保存過程中，為了減少冷凍過程造成的損傷，添加冷凍保護(hù)劑是至關(guān)重要的，但是不同的冷凍保護(hù)劑具有不同的特性，如滲透性保護(hù)劑會進(jìn)入精子細(xì)胞內(nèi)部，對精子產(chǎn)生一定的毒性作用，而一些動物源性的非滲透性保護(hù)劑可能會攜帶病原菌從而對精子產(chǎn)生不利影響，因此制作冷凍保存稀釋液時選擇合適的冷凍保護(hù)劑具有重要意義。

2.3 抗菌物質(zhì)

精液以及精液稀釋液中存在豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，會導(dǎo)致細(xì)菌微生物的大量繁殖，而微生物的生長不但會降低精子活力、影響受精能力和胚胎發(fā)育過程，輸精后還可能導(dǎo)致母畜生殖道感染疾病。目前廣泛使用的抗生素仍以青霉素、鏈霉素等為主，Hernández-Avilés等研究表明，與不加抗生素的對照組相比，試驗組抑菌效果明顯，且在冷凍狀態(tài)下抑菌效果超過新鮮精液。但是使用抗生素不但對精子具有一定的毒害作用，而且會使細(xì)菌產(chǎn)生抗藥性。為了有較好的抗菌效果，人們開始使用具有抗菌譜廣、對精子細(xì)胞毒害作用較小或者無毒害作用的抗菌肽作為精液保存稀釋液中的抗菌物質(zhì)。

2.4 抗氧化物質(zhì)

活性氧對保持精子活力具有極其重要的作用，一般通過在精液稀釋液中添加抗氧化劑來中和形成的氧化自由基，以減少精子在體外的氧化程度。一般常用的抗氧化物質(zhì)包括抗氧化酶、維生素、氨基酸和植物提取物。維生素B能夠以輔酶的形式參與各種代謝過程，從光雷等研究發(fā)現(xiàn)，在冷凍液中添加2 mg/mL的維生素B能減少冷凍過程中膜脂質(zhì)的過氧化作用，保持精子膜的完整性，并提高精子解凍后的運動性能。抗壞血酸能保護(hù)精子DNA免受氧化損傷，保證精子細(xì)胞遺傳信息的完整。唐淑紅等研究表明，當(dāng)在精液稀釋液中加入1 mmol/L的谷胱甘肽(GSH)時能減少精子活性氧的產(chǎn)生數(shù)量，對精子活力、頂體完整性、DNA完整性等都有顯著提高。而對山羊冷凍精液而言，加入GSH后對提高體外受精率也有一定幫助。周凌博等研究發(fā)現(xiàn)，由松果體合成的褪黑素也可以減少精子受到的氧化損傷，與對照組相比，在培養(yǎng)液中加入10mol/L濃度的褪黑素能顯著提高凍融后精子活力、運動能力、DNA完整性以及細(xì)胞內(nèi)的ATP水平，同時還能減少受精后胚胎細(xì)胞的凋亡數(shù)量。呂春榮等研究發(fā)現(xiàn)，在稀釋液中加入10 μmol/L的白藜蘆醇能顯著降低ROS的產(chǎn)生，并提高解凍后精子直線運動的百分率和質(zhì)膜完整性，這說明白藜蘆醇可以作為精液保存中的抗氧化物質(zhì)，但是當(dāng)白藜蘆醇濃度過高時對精子活力反而會產(chǎn)生抑制作用，這可能是因為高濃度的抗氧化劑破壞了精子頂體結(jié)構(gòu)。

3 小 結(jié)

隨著畜牧業(yè)的發(fā)展和人工授精技術(shù)的推廣，精液保存稀釋液具有非常重要的作用。但是目前稀釋液的各項成分仍存在各種問題，如甘油對精子的毒害作用、卵黃作為動物源性添加劑可能帶來的感染問題、大豆卵磷脂難溶于水的問題等，都限制著精液冷凍保存技術(shù)的發(fā)展。在今后的研究中，尋找非動物源性添加劑和植物提取物代替現(xiàn)有的成分為解決這些問題提供了可能。