糞源抗生素抗性基因在土壤中的沉積效果研究進(jìn)展

徐燾杰，簡(jiǎn)宗輝，孫 帥，閆世雄，黃 英，趙素梅，賈俊靜

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/云南省動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650201)

抗生素通過(guò)多種方式抑制或殺滅病原菌，曾在動(dòng)物生產(chǎn)中被廣泛使用。抗生素的給藥途徑包括口服給藥、舌下給藥、直腸給藥等多種途徑，由于方便且制劑便宜，口服成為抗生素首選給藥途徑?？诜绞绞鼓c道細(xì)菌直接暴露于抗生素，通過(guò)自然選擇作用引起耐藥細(xì)菌的不斷出現(xiàn)，以及家畜胃腸道中抗生素抗性基因(Antibiotic resistance genes，ARGs)的不斷積累。

2006年，ARGs首次被列為一類環(huán)境新興污染物，對(duì)生態(tài)環(huán)境構(gòu)成了嚴(yán)重的破壞。在家畜體內(nèi)，攜帶ARGs的抗性細(xì)菌以及細(xì)胞外游離ARGs可隨糞便排出體外，使得動(dòng)物糞便成為ARGs的重要儲(chǔ)存庫(kù)。土壤作為地球上最大和最多樣化的微生物棲息地之一，為ARGs的長(zhǎng)久寄居和不斷傳播創(chuàng)造了有利條件，長(zhǎng)期施用家畜糞便的土壤中ARGs的豐度和多樣性會(huì)顯著增加。而土壤中ARGs的不斷沉積，會(huì)導(dǎo)致土壤微生物耐藥譜的增加和耐藥性的增強(qiáng)。

本文就家畜糞便來(lái)源的ARGs在土壤中的沉積效果進(jìn)行了系統(tǒng)總結(jié)，以揭示ARGs對(duì)環(huán)境和人類健康的潛在影響，期望為ARGs傳播的早期預(yù)警和控制工作提供參考和指導(dǎo)。

1 ARGs的特性與類型

1.1 ARGs的特性

ARGs廣泛分布于土壤和水生環(huán)境中，與傳統(tǒng)的化學(xué)和物理污染物有所不同，作為一種基因污染物，ARGs具有可復(fù)制性、傳播性、環(huán)境持久性等特點(diǎn)。即使耐藥菌死亡，ARGs 也可以DNA的形式在環(huán)境和人體中發(fā)生定植和轉(zhuǎn)移，造成ARGs在環(huán)境治理過(guò)程中難以控制和消除。不同種類的ARGs之間存在共選擇作用，從而增強(qiáng)微生物的多重耐藥性，其原因可能是因?yàn)椴煌N類ARGs存在于同一個(gè)質(zhì)粒或者轉(zhuǎn)座子上會(huì)同步復(fù)制和轉(zhuǎn)移，也可能是因?yàn)槲⑸铽@得了一種ARGs之后，對(duì)其它ARGs的通透性加強(qiáng)。

1.2 ARGs的類型和種類

依據(jù)來(lái)源、耐藥機(jī)制和耐藥性可分別對(duì)ARGs進(jìn)行類型劃分。根據(jù)ARGs的來(lái)源可分為天然抗性基因和獲得性抗性基因，天然抗性基因在抗生素使用之前就存在，是位于染色體上可以遺傳的基因，如鏈球菌對(duì)慶大霉素的耐藥性就是天然抗性基因引起的；獲得性抗性基因是微生物接觸抗生素后，由于遺傳基因的變化、生存代謝途徑的改變等而產(chǎn)生的耐藥基因。此外，水平基因轉(zhuǎn)移(Horizontal gene transfer，HGT)是獲得性抗性基因形成的主要途徑，其主要依賴于質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子和整合子等可移動(dòng)遺傳元件(Mobile genetic elements，MGEs)的作用。根據(jù)ARGs的耐藥機(jī)制進(jìn)行分類，可分為抗生素失活、外排泵、細(xì)胞保護(hù)和未知機(jī)制等4類ARGs。根據(jù)耐藥性進(jìn)行分類最常見(jiàn)，包括多重耐藥類、磺胺類、氨基糖苷類等抗性基因。同一類型的ARGs還可分為多個(gè)種類，不同種類的ARGs可能具有不同的耐藥機(jī)制，如四環(huán)素類抗性基因涵蓋了所有4種耐藥機(jī)制，即外排泵(、和等)、細(xì)胞保護(hù)(、和等)、抗生素失活()和未知機(jī)制(、和等)。

2 家畜糞便中的ARGs分布狀況

2.1 雞糞中ARGs的分布

雞的養(yǎng)殖密度大且銷售期短，抗生素的使用劑量較高，又因?yàn)殡u的消化功能差，造成雞糞中ARGs污染程度較大。錢勛在雞糞中檢出多達(dá)134種ARGs，種類和總相對(duì)豐度均大于豬糞和牛糞，且不同養(yǎng)殖場(chǎng)采集的雞糞中的ARGs組成相似?；前奉惪剐曰蛟陔u糞中具有較高水平，武晉萍等的研究結(jié)果表明雞糞與中藥渣共堆肥樣品檢測(cè)到的相對(duì)豐度增加。除了磺胺類抗性基因，四環(huán)素類抗性基因在雞糞中也存在較嚴(yán)重的污染。Cheng等調(diào)查了中國(guó)東部杭州市中小型雞場(chǎng)的雞糞中四環(huán)素類和磺胺類抗性基因的豐度和多樣性，結(jié)果顯示中型雞場(chǎng)雞糞中各種ARGs的相對(duì)豐度高于小型雞場(chǎng)，且兩種規(guī)模的雞場(chǎng)中的相對(duì)豐度均最高，其次是和。盡管自1994年起，由于氯霉素具有不良副作用，歐洲聯(lián)盟(EU)已禁止在食用動(dòng)物中使用氯霉素，但氯霉素在雞糞中仍然存在較高的污染水平。

2.2 豬糞中ARGs的分布

豬肉是人均消費(fèi)最多的畜禽肉類，豬糞中檢出的ARGs的豐度和多樣性僅次于雞糞。許多研究表明，豬糞中磺胺類抗性基因的污染程度較高。Duan等在豬糞和豬糞堆肥樣品中檢測(cè)到磺胺類抗性基因(和)總絕對(duì)豐度高于四環(huán)素類(和)和大環(huán)內(nèi)酯類抗性基因(、、、和)，磺胺類抗性基因中的豐度大于。四環(huán)素類抗生素是養(yǎng)豬業(yè)常用的治療疾病和促進(jìn)生長(zhǎng)的抗生素，因此四環(huán)素類抗性基因在豬糞中普遍存在，其中核糖體保護(hù)蛋白基因在豬糞中占主導(dǎo)地位。Cheng等的研究結(jié)果表明，豬糞中核糖體保護(hù)蛋白基因(、和)豐度高于外排泵蛋白基因(、、、和)，鈍化酶基因()的豐度介于外排泵蛋白基因和之間。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，豬的發(fā)育階段不同，豬糞中ARGs豐度也不一致。

2.3 牛糞中ARGs的分布

與豬場(chǎng)和牛場(chǎng)相比，牛場(chǎng)的飼養(yǎng)密度低，出欄時(shí)間長(zhǎng)，因此牛場(chǎng)中抗生素使用量更低，從而使牛糞中ARGs的豐度和多樣性相對(duì)較低。Qian等分析了不同畜禽糞便中ARGs的相對(duì)豐度，結(jié)果顯示牛糞ARGs的種類和總豐度低于雞場(chǎng)和豬場(chǎng)，其中β-內(nèi)酰胺類抗性基因的污染程度最高。除了β-內(nèi)酰胺類抗性基因，牛糞中磺胺類抗性基因污染程度較高。Ji等的研究結(jié)果表明,牛糞中所有磺胺類抗性基因相對(duì)豐度均高于四環(huán)素類抗性基因，磺胺類抗性基因相對(duì)豐度大小順序?yàn)椤Ｄ膛Ｊ悄退幖?xì)菌的儲(chǔ)存庫(kù)，并且所有年齡段的奶牛都會(huì)釋放這些微生物。Haley等對(duì)斷奶前犢牛和泌乳奶牛的糞便的宏基因組進(jìn)行了測(cè)序和分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有樣品中檢出頻率最高的是四環(huán)素和氨基糖苷類抗性基因，且四環(huán)素類抗性基因的相對(duì)豐度最高，其中大于其它ARGs。另外，斷奶前犢牛的糞便ARGs豐度顯著高于泌乳奶牛，其原因可能是幼年奶牛傾向于接受更多的抗生素治療。

3 家畜糞便污染的土壤中ARGs分布狀況

3.1 雞糞污染的土壤中ARGs的分布

農(nóng)田土壤施雞糞有機(jī)肥能有效提高土壤肥力，但施肥持續(xù)時(shí)間并不是污染程度的決定性因素。Zhou等發(fā)現(xiàn)施用雞糞商業(yè)有機(jī)肥可顯著增加土壤中的ARGs的相對(duì)豐度，但每次施用兩個(gè)月后相對(duì)豐度降低，且ARGs的相對(duì)豐度在首次施用和重復(fù)施用之間沒(méi)有顯著差異。相似地，Chen等也發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期施用雞糞可顯著增加土壤中ARGs的豐度和多樣性，其中β-內(nèi)酰胺類、四環(huán)素類和多重耐藥類抗性基因占主導(dǎo)地位。磺胺類藥物在雞糞污染的土壤中常被檢測(cè)到，并往往存在較嚴(yán)重的污染。Zhao等利用qPCR技術(shù)分析了長(zhǎng)期施用雞糞的農(nóng)田土壤ARGs的污染程度，結(jié)果表明土壤中磺胺類抗性基因(和)的相對(duì)豐度均高于四環(huán)素類抗性基因(、和)，磺胺類抗性基因中的相對(duì)豐度高于。

3.2 豬糞污染的土壤中ARGs的分布

由于豬糞中具有豐富的ARGs，因此豬糞澆灌的農(nóng)田土壤，豬場(chǎng)周圍土壤，以及豬場(chǎng)下游污水滲入土壤均存在ARGs的污染。與雞糞污染的土壤相似，豬糞污染的土壤會(huì)使ARGs的豐度增加，但添加豬糞之后ARGs的豐度會(huì)逐漸降低?；前奉惪剐曰蛟谪i糞污染的土壤中具有較高的多樣性和豐度，Zhang等對(duì)施用了豬糞發(fā)酵沼液的葡萄地土壤中ARGs的分布狀況進(jìn)行了分析，結(jié)果檢出了4種磺胺類抗性基因(、、和)，相對(duì)豐度最高的是，其次是。對(duì)于喹諾酮類抗性基因，和的污染程度較高，而其它喹諾酮列抗性基因的污染程度則較低。四環(huán)素類抗性基因在豬糞污染的土壤中具有豐富的多樣性，Wu等研究表明，外排泵蛋白基因(、、和)在豬糞污染土壤中檢出頻率較高。此外，由于氯霉素便宜、廣譜、易于儲(chǔ)存，仍被一些小農(nóng)場(chǎng)主非法使用，導(dǎo)致豬糞污染的土壤中仍存在較高水平的氯霉素類抗性基因。

3.3 牛糞污染的土壤中ARGs的分布

由于牛糞ARGs豐度和多樣性較低，因此對(duì)土壤的造成污染程度也相對(duì)較低。程建華等分析了不同類型畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)土壤中ARGs的豐度和多樣性，結(jié)果在牛場(chǎng)土壤樣品中檢測(cè)到27種ARGs，種類低于雞場(chǎng)土壤(44種)和豬場(chǎng)土壤(36種)，且其中只有10種僅在牛場(chǎng)土壤存在。牛糞污染的土壤中磺胺類抗性基因和部分喹諾酮類抗性基因的污染程度較高。Mu等通過(guò)qPCR檢測(cè)了牛場(chǎng)土壤中四環(huán)素類(、、和)、磺胺類(和)、喹諾酮類(和)和大環(huán)內(nèi)酯類抗性基因(和)的絕對(duì)豐度，結(jié)果表明、和的絕對(duì)豐度較高，而其它的ARGs絕對(duì)豐度較低，三者絕對(duì)豐度高低順序?yàn)椤?/p>

3.4 未受畜禽糞便污染的土壤中ARGs的分布

土壤微生物區(qū)系代表了抗生素抗性的一個(gè)古老的進(jìn)化起源，土壤一直被認(rèn)為是ARGs的豐富儲(chǔ)存庫(kù)，這些ARGs有的來(lái)自于自然過(guò)程，而與人類活動(dòng)無(wú)關(guān)。土壤中的這種抗生素抗性稱為內(nèi)在抗性(Intrinsic resistance)，導(dǎo)致未受畜禽糞便污染土壤中也能檢測(cè)出ARGs，盡管其中ARGs的豐度和多樣性比較低。Su等在未施糞肥和堆肥的水稻土樣品WG的宏基因文庫(kù)中篩選到1個(gè)利福平耐藥克隆、1個(gè)氯霉素耐藥克隆和1個(gè)氨基糖苷類耐藥克隆，在未施糞肥和堆肥的水稻土樣品QG的宏基因文庫(kù)中也篩選到1個(gè)氨基糖苷類耐藥克隆和1個(gè)四環(huán)類耐藥克隆。Wang等在沒(méi)有使用過(guò)糞肥和抗生素的森林土壤中檢測(cè)到了豐度較低的磺胺類抗性基因(、和)，且從中分離的磺胺類藥物抗性(Sulfonamide-resistant，SR)細(xì)菌經(jīng)過(guò)PCR定性鑒定后未檢測(cè)到。

4 糞源ARGs在土壤中的沉積效果

4.1 糞源ARGs在土壤不同層次中的沉積效果

糞源ARGs在土壤中具有一定的垂直分布特點(diǎn)，在土壤不同層次結(jié)構(gòu)中表現(xiàn)不同的沉積效果。Tang等在不同深度的水稻土均檢測(cè)到四環(huán)素類抗性基因，且四環(huán)素類抗性基因的豐度隨著土壤深度的增加而降低。不同的是，Peng等的研究結(jié)果表明在豬糞和豬糞堆肥施肥的土壤中，各種四環(huán)素類抗性基因的相對(duì)豐度隨土壤深度的增加而增加，但隨著土壤深度的進(jìn)一步增加部分四環(huán)素類抗性基因的相對(duì)豐度降低。這些現(xiàn)象說(shuō)明，在一定的范圍內(nèi)，ARGs的沉積效果與土壤深度呈正相關(guān)，而超過(guò)這個(gè)范圍后，ARGs的沉積效果與土壤深度呈負(fù)相關(guān)。此外，一些研究還表明，不同ARGs的沉積效果差異性在不同土壤層次也表現(xiàn)不同。劉博等研究了入滲區(qū)土壤中四環(huán)素類抗性基因的存在豐度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)底泥土壤(采樣深度10 cm)中各種四環(huán)素類抗性基因絕對(duì)豐度高于包氣帶土壤(采樣深度30 cm)。游離態(tài)四環(huán)素抗性基因吸附試驗(yàn)結(jié)果表明，包氣帶土壤對(duì)攜帶、、和質(zhì)粒的吸附效果十分接近，而底泥對(duì)攜帶和目的片段的質(zhì)粒的吸附效果高于攜帶和目的片段的質(zhì)粒。

4.2 不同類別糞源ARGs在土壤中的沉積效果

ARGs種類也是影響糞源ARGs在土壤中的沉積效果的重要因素。施用有機(jī)肥有助于土壤中ARGs的積累，主要包括磺胺類抗性基因?；前奉惪剐曰蛩拗骶謴V泛，且容易利用可移動(dòng)遺傳元件進(jìn)行轉(zhuǎn)移，因此具備很強(qiáng)的環(huán)境沉積潛力。He等調(diào)查了室內(nèi)養(yǎng)殖和自由放養(yǎng)的肉雞場(chǎng)雞糞和周邊環(huán)境ARGs的污染狀況和傳播特點(diǎn)，結(jié)果顯示在各類ARGs中，磺胺類抗性基因(和)具有最高的土壤沉積效果，其中開(kāi)平市的6個(gè)自由放養(yǎng)雞場(chǎng)土壤的平均相對(duì)豐度是相應(yīng)雞場(chǎng)雞糞的2倍多。Wang等檢測(cè)了中國(guó)東南部養(yǎng)殖場(chǎng)畜禽糞便和土壤等環(huán)境中四環(huán)素類、磺胺類、喹諾酮類、氨基糖苷類和大環(huán)內(nèi)酯類5類抗生素抗性基因的豐度，結(jié)果顯示磺胺類抗性基因的傳播性最強(qiáng)，其次是四環(huán)素類和大環(huán)內(nèi)酯類抗性基因。除了磺胺類抗性基因，多重耐藥類抗性基因在畜禽糞便污染的土壤中具有較高的豐度，同樣具有較高的沉積效果。Fang等的研究結(jié)果顯示雞糞施肥溫室土壤中多重耐藥類抗性基因的相對(duì)豐度最高，且與雞糞相比，溫室土壤中多重耐藥類抗性基因的相對(duì)豐度更高，而其它類ARGs的相對(duì)豐度更低。

4.3 不同種類糞源ARGs在土壤中的沉積效果

ARGs的類別相同但種類不同，也會(huì)表現(xiàn)出不同的沉積效果。對(duì)于磺胺類抗性基因，的沉積效果一般大于，因?yàn)槲廴舅礁资艿饺藶榛顒?dòng)因素的干擾。對(duì)于四環(huán)素類抗性基因，許多研究表明，畜禽糞便與受污染土壤中核糖體保護(hù)蛋白基因的豐度均高于外排泵蛋白基因，表明核糖體保護(hù)蛋白可以賦予細(xì)菌強(qiáng)大的四環(huán)素抗性。經(jīng)常與可移動(dòng)遺傳元件相關(guān)聯(lián)，從而增強(qiáng)了從一種細(xì)菌向另一種細(xì)菌的轉(zhuǎn)移能力，所以具有最廣泛的宿主范圍，在土壤具有較理想的沉積效果。β-內(nèi)酰胺類抗性基因的沉積效果同樣表現(xiàn)出種間差異性。谷艷茹等調(diào)查了家庭農(nóng)場(chǎng)不同畜禽養(yǎng)殖糞污及其周邊土壤中ARGs的相對(duì)豐度，在5種-內(nèi)酰胺類抗性基因(、、、和)中，和在豬場(chǎng)和雞場(chǎng)周邊的土壤中沉積效果最佳，而在牛場(chǎng)周邊土壤中沉積效果最佳。

5 影響糞源ARGs在土壤中的沉積效果的環(huán)境因子

5.1 糞便中抗生素對(duì)ARGs沉積效果的影響

大多數(shù)獸用抗生素很難被動(dòng)物吸收，因而容易隨糞便排出進(jìn)入土壤。殘留的抗生素可能會(huì)對(duì)環(huán)境微生物施加選擇壓力，導(dǎo)致抗生素抗性微生物及其攜帶的抗性基因的傳播。Xiong等的研究結(jié)果表明，豬糞中添加氟喹諾酮可后土壤中4種質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類抗性基因(、、(6')Ⅰ-和)的相對(duì)豐度顯著提高了。相似地，Zhao等研究發(fā)現(xiàn)在長(zhǎng)期施用雞糞的農(nóng)田土壤樣品中觀察到磺胺類抗性基因與磺胺類藥物濃度之間存在顯著的相關(guān)性，表明磺胺類藥物可誘導(dǎo)ARGs的出現(xiàn)，并對(duì)土壤環(huán)境造成污染。常旭卉等對(duì)培養(yǎng)81 d的土樣進(jìn)行了定量分析，與添加了不含環(huán)丙沙星鴨糞的土壤相比，添加了含有環(huán)丙沙星鴨糞的土壤的和的絕對(duì)豐度顯著提高，而的絕對(duì)豐度反而顯著降低了，其原因可能是攜帶的土壤細(xì)菌在抗生素的作用下減少了。

5.2 糞便中重金屬對(duì)ARGs沉積效果的影響

除抗生素外，重金屬如Cu和Zn也是一種重要的飼料添加劑，對(duì)動(dòng)物健康生長(zhǎng)具有重要作用。當(dāng)重金屬添加過(guò)量時(shí)，也會(huì)被排泄并散布到土壤等環(huán)境中，形成重金屬污染。重金屬的存在為抗生素抗性提供了另一種共選擇壓力，從而促進(jìn)土壤中ARGs的形成和傳播。Lin等檢測(cè)了施重金屬糞肥的土壤中的重金屬含量及ARGs的豐度，結(jié)果顯示重金屬糞肥使用量越高，土壤中重金屬豐度和ARGs豐度越高，從而表明畜禽糞便中重金屬可促進(jìn)土壤中ARGs的沉積。張毓森等研究了分別施加豬糞和CuCl對(duì)土壤中的ARGs豐度的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)豬糞和CuCl均能顯著提高土壤中Cu、Zn、P和ARGs的含量，說(shuō)明豬糞的施加向土壤中引入了重金屬Cu、Zn和礦質(zhì)元素P，重金屬可能促進(jìn)了土壤中ARGs增殖擴(kuò)散，另一方面本研究也反應(yīng)了礦質(zhì)元素也可能是影響糞源ARGs在土壤中的沉積的環(huán)境因子。

6 結(jié)語(yǔ)與展望

家畜糞便可通過(guò)各種途徑進(jìn)入其他環(huán)境和食物鏈，最終威脅人類健康。據(jù)估計(jì)，到2050年，每年因抗生素耐藥性而死亡的人數(shù)將超過(guò)1 000×10人，在全世界造成約100×10美元的損失。糞源ARGs在土壤中的沉積具有一定的垂直分布規(guī)律，并且不同類別或種類的ARGs在土壤中沉積效果存在差異。雖然違禁藥物如萬(wàn)古霉素類和氯霉素早已被嚴(yán)禁用于動(dòng)物生產(chǎn)中，在未來(lái)的工作中，仍不能忽視對(duì)其抗性基因在土壤中污染狀況的監(jiān)控。