左氧氟沙星聯(lián)合小柴胡顆粒對(duì)小鼠抗菌止瀉的研究*

張五萍 伍錫棟 寇 光 侯雄軍

(1江西省人民醫(yī)院藥學(xué)部，南昌 330006)(2.江西省醫(yī)療器械檢測(cè)中心藥物安全性評(píng)價(jià)室，南昌 330006)

抗生素的濫用導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性不斷增加，超級(jí)耐藥性細(xì)菌也不斷出現(xiàn)，給腹瀉、痢疾性等感染性疾病的防控帶來(lái)了很多的困難[1-2]。腹瀉是多因素引起腸道在感染或非感染因素刺激下，腸黏膜出現(xiàn)發(fā)炎、腸分泌及運(yùn)動(dòng)功能亢進(jìn)，出現(xiàn)稀便和便頻等癥狀的疾病[3]。近年來(lái)腹瀉發(fā)病率不斷上升，嚴(yán)重影響人們的身體健康，左氧氟沙星組可用于病原微生物感染的肺炎、泌尿系統(tǒng)疾病的抗菌治療，但對(duì)細(xì)菌感染易產(chǎn)生耐藥性，小柴胡顆粒的主要成分為半夏、柴胡、甘草、人參、黃芩、生姜、大棗等，具有疏肝健脾和解少陽(yáng)、和胃降逆、扶正祛邪的功效。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，柴胡具有降血脂、保肝、改善腸道菌群紊亂等作用[4-5]。中醫(yī)理論認(rèn)為，肝臟具有主藏血、主疏泄解毒功能，小柴胡顆粒具有保肝功能，間接提示可以促進(jìn)肝臟血液循環(huán)，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)外來(lái)邪氣的耐受性和抵抗能力。

本研究旨在研究分析聯(lián)合本身具有抗菌作用的左氧氟沙星與小柴胡顆粒對(duì)大腸桿菌感染致腹瀉小鼠的抗菌和止瀉作用，從而減少大腸桿菌(E.coli)感染致腹瀉的小鼠對(duì)左氧氟沙星的依賴性使用，降低抗生素的耐藥性產(chǎn)生，為細(xì)菌性腹瀉臨床聯(lián)合用藥提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1主要試劑：小柴胡顆粒(廣西嘉進(jìn)藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)20190709)，鹽酸左氧氟沙星片(安徽萬(wàn)泰制藥有限公司，批號(hào)20190516)，營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(北京陸橋技術(shù)股份有限公司，批號(hào)200124)，營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(北京陸橋技術(shù)股份有限公司，批號(hào)200109)；大腸桿菌(E.coli)ATCC(批號(hào)160816)購(gòu)自于北京三藥科技開(kāi)發(fā)公司，由中國(guó)食品藥品檢定研究院監(jiān)制，目前保種于江西省醫(yī)療器械檢測(cè)中心。

1.1.2主要儀器:恒溫培養(yǎng)箱(HWS-150，天津泰斯特儀器有限公司)，生物安全柜(HR40，海爾儀器設(shè)備有限公司)，漩渦混合器(Vortex-KB3，海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司)。

1.1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：KM小鼠(SPF級(jí))，6—8周齡，體質(zhì)量(20±2)g，雌雄各半，購(gòu)自于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司【SCXK(湘)2019-0004】，飼養(yǎng)于IVC實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)籠具中【SCXK(贛)2018-0006】。自由飲食水。本試驗(yàn)通過(guò)江西省藥物研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批，審批號(hào)為P202105，符合動(dòng)物試驗(yàn)倫理要求。

1.2 方法

1.2.1菌液制備：將E.coli的菌株劃線平板，于37 ℃培養(yǎng)24 h，挑選典型的菌落培養(yǎng)于普通肉湯營(yíng)養(yǎng)瓊脂上，經(jīng)37 ℃培養(yǎng)24 h。連續(xù)傳代3次，取其菌落用普通肉湯制作菌懸液，用含1.5%蛋白胨的磷酸鹽緩沖液稀釋作為試驗(yàn)用菌。

1.2.2最小致死量的測(cè)定：(1)感染菌的制備：按無(wú)菌法操作，從上述制備好的菌液中采用麥?zhǔn)嫌?jì)數(shù)法制成分別為1012、1011、1010、109、108、107、106cfu/mL的不同濃度菌液。(2)動(dòng)物致死試驗(yàn)：取體質(zhì)量為(20±2)g KM小鼠70只，雌雄各半，隨機(jī)分為7組，每組10只，分別腹腔注射不同濃度的大腸桿菌細(xì)菌溶液，0.5 mL/只，觀察小鼠在7 d內(nèi)的死亡情況，確定最小致死量(MLD)，即感染后引起小鼠100%死亡的菌液濃度。

1.2.3體內(nèi)抗菌試驗(yàn)：另取體質(zhì)量為(20±2)g KM小鼠50只，雄雌各半，隨機(jī)分為5組，分別為模型組(給予生理鹽水)、空白組(給予生理鹽水)、左氧氟沙星組(8 mg/kg，小鼠給藥濃度計(jì)算參照《藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法》人體表面計(jì)算法)、小柴胡顆粒組(114 mg/kg)、聯(lián)合用藥組(左氧氟沙星組8 mg/kg+小柴胡顆粒組114 mg/kg)，每組10只。飼養(yǎng)于室溫(25±2)℃，相對(duì)濕度：65%±5%的IVC籠具中，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。禁食24 h，不禁水，除空白組外，其余各組小鼠分別腹腔注射大腸桿菌MLD濃度菌各0.5 mL/只，分別于1、6、12 h灌胃給藥1次，以后間隔24 h灌胃給藥1次，空白組與模型組灌胃給予0.9%生理鹽水，給藥組按照劑量濃度給予相應(yīng)藥物，灌胃體積均為0.2 mL/10 g。連續(xù)灌胃15 d，觀察、記錄動(dòng)物的存活情況，并計(jì)算保護(hù)率，即存活率=每組存活動(dòng)物數(shù)/每組動(dòng)物總數(shù)×100%。

1.2.4對(duì)大腸桿菌致腹瀉小鼠的影響[6]：昆明種小鼠 50 只，隨機(jī)分為5 組，即模型組(給予生理鹽水)、空白組(給予生理鹽水)、左氧氟沙星組(8 mg/kg)、小柴胡顆粒組(114 mg/kg)、聯(lián)合用藥組(左氧氟沙星組8 mg/kg+小柴胡顆粒組114 mg/kg)，每組10只，自由飲水。各組灌胃體積均為0.2 mL/10 g，給藥劑量見(jiàn)“1.4.3”項(xiàng)，空白組和模型組均給予0.9%生理鹽水，每日1次，連續(xù)給藥7 d，7 d后在小鼠腹腔內(nèi)注射大腸桿菌菌懸液(0.5 mL/只)，造成大腸桿菌感染致腹瀉小鼠模型，空白組腹腔注射等量的生理鹽水；3 h后空白組和模型組小鼠均灌胃生理鹽水，其余組分別灌胃給予相應(yīng)藥物，灌胃體積均為(0.2 mL/10 g)，觀察腹腔注射大腸桿菌注射液3 h內(nèi)小鼠腹瀉情況以及給藥3 h內(nèi)模型組和給藥組小鼠的腹瀉情況(包括稀便次數(shù)、總便次數(shù)、稀便級(jí)(表1)，觀察過(guò)程中及時(shí)更換濾紙，觀察完后處死動(dòng)物，解剖小鼠肝臟、腎臟、脾臟，根據(jù)結(jié)果并計(jì)算出腹瀉指數(shù)和臟器系數(shù)[7]。腹瀉率=腹瀉的動(dòng)物數(shù)/該組動(dòng)物數(shù)×100%，稀便率=每只動(dòng)物的稀便次數(shù)/大便的總次數(shù)(稀便以濾紙上有無(wú)污跡為標(biāo)準(zhǔn))，腹瀉指數(shù)=稀便率×稀便級(jí)，臟器系數(shù)=臟器質(zhì)量(g)/小鼠體質(zhì)量(g)×100%。

表1 污染直徑與稀便級(jí)數(shù)對(duì)照Table 1 The comparison of pollution diameter with the grade of defecation

1.2.5對(duì)大腸桿菌感染致腹瀉小鼠小腸推進(jìn)的影響[8-9]：KM小鼠50只，禁食24 h，不禁水，隨機(jī)分為5組，模型組、空白組、左氧氟沙星組、小柴胡顆粒組、聯(lián)合用藥組，每組10只，自由飲水。各組灌胃體積均為0.2 mL/10 g，給藥劑量見(jiàn)“1.4.3”項(xiàng)，空白組和模型組均給予0.9%生理鹽水，每日1次，連續(xù)給藥7 d，末次給藥前需禁食不禁水12 h，各實(shí)驗(yàn)組于末次給藥后30 min，空白組灌胃0.1 mL/10 g的炭末，其余組均腹腔注射大腸桿菌菌懸液(菌懸液0.5 mL/只，且同時(shí)灌胃炭末0.1 mL/10 g)，30 min后脫頸椎處死，取出小鼠的胃及小腸分離并鋪直至消化道，測(cè)量小腸總長(zhǎng)度及炭末在小腸的推進(jìn)距離，計(jì)算小腸推進(jìn)率。(小腸推進(jìn)率=炭末前沿至幽門(mén)距離/小腸全長(zhǎng)×100%)。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 大腸桿菌最小致死量測(cè)定

通過(guò)實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出大腸桿菌的最小致死量，即感染大腸桿菌后引起小鼠100%死亡的菌液濃度為1×1010cfu/mL(3號(hào)菌)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 大腸桿菌對(duì)小鼠的最小致死量(MLD)Table 2 The median lethal dose(MLD)of E.coli to mice

2.2 聯(lián)合用藥對(duì)感染模型動(dòng)物的影響

與模型組比較，左氧氟沙星組、小柴胡顆粒組和聯(lián)合用藥組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與小柴胡顆粒組比較，聯(lián)合用藥組具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與左氧氟沙星組比較，聯(lián)合用藥組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 聯(lián)合用藥對(duì)大腸桿菌感染致腹瀉小鼠的保護(hù)作用Table 3 The protective function of drugcombination in E.coli mice

2.3 聯(lián)合用藥對(duì)大腸桿菌致腹瀉小鼠的影響

小鼠注射大腸桿菌菌懸液3 h內(nèi)出現(xiàn)腹瀉癥狀，便次增多，便質(zhì)稀軟，精神萎靡，稀水樣便；3 h后給予相應(yīng)藥物治療，與模型組和小柴胡顆粒組比較，聯(lián)合用藥組腹瀉指數(shù)均具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，與左氧氟沙星組比較，聯(lián)合用藥組腹瀉指數(shù)均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與空白對(duì)照組比較，模型組具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；聯(lián)合用藥可以減輕大腸桿菌致腹瀉對(duì)小鼠臟器毒性的影響，可提高免疫臟器系數(shù)，與模型組、空白對(duì)照組、左氧氟沙星組和小柴胡顆粒組比較，聯(lián)合用藥胸腺臟器系數(shù)和脾臟臟器系數(shù)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與空白對(duì)照組比較，聯(lián)合用藥組肝臟和腎臟臟器系數(shù)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見(jiàn)表4、表5。

表4 聯(lián)合用藥對(duì)大腸桿菌所致小鼠腹瀉指數(shù)的比較Table 4 The comparison of diarrhea index of mice induced by Escherichia coli by combination of drugs

表5 聯(lián)合用藥對(duì)小鼠臟器系數(shù)的影響Table 5 The effect of combination medication on organ coefficient of mice

2.4 聯(lián)合用藥對(duì)大腸桿菌致腹瀉小鼠的小腸推進(jìn)率的影響

聯(lián)合用藥對(duì)大腸桿菌感染小鼠小腸的推進(jìn)率影響結(jié)果見(jiàn)表6。由表6可知，與模型組比較，聯(lián)合用藥組小腸推進(jìn)率具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，與左氧氟沙星組和小柴胡顆粒組比較，聯(lián)合用藥組均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與空白組比較具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與空白組比較，模型組具有極其顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，表明聯(lián)合用藥可以抑制大腸桿菌感染小鼠的小腸推進(jìn)速度。

表6 聯(lián)合用藥對(duì)大腸桿菌感染小鼠小腸推進(jìn)率的影響Table 6 The influence of combination medication on intestinal propulsion rate of mice infectedwith Escherichia coli

3 結(jié)論

感染性腹瀉為臨床常見(jiàn)腹瀉，例如細(xì)菌、真菌等感染，細(xì)菌性感染腹瀉易造成腸道粘膜受損，腸道菌群失調(diào)等功能炎癥，嚴(yán)重的甚至?xí)斐蓹C(jī)體臟器代謝等功能的減弱。臨床治療腹瀉一般以針對(duì)引起感染的病原體抗感染治療為主，如采用左氧氟沙星進(jìn)行抗菌治療，但單純的抗生素治療容易導(dǎo)致細(xì)菌的耐藥性，影響療效。在中醫(yī)學(xué)上腹瀉類(lèi)似于泄瀉，是指以排便次數(shù)增多，糞質(zhì)清、稀為特征的疾病[10]，脾虛濕盛、脾胃陽(yáng)虛是其中的一種病因。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，泄瀉病變主要在脾胃，尤其與脾的運(yùn)化功能失調(diào)關(guān)系密切，治療上總以運(yùn)脾化濕為基本原則[11]。小柴胡顆粒是由柴胡、半夏、人參、甘草、黃芩、生姜、大棗等成分組成，現(xiàn)代藥理學(xué)研究柴胡入肝膽經(jīng)，疏達(dá)經(jīng)氣，具有抗腫瘤、抗炎、解熱、保肝和免疫調(diào)節(jié)等作用；法夏具有和胃降逆的功效；黃芩具有清泄邪熱、抗炎、抗菌等功效；炙甘草、人參可扶助正氣，抵抗病邪；大棗、生姜和胃氣[12-13]，方中諸藥合作，達(dá)到抗菌、抗炎和提高免疫力等作用。

本研究通過(guò)挖掘小柴胡顆粒能保肝、抗炎和提高機(jī)體免疫能力的功效[14]，研究聯(lián)合抗菌藥物左氧氟沙星對(duì)大腸桿菌感染致腹瀉小鼠的抗菌和止瀉作用，探索聯(lián)合用藥是否可以提高大腸桿菌感染致腹瀉小鼠的療效，間接減少抗生素的使用，降低細(xì)菌的耐藥性產(chǎn)生。唐小云等[15]研究發(fā)現(xiàn)小柴胡顆?？梢哉{(diào)節(jié)免疫抑制小鼠的外周血淋巴細(xì)胞，可刺激CD28、CD80和CD86的表達(dá)而調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能。王軍等[16]研究發(fā)現(xiàn)小柴胡顆粒可以提高血清IL-2、IL-6和TNF-α水平，提高機(jī)體免疫力。上述文獻(xiàn)均表明小柴胡顆粒可以通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)細(xì)菌感染的耐受性，提高生存率。本研究在體內(nèi)抗菌實(shí)驗(yàn)中，左氧氟沙星聯(lián)合小柴胡顆?？梢越档痛竽c桿菌感染致腹瀉小鼠的死亡率，與左氧氟沙星組和小柴胡顆粒組比較，均有明顯的提高(P<0.05)，提示小柴胡顆粒對(duì)大腸桿菌致腹瀉小鼠具有很好的保護(hù)作用，其作用可能與小柴胡顆粒提高免疫力等綜合作用有關(guān)，改善了大腸桿菌感染致腹瀉小鼠的腹瀉癥狀，產(chǎn)生了抗菌作用，提高了小鼠機(jī)體免疫力，從而加強(qiáng)了對(duì)細(xì)菌嚴(yán)重病變的抵抗性。也有文獻(xiàn)報(bào)道小柴胡顆?？梢詼p輕肝纖維化小鼠血清中的ALT、AST水平，減輕肝臟病理學(xué)損傷程度[17]，王麗敏等[18]研究發(fā)現(xiàn)小柴胡顆粒能抑制CFA大鼠血清細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6及MCS-F的表達(dá)，改善CFA大鼠的一般癥狀和炎癥程度，吳山永等[19]研究發(fā)現(xiàn)小柴胡顆?？梢蕴岣邫C(jī)體內(nèi)腸道乳桿菌、雙岐桿菌等菌群水平，調(diào)節(jié)胃腸道功能，保護(hù)菌群和腸道粘膜受損。在對(duì)腹瀉指數(shù)和炭末推進(jìn)實(shí)驗(yàn)中，聯(lián)合用藥可以降低大腸桿菌感染致腹瀉小鼠的腹瀉指數(shù)和炭末推進(jìn)率，提高小鼠胸腺臟器系數(shù)和脾臟臟器系數(shù)，與模型組、空白組、左氧氟沙星組和小柴胡顆粒組比較，聯(lián)合用藥胸腺臟器系數(shù)和脾臟臟器系數(shù)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，同時(shí)結(jié)果提示聯(lián)合用藥可減輕肝臟和腎臟的代謝負(fù)擔(dān)(與模型組比較，聯(lián)合用藥肝臟和腎臟臟器系數(shù)均有提高，與空白組比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05))，從而更好地發(fā)揮其生理供能，改善小鼠腹瀉癥狀等，給予藥物治療后，小鼠腹瀉癥狀均得到明顯改善，表現(xiàn)為大便次數(shù)減少，便質(zhì)由稀轉(zhuǎn)干，精神狀態(tài)漸好，飲食水狀態(tài)改善，且與模型組和小柴胡顆粒組比較，聯(lián)合用藥腹瀉指數(shù)均具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，與左氧氟沙星組比較，聯(lián)合用藥腹瀉指數(shù)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與空白組比較，模型組均具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)果間接提示聯(lián)合用藥對(duì)細(xì)菌致腹瀉小鼠的胃腸粘膜損傷等具有保護(hù)作用，或運(yùn)脾水濕等作用，同時(shí)結(jié)果進(jìn)一步提示其產(chǎn)生抗菌及胃腸保護(hù)作用可能與改善修復(fù)胃腸道粘膜、調(diào)節(jié)腸道菌群水平、改善肝臟等臟器功能及提高機(jī)體免疫系統(tǒng)有關(guān)，從而減輕或者治療細(xì)菌感染致腹瀉的癥狀，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，聯(lián)合用藥可以多方面達(dá)到藥物的聯(lián)合作用效果，中西藥協(xié)同作用[20]，充分挖掘中藥的聯(lián)合作用，減少抗生素的使用，從而降低細(xì)菌的耐藥性產(chǎn)生，本研究結(jié)果將為細(xì)菌性腹瀉臨床聯(lián)合用藥提供數(shù)據(jù)參考和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。