破壁油菜花粉的抗氧化及抗衰老作用

方歡樂，張 潔，趙玉文，韓寧娟，王衛(wèi)東，李 元,

（1.西安培華學(xué)院醫(yī)學(xué)院，陜西西安 710125；2.陜西康泰萊生物醫(yī)藥工程有限公司，陜西西安 710065）

油菜花粉是人們公認(rèn)的天然健康食品，其中富含酚類、黃酮類、脂肪酸、維生素和無機(jī)元素等物質(zhì)[1]，具有抗疲勞、降血脂、抑制前列腺增生、促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)功能等多種作用[2]。油菜花粉其中含有的豐富黃酮類物質(zhì)具有很好的清除機(jī)體自由基（·OH、O2-·、DPPH·等）作用[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)，破壁技術(shù)可以使蜂花粉內(nèi)豐富營養(yǎng)成分充分釋放，其中抗氧化成分總黃酮及黃酮類化合物的生物利用度明顯提升[5-6]。

衰老是生命體發(fā)展的必然選擇趨勢，其受多種因素調(diào)控，目前關(guān)于衰老的理論主要有自由基氧化應(yīng)激學(xué)說、DNA 損傷學(xué)說、細(xì)胞凋亡學(xué)說等[7]。多項(xiàng)研究表明，Sirt1（沉默信息調(diào)節(jié)因子2 相關(guān)酶1）可抑制細(xì)胞凋亡，激活負(fù)調(diào)節(jié)促凋亡因子如p53 來增加氧化應(yīng)激的對抗性調(diào)控新陳代謝，延緩細(xì)胞的衰老。因此Sirt1 在抗衰老方面的重要作用引起人們關(guān)注[8]。Bax 蛋白是一種促進(jìn)細(xì)胞凋亡的蛋白，其蛋白表達(dá)也能一定程度反應(yīng)組織的衰老情況[9]。

目前關(guān)于破壁油菜花粉的研究主要是探討破壁技術(shù)的方法及其對主要成分的影響，王偉等[10-11]研究破壁油菜花粉在體抗氧化作用表明其具有良好的在體抗氧化活性。但破壁油菜花粉是否可以通過抗氧化改善衰老作用，目前未見報(bào)道。本研究建立D-半乳糖衰老模型[12]觀察破壁油菜花對機(jī)體血清及肝臟勻漿液中抗氧化指標(biāo)SOD、MDA、GSH-Px、CAT的變化，同時(shí)研究破壁油菜花是否具有通過抗氧化作用抑制肝臟中Bax 蛋白表達(dá)，調(diào)節(jié)Sirt1 蛋白含量對抗p53 途徑的凋亡通路，從而延緩組織衰老。本研究可為破壁油菜花粉保健產(chǎn)品的研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

SD 小鼠48 只 雄性，體重（25±2） g，清潔級，購買于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心，動物質(zhì)量合格證號：SCXK（陜）2012-003；破壁油菜花粉 陜西康泰萊生物醫(yī)藥工程有限公司；VC注射液 華潤雙鶴利民藥業(yè)（濟(jì)南）有限公司；D-半乳糖粉劑 上海國藥集團(tuán)；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性檢測試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）活性檢測試劑盒、過氧化氫酶（Catalase，CAT）活性檢測試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活性檢測試劑盒、BCA蛋白定量檢測試劑盒 南京建成生物工程研究所；多克隆第一抗體Sirt1、p53、bax 及GAPDH 抗體 由Abcam 公司提供。

H-1600A 型高速離心機(jī) 上海利鑫堅(jiān)離心機(jī)有限公司；超聲波組織粉碎儀 南京先歐儀器制造有限公司；HH-2 數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州中捷實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司；1510 酶標(biāo)儀 Thermo 公司；PowerPactmBasic 電泳設(shè)備、Universal Hood III 發(fā)光設(shè)備 美國Bio-Red 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 破壁油菜花粉混懸液的制備 分別稱取相應(yīng)質(zhì)量的破壁油菜花粉，加超純水混懸制備為所需濃度。置于試劑瓶中，4 ℃冷藏保存待用。

1.2.2 動物分組、造模及給藥處理 SD 小鼠隨機(jī)分為6 組，每組8 只，分別為空白對照組、衰老模型組、破壁油菜花粉低劑量組（140 mg/kg）、中劑量組（280 mg/kg）、高劑量組（560 mg/kg）和VC組（100 mg/kg）。動物研究獲西安培華學(xué)院動物保護(hù)與使用委員會批準(zhǔn)。所有動物實(shí)驗(yàn)均按照實(shí)驗(yàn)動物機(jī)構(gòu)指南進(jìn)行。藥物給藥劑量根據(jù)臨床常用劑量，按照人和動物間體表面積折算的等效劑量比值進(jìn)行換算[13]，并結(jié)合文獻(xiàn)資料報(bào)道的破壁油菜花粉抗氧化小鼠給藥劑量設(shè)計(jì)[10]。動物適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，除空白對照組外的各組每日腹腔注射D-半乳糖（120 mg/kg）造模，空白對照組每日腹腔注射生理鹽水，同時(shí)破壁油菜花粉各組和VC組分別灌胃不同劑量破壁油菜花粉混懸液及VC溶液，空白對照組及衰老模型組灌胃等容積生理鹽水。連續(xù)給藥六周。

1.2.3 指標(biāo)測定

1.2.3.1 小鼠行為活動觀察和體重檢測 在實(shí)驗(yàn)期間，每天觀察和記錄各組小鼠的食欲、外表、精神狀況和行為活動。每周稱重1次，繪制小鼠體重變化曲線圖。

1.2.3.2 臟器指數(shù)測定 采血后立即脫頸椎處死小鼠，置于冰塊上取出胸腺、肝臟、腎和脾臟。用4 ℃生理鹽水多次沖洗，濾紙吸干水分，稱重，計(jì)算臟器指數(shù)。臟器指數(shù)（mg/g）=臟器質(zhì)量（mg）/體質(zhì)量（g）。

1.2.3.3 血清及肝臟生化指標(biāo)檢測 末次給藥禁食不禁水12 h 后，眼球取血，3500 r/min 離心20 min后，分離血清。取小鼠部分肝臟加冰浴過的生理鹽水制備10%的肝組織勻漿2 mL，12000 r/min 低溫離心10 min，分離上清液。采用試劑盒測定小鼠血清及肝臟勻漿液中SOD、MDA、GSH-Px、CAT 含量。

1.2.3.4 肝臟組織切片觀察 取小鼠部分肝臟組織，10%甲醛溶液固定，石蠟包埋、切片，HE 染色。生物顯微鏡下觀察、拍照。

1.2.3.5 Western Blot 檢測肝臟組織中衰老蛋白表達(dá)取-80 ℃保存的肝臟組織，裂解，12000 r/min，4 ℃離心10 min。取上清液蛋白定量，剩余與5× loading buffer 混合，恒溫金屬浴100 ℃變性10 min 后保存?zhèn)溆?。?% SDS-多聚酰胺凝膠電泳分離，濕法轉(zhuǎn)移蛋白到PVDF 膜上。膜用5%脫脂牛奶溶液室溫封閉1 h，分別加入特異性一抗bax（1:500）、Sirt1（1:500）、p53（1:500）、GAPDH（1:2000）孵育，4 ℃過夜。用TBST 洗膜5次后與二抗結(jié)合（抗鼠或抗兔1:5000）室溫孵育1 h 后，TBST 洗膜5次。發(fā)光，照片用Gel-Pro Analyzer 4.0 software 分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）雙側(cè)t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有顯著性，P＜0.01 為差異具有極顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 破壁油菜花粉對D-半乳糖衰老小鼠體重的影響

體重是反映小鼠的生長情況的一個重要指標(biāo)。由表1所示，衰老模型組小鼠隨著造模后體質(zhì)量增加緩慢，食欲差、皮膚松弛、活動量明顯減少等現(xiàn)象，提示衰老模型組小鼠出現(xiàn)衰老癥狀。破壁油菜花粉各組小鼠體重不斷增加，小鼠皮膚狀態(tài)及活動量有所改善。進(jìn)一步從表1 數(shù)據(jù)分析得出，和衰老模型組比較，破壁油菜花中、高劑量組給藥14 d 后小鼠體重均顯著增加（P＜0.05，P＜0.01），低劑量組在32 d 后體重也在增加（P＜0.05）。表明破壁油菜花粉可改善小鼠體重及活動對抗衰老。

表1 破壁油菜花粉對衰老小鼠體質(zhì)量的影響（g, n=8）Table 1 Effect of wall broken rape pollen on body mass of aging mice (g, n=8)

2.2 破壁油菜花粉對D-半乳糖衰老小鼠臟器指數(shù)的影響

臟器系數(shù)的變化可反映器官或組織結(jié)構(gòu)的變化，由表2可知，與空白對照組相比，衰老模型組小鼠的肝臟、腎臟、脾臟、胸腺的臟器指數(shù)呈極顯著下降趨勢（P＜0.05，P＜0.01），表明衰老小鼠的肝、腎及免疫器官功能出現(xiàn)萎縮。與衰老模型組相比，破壁油菜花粉中、高劑量組小鼠的肝臟、脾臟、胸腺、腎臟的臟器指數(shù)均顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）。從數(shù)據(jù)結(jié)果可看出破壁油菜花粉對D-半乳糖誘發(fā)的小鼠臟器衰老有一定的改善作用。

表2 破壁油菜花粉對衰老小鼠臟器指數(shù)的影響（mg/g, n=8）Table 2 Effect of wall broken rape pollen on organ index of aging mice (mg/g, n=8)

2.3 破壁油菜花粉對D-半乳糖衰老小鼠血清中SOD、MDA、GSH-Px 及CAT 活性的影響

大量研究表明，自由基及其誘導(dǎo)的氧化反應(yīng)可導(dǎo)致機(jī)體的衰老[14]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明與空白對照組相比，衰老模型組小鼠血清SOD、CAT、GSH-Px 含量極顯著降低（P＜0.01），MDA 含量極顯著升高（P＜0.01）。與衰老模型組相比，中、高劑量破壁油菜花粉組SOD、GSH-Px 含量極顯著升高（P＜0.01），MDA 含量極顯著減小（P＜0.01），CAT 含量中劑量組顯著升高（P＜0.05）、高劑量組極顯著升高（P＜0.01），結(jié)果見表3。

2.4 破壁油菜花粉對D-半乳糖衰老小鼠肝臟中SOD、MDA、GSH-Px 及CAT 活性的影響

由表4 可以看出，與空白對照組相比，衰老模型組小鼠的肝臟中SOD、CAT、GSH-Px 活性極顯著降低，MDA 含量極顯著增加（P＜0.01）。與衰老模型組相比，破壁油菜花粉中、高劑量組可顯著提高小鼠肝臟中SOD、CAT、GSH-Px 含量，降低MDA 含量（P＜0.05，P＜0.01）。有研究表明機(jī)體正常情況下處于一種氧化與抗氧化的動態(tài)平衡當(dāng)中，衰老機(jī)體產(chǎn)生大量自由基誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA 的生成，而同時(shí)機(jī)體中重要的抗氧化酶含量下降，因此清除自由基抑制機(jī)體氧化反應(yīng)可改善衰老[15]。表3～表4 結(jié)果顯示衰老模型組小鼠體內(nèi)MDA 含量增加，抗氧化酶SOD、CAT、GSH-Px 含量極顯著下降（P＜0.01）。破壁油菜花粉能明顯抑制血清及肝臟中MDA 含量，增加SOD、CAT、GSH-Px 含量，表現(xiàn)出較好的抗氧化、保護(hù)肝臟、抗衰老的作用。

表3 破壁油菜花粉對衰老小鼠血清SOD、MDA、GSH-Px、CAT 活性的影響（n=8）Table 3 Results of wall broken rape pollen on serum SOD, MDA, GSH-Px and CAT activities of aging mice (n=8)

表4 破壁油菜花粉對衰老小鼠肝臟SOD、MDA、GSH-Px、CAT 活性檢測結(jié)果（n=8）Table 4 Detection results of SOD, MDA, GSH-Px and CAT activities of wall broken rape pollen on liver of aging mice (n=8)

2.5 破壁油菜花粉對D-半乳糖衰老小鼠肝臟的影響

隨著衰老的發(fā)生，肝臟老化質(zhì)量明顯減少，肝臟功能及其結(jié)構(gòu)也會發(fā)生變化[16]。本研究進(jìn)一步通過HE 染色觀察肝臟結(jié)構(gòu)的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)空白對照組小鼠肝臟細(xì)胞排列緊密，胞核清晰；衰老模型組小鼠肝臟細(xì)胞疏松腫脹，排列紊亂，胞質(zhì)受損。藥物組有所改善，其中破壁油菜花粉中、高劑量組小鼠肝細(xì)胞細(xì)胞形態(tài)逐漸趨于正常，細(xì)胞損傷情況得到有效緩解。表明破壁油菜花粉對衰老的肝臟具有一定的保護(hù)作用。結(jié)果見圖1所示。

圖1 各組小鼠肝臟光鏡下病理形態(tài)學(xué)改變（HE 200×）Fig.1 Pathomorphological changes of liver of mice in each group under light microscope （HE 200×）

2.6 破壁油菜花粉對D-半乳糖衰老小鼠肝臟Sirt1、Bax、p53 蛋白表達(dá)的影響

研究顯示Sirt1 的激活對衰老調(diào)節(jié)因子p53 有明顯的抑制作用，從而減少細(xì)胞凋亡，延緩衰老[17]。本研究結(jié)果如圖2所示，與空白對照組相比，衰老模型組小鼠的肝臟中Sirt1 蛋白量極顯著降低（P＜0.01），Bax、p53 蛋白表達(dá)量極顯著增加（P＜0.01），與衰老模型組相比，破壁油菜花中、高劑量組能顯著地提高肝組織Sirt1 蛋白表達(dá)（P＜0.05，P＜0.01），降低Bax、p53 蛋白表達(dá)（P＜0.01）。這表明破壁油菜花粉可通過調(diào)控衰老蛋白Sirt1、p53 含量，抑制促細(xì)胞凋亡基因Bax表達(dá)量的增多，對抗機(jī)體衰老。

圖2 破壁油菜花對衰老模型小鼠肝臟Bax、Sirt1、p53 蛋白表達(dá)的影響（n=3）Fig.2 Effect of wall broken rape flower on the expression of Bax, Sirt1 and p53 proteins in liver of aging model mice (n=3)

3 討論

衰老是隨著機(jī)體年齡的增長，臟器萎縮、機(jī)體功能衰退的生命過程中一種自然現(xiàn)象[18]。體內(nèi)SOD、GSH-Px、CAT 抗氧化酶，有很好的抗氧化，對抗機(jī)體 自由基破壞的作用。而隨著衰老的發(fā)生，機(jī)體氧化還原系統(tǒng)變得不平衡，清除自由基的SOD、CAT、GSHPx 等內(nèi)源性抗氧化酶活性降低而脂質(zhì)氧化產(chǎn)物MDA 含量增多，引發(fā)細(xì)胞損傷、組織器官紊亂[19-20]。研究衰老最普遍的模型為給正常小鼠注射大劑量的D-半乳糖，引起機(jī)體氧化反應(yīng)產(chǎn)生大量氧自由基等出現(xiàn)衰老癥狀，同時(shí)其還可在機(jī)體酶的作用下轉(zhuǎn)化為半乳糖醇堆積，導(dǎo)致機(jī)體功能障礙及衰老[21]。

油菜花粉是油菜精華的濃縮，營養(yǎng)成分豐富，具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等功效，通過破壁技術(shù)可使其營養(yǎng)成分充分釋放[22]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示衰老模型組小鼠的體質(zhì)量明顯下降，重要臟器胸腺、脾、肝臟、腎臟的臟器指數(shù)均下降，出現(xiàn)機(jī)體衰老癥狀。而破壁油菜花粉中、高劑量組小鼠體質(zhì)量明顯改善，各臟器的臟器指數(shù)均增大，表明破壁油菜花粉可保護(hù)臟器對D-半乳糖所致的衰老現(xiàn)象有一定的延緩發(fā)展作用。由于衰老小鼠體內(nèi)自由基防御系統(tǒng)損傷[23]，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步測定了血清中CAT、GSH-Px、MDA、SOD 含量來研究機(jī)體的衰老狀況。結(jié)果顯示衰老模型組MDA 含量增多，SOD、CAT、GSH-Px 含量降低，其體內(nèi)氧化與抗氧化動態(tài)平衡被打破。破壁油菜花粉中、高劑量組SOD、CAT、GSH-Px 含量明顯增加，MDA 含量降低。表明破壁油菜花粉可以改善D-半乳糖所致氧化應(yīng)激反應(yīng)。

肝臟是物質(zhì)代謝的主要器官，也是個體衰老中最易受累的器官[24]。本研究進(jìn)一步觀察了小鼠肝臟的變化發(fā)現(xiàn)伴隨衰老，模型組出現(xiàn)肝臟臟器指數(shù)的下降同時(shí)肝臟中SOD、CAT、GSH-Px 降低，MDA 含量增加，肝臟細(xì)胞之間出現(xiàn)萎縮、損傷等情況，但是破壁油菜花中、高劑量組得到很大改善，肝臟指數(shù)增加，肝臟中抗氧化酶含量提高，肝細(xì)胞趨于正常。表明其可以改善肝臟的功能，提高機(jī)體抵抗力，抗氧化對抗衰老。

研究顯示機(jī)體發(fā)生自由基氧化應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致衰老同時(shí)伴隨著細(xì)胞凋亡速度加快，多種衰老組織中均發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡蛋白Bax 的表達(dá)異常，引發(fā)細(xì)胞增殖減慢[25]。大量研究顯示Sirt1與p53基因可通過改善細(xì)胞凋亡參與衰老過程的調(diào)節(jié)[26]，Sirt1可通過抑制細(xì)胞凋亡，延緩細(xì)胞衰老，在衰老研究的發(fā)展起到了重要作用。p53 是最早發(fā)現(xiàn)的Sirt1 生理產(chǎn)物，是抑癌基因也參與細(xì)胞衰老過程[27]。本研究進(jìn)一步觀察了衰老小鼠肝臟內(nèi)衰老基因表達(dá)，結(jié)果衰老基因Sirt1 蛋白表達(dá)顯著降低，p53 蛋白表達(dá)升高，同時(shí)伴隨凋亡蛋白Bax 增多。破壁油菜花粉中、高劑量可以調(diào)節(jié)衰老基因蛋白表達(dá)，改善細(xì)胞凋亡，對抗機(jī)體衰老。

4 結(jié)論

本文研究了破壁油菜花粉對D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老小鼠抗氧化，改善衰老的作用機(jī)制。結(jié)果顯示破壁油菜花粉可以調(diào)節(jié)體內(nèi)血清及肝臟中氧化酶的活性，表現(xiàn)出很好的抗氧化作用，可對抗衰老小鼠體重減輕、臟器損傷，保護(hù)肝臟。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)破壁油菜花粉抗衰老的作用機(jī)理可能與激活肝臟Sirt1/p53 信號通路，抑制肝臟Bax 細(xì)胞凋亡有關(guān)。此研究可為破壁油菜花粉研制成抗氧化、抗衰老功效的保健品，用于預(yù)防疾病等研究提供理論依據(jù)。但破壁油菜花粉抗衰老保健品人體長期服用的安全性與保健功效還有待于進(jìn)一步深入研究，下一步可開展破壁油菜花粉保健品長期服用的安全性試驗(yàn)研究?？傊?，破壁油菜花粉的開發(fā)對防治衰老疾病，提高人們生活質(zhì)量水平有重要意義。