增強(qiáng)型固相萃取凈化-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定鱸魚中18 種磺胺類藥物的殘留量

王東鵬，葉 誠(chéng)

（武漢海關(guān)技術(shù)中心，湖北武漢 430050）

磺胺類藥物（sulfonamides，SAS）是含有對(duì)氨基苯磺酰胺結(jié)構(gòu)的人工合成的抗菌藥物[1-2]，因抗菌譜廣[3]、抗菌效應(yīng)強(qiáng)、成本低[4]以及化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)而廣泛應(yīng)用于臨床及畜牧業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)[5-6]。然而，磺胺類藥物在體內(nèi)代謝緩慢，長(zhǎng)期大量使用容易導(dǎo)致該類藥物在動(dòng)物體內(nèi)殘留，進(jìn)一步通過食物鏈在人體內(nèi)蓄積，引發(fā)腎毒性、胃腸道出血、再生障礙性貧血[7]、過敏反應(yīng)、以及細(xì)菌耐藥性和致癌性等[4,8-10]，嚴(yán)重危害人類健康。許多國(guó)家對(duì)動(dòng)物源性食品中磺胺類藥物的最大殘留量有明確規(guī)定，國(guó)際食品法典委員會(huì)（Codex Alimentarius Commission，CAS）規(guī)定動(dòng)物源性食品中磺胺類藥物最大殘留量為100 μg/kg[11]。我國(guó)在GB31650-2019《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中獸藥最大殘留限量》中規(guī)定，除牛奶外，動(dòng)物源性食品中磺胺類藥物最大殘留量為100 μg/kg[12]。值得注意的是，盡管多個(gè)國(guó)家和地區(qū)明確規(guī)定磺胺類藥物的最大殘留量，但農(nóng)戶為追求更高的商業(yè)價(jià)值，磺胺類藥物的濫用現(xiàn)象仍然存在。因此，建立高效、準(zhǔn)確、快速的磺胺類藥物檢測(cè)方法對(duì)食品安全至關(guān)重要。

目前，高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、毛細(xì)管電泳法、高效液相色譜法、放射性免疫法、免疫傳感器法、酶聯(lián)免疫吸附法和膠體金免疫層析法是磺胺類抗菌藥物常用的檢測(cè)方法[4,13]，高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法因具有靈敏度高、準(zhǔn)確性好等優(yōu)點(diǎn)，是目前動(dòng)物源性食品中抗生素殘留最主要的檢測(cè)方法。樣品前處理方法直接影響檢測(cè)結(jié)果，磺胺類藥物常用的提取溶劑為乙腈、二氯甲烷或混合溶劑，在提取溶劑中加入酸或堿可增加提取效果。QuEChERS 凈化法[14]、固相萃取法[15-16]、固相微萃取法、基質(zhì)固相分散法[17]、加壓液體萃取法、免疫親和色譜法[18]和液液萃取法[19]是常用的提取方法。動(dòng)物源性食品常含有大量脂肪、蛋白質(zhì)等大分子化合物，對(duì)樣品檢測(cè)干擾較大，傳統(tǒng)的前處理方法操作復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)、溶劑消耗大，提取液中較高含量的脂肪和蛋白質(zhì)仍然是其主要缺點(diǎn)[19]，新型增強(qiáng)型脂質(zhì)去除凈化柱（Captiva EMRLipid）通過體積排阻和疏水作用，可有效地去除脂質(zhì)，最大程度地減少分析物的流失，方法的可靠性和耐用性顯著提高。目前增強(qiáng)型脂質(zhì)去除固相萃取凈化柱在動(dòng)物源性食品中磺胺類藥物檢測(cè)中應(yīng)用較少。

本研究擬采用新型增強(qiáng)型脂質(zhì)去除固相萃取柱結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法建立鱸魚中18 種磺胺類抗菌藥物高效、靈敏、快速的檢測(cè)方法，旨在為鱸魚等動(dòng)物源性食品中磺胺類抗菌藥物的快速檢測(cè)提供新的依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大口黑鱸魚樣品 購(gòu)于超市；磺胺醋酰、磺胺對(duì)甲氧嘧啶、磺胺吡啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲噻二唑、磺胺噻唑、磺胺氯噠嗪、磺胺甲噁唑、磺胺異噁唑、磺胺嘧啶、磺胺喹惡啉、磺胺間二甲氧嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺鄰二甲氧嘧啶、磺胺苯吡唑、苯甲?；前罚舛?00 μg/mL） 天津阿爾塔科技有限公司；甲氧芐啶（濃度100 μg/mL）北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司；2 種內(nèi)標(biāo)（磺胺間二甲氧嘧啶-D6 和磺胺鄰二甲氧嘧啶-D3） 純度≥98.9%，上海安譜璀世標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司；甲醇色譜純，武漢弗頓控股有限公司；乙酸乙酯 色譜純，美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司；乙腈 色譜純，美國(guó)Honeywell 公司；甲酸銨 色譜純，德國(guó)CNW 公司；甲酸 分析純，廣東光華科技股份有限公司；氯化鈉、無水硫酸鈉 分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；實(shí)驗(yàn)用水 為超純水。

Agilent1200 高效液相色譜儀配二元高壓泵、自動(dòng)進(jìn)樣器和柱溫箱，Captiva EMR-Lipid 3 mL/300 mg固相萃取柱 美國(guó)Agilent 公司； Poly-Sery MCX 3 mL/60 mg 固相萃取柱、CNW Athena C18-WP 色譜柱（2.1 mm×100 mm，3 μm） 德國(guó)CNW 公司；AB SCIEX API 4000Q 質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)配電噴霧離子源（ESI） 美國(guó)AB SCIEX 公司；Neofuge1600R 臺(tái)式冷凍離心機(jī) 上海力申科學(xué)儀器有限公司；BS210S萬分之一電子天平 德國(guó)賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；DMT-2500 渦旋振蕩儀 杭州米歐儀器有限公司；HGC-24A 氮?dú)獯蹈蓛x 天津恒奧科技發(fā)展有限公司；KQ-500 超聲波清洗儀 昆山市超聲儀器有限公司；優(yōu)普超純水制造系統(tǒng) 四川優(yōu)普超純科技有限公司；GM200 刀式搗磨儀 德國(guó)RETSCH 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制 準(zhǔn)確移取18 種磺胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（100 μg/mL）各1 mL，用10%甲醇水溶液定容至10 mL，配制成濃度為10 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)中間液。移取各標(biāo)準(zhǔn)中間液1 mL，用10%甲醇水溶液配制成濃度為1 μg/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液。此外，配制1 μg/mL 磺胺間二甲氧嘧啶-D6 和磺胺鄰二甲氧嘧啶-D3 內(nèi)標(biāo)工作液。用10%甲醇水溶液逐級(jí)稀釋配制成質(zhì)量濃度為5、10、20、50、100、200 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，同時(shí)，在每個(gè)濃度點(diǎn)添加50 μL 內(nèi)標(biāo)工作液，內(nèi)標(biāo)濃度為10 ng/mL。

1.2.2 樣品前處理 取鱸魚去鱗去鰓后，清洗干凈取鱸魚可食用肌肉部位，用刀式搗磨儀充分混勻粉碎。精密稱取魚肉樣品5 g 于50 mL 離心管中，加入50 μL內(nèi)標(biāo)工作液，加入10 mL 乙腈溶液（含1%甲酸），再渦旋2 min，加入1 g 氯化鈉和4 g 無水硫酸鈉，渦旋5 min，振蕩30 min，超聲15 min，8500 r/min 離心5 min，取上清液于另一50 mL 離心管。

取2 mL 上清液過增強(qiáng)型脂質(zhì)去除凈化柱，重力自流，收集流出液，在45℃水浴下氮吹至近干，用10%甲醇水溶液定容至1 mL，過0.22 μm 微孔濾膜,待測(cè)。

1.2.3 色譜條件 色譜柱：CNW Athena C18-WP（2.1 mm×100 mm，3 μm）；流動(dòng)相A 為0.1%甲酸水溶液，B 為甲醇；流速為0.3 mL/min；進(jìn)樣體積為10 μL；柱溫30 ℃；洗脫梯度：0～0.5 min，90% A；0.5～2.0 min，90%～60% A；2.0～11.0 min，60%～10% A；11.0～11.1 min，10%～90% A；11.1～15.0 min，90% A。

1.2.4 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI）；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（multiple reaction monitoring，MRM）；正離子模式；離子源溫度（TEM）：500 ℃；氣簾氣（CUR）10 psi；噴霧電壓（IS）5000 V；霧化氣40 psi；輔助氣50 psi。其他參數(shù)見表1。

表1 18 種磺胺類藥物和內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectrum parameters of 18 sulfonamides and internal standard

1.2.5 線性范圍、檢出限與定量限測(cè)定 配制質(zhì)量濃度為5、10、20、50、100、200 ng/mL 的標(biāo)準(zhǔn)工作液，分別以進(jìn)樣濃度X（ng/mL）和峰面積Y 為橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算回歸方程和相關(guān)系數(shù)。以信噪比為3（S/N=3）作為檢出限（limits of detection，LOD），以信噪比為10（S/N=10）作為定量限（limits of quantification，LOQ）。

1.2.6 回收率與精密度實(shí)驗(yàn) 在陰性魚肉樣品中各添加質(zhì)量濃度為5、10、50 μg/kg 三水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，重復(fù)測(cè)定6次，計(jì)算各磺胺類藥物回收率和精密度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用統(tǒng)計(jì)軟件Excel 2016、GraphPad Prism 6和Analyst 1.6.2 軟件對(duì)采集和檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器條件的優(yōu)化

2.1.1 色譜條件的優(yōu)化 根據(jù)中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 21316-2007[20]、農(nóng)業(yè)農(nóng)村部1025 號(hào)公告-23-2008 及文獻(xiàn)報(bào)道，磺胺類化合物常用的流動(dòng)相為乙腈[21-22]和甲醇[23-25]。此外，磺胺類化合物在酸性條件下具有較高的較穩(wěn)定性和溶解性[19]，因此，本研究考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%甲酸水溶液和乙腈-0.1%甲酸水溶液對(duì)18 種磺胺類化合物的分離度、峰形及靈敏度的影響。結(jié)果表明，以甲醇-水和乙腈-水為流動(dòng)相時(shí)，化合物峰形差，對(duì)于待測(cè)組分中存在的同分異構(gòu)體，基線無法實(shí)現(xiàn)完全分離。通過比較甲醇-0.1%甲酸水溶液和乙腈-0.1%甲酸水溶液發(fā)現(xiàn)，在水相中加入0.1%甲酸時(shí)，待測(cè)組分峰型尖銳，拖尾現(xiàn)象有所改善，同時(shí)甲酸有利于提高待測(cè)物在正離子掃描模式中的離子化效率，進(jìn)一步提高了靈敏度。與乙腈相比，采用甲醇-0.1%甲酸水溶液梯度洗脫時(shí)，待測(cè)物可以實(shí)現(xiàn)良好的基線分離。

研究發(fā)現(xiàn)加入甲酸銨或乙酸銨可以穩(wěn)定水相，改善峰型，對(duì)同分異構(gòu)體實(shí)現(xiàn)更好的分離效果[13,26]，然而本研究通過比較甲醇-0.1%甲酸水溶液和甲醇-0.1%甲酸-5 mmol/L 甲酸銨水溶液對(duì)待測(cè)物峰型及分離度的影響，發(fā)現(xiàn)加入甲酸銨對(duì)待測(cè)物峰型及分離度影響較小，因甲酸銨屬于鹽類化合物，考慮到試劑的消耗以及鹽類流動(dòng)相殘留對(duì)色譜柱和儀器使用壽命的影響，因此本研究最終選擇甲醇-0.1%甲酸水溶液為流動(dòng)相。18 種磺胺類化合物的總離子流圖如圖1。

圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液總離子流圖Fig.1 TIC chromatograms of mixed standard solution

2.1.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化 通過在離子源正負(fù)離子模式下對(duì)18 種磺胺類藥物掃描，發(fā)現(xiàn)18 種磺胺類藥物在正離子模式下響應(yīng)較好，因此選擇離子源正離子模式對(duì)磺胺類藥物母離子全掃，確定目標(biāo)化合物的母離子。再進(jìn)一步通過二級(jí)質(zhì)譜優(yōu)化磺胺類抗菌藥物的子離子、碰撞能以及去簇電壓等參數(shù)（見表1）。采用優(yōu)化后的色譜和質(zhì)譜參數(shù)對(duì)18 種磺胺類藥物采集，如圖1所示，結(jié)果表明化合物具有良好的分離度和靈敏度，優(yōu)化的儀器參數(shù)可滿足磺胺類抗菌藥物分析。

2.2 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.2.1 提取條件的優(yōu)化 動(dòng)物源性食品中磺胺類化合物常用的提取溶劑為乙酸乙酯、甲醇[27]和乙腈[28-31]，本研究考察了上述3 種溶劑的提取效果，結(jié)果表明，甲醇提取液含有白色渾濁物，且難以通過增強(qiáng)型脂質(zhì)去除固相萃取凈化柱。乙酸乙酯和乙腈提取液較澄清透明，且易通過增強(qiáng)型脂質(zhì)去除固相萃取凈化柱。與乙酸乙酯相比，采用乙腈作為提取溶劑時(shí)，回收率相對(duì)較高。此外，磺胺類化合物結(jié)構(gòu)中因含有芳伯氨基而呈現(xiàn)弱堿性，研究發(fā)現(xiàn)，使用酸化有機(jī)試劑提取，磺胺類化合物溶解度更高，提取效率較好[18,31]，與甲醇相比，乙腈極性與待測(cè)物極性相近，因動(dòng)物源性食品中含有大量的脂肪和蛋白質(zhì)，考慮到乙腈具有較好的蛋白沉淀效果，因此本研究在參考趙巧靈等、容裕棠等方法[8,14]基礎(chǔ)上，最終選用1%甲酸乙腈為提取溶劑。

2.2.2 凈化方式的優(yōu)化 樣品中大量的脂肪和蛋白質(zhì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果影響較大，本研究在提取過程中加入氯化鈉和無水硫酸鈉，通過鹽析使蛋白質(zhì)沉淀，進(jìn)一步減少了蛋白質(zhì)對(duì)樣品檢測(cè)的干擾。盡管蛋白質(zhì)可通過鹽析后離心去除，而樣品中的脂肪和磷脂等仍然會(huì)干擾待測(cè)物的檢測(cè)，因此，本研究比較了新型Captiva EMR-Lipid 固相萃取柱與Poly-Sery MCX 固相萃取柱的凈化效果及對(duì)磺胺類藥物回收率的影響。由圖2 可以看出，采用Captiva EMR-Lipid 固相萃取柱凈化時(shí)，化合物回收率高，且相對(duì)穩(wěn)定。此外，如圖3所示，在凈化過程中該凈化柱無需活化、淋洗等過程，通過重力自流即可完成凈化，極大地簡(jiǎn)化了樣品前處理步驟，在減少有機(jī)試劑消耗的同時(shí)，有效縮短了凈化時(shí)間，簡(jiǎn)便易用，省時(shí)省力，顯著提高了方法的可操作性和便利性。該方法最大的優(yōu)點(diǎn)在于采用的Captiva EMR-Lipid 固相萃取柱結(jié)合了體積排阻和疏水相互作用，在高選擇性和高效去除脂質(zhì)的同時(shí)，能最大程度地減少待測(cè)物的流失，從而有利于改善方法的耐用性及可靠性。

圖2 不同凈化柱對(duì)18 種磺胺回收率的影響Fig.2 Effects of different purification columns on recovery rates of 18 sulfonamides

圖3 不同固相萃取柱對(duì)磺胺類藥物凈化效果的影響Fig.3 Effect of different solid phase extraction columns on the purification effect of sulfonamides

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性范圍、檢出限與定量限 配制質(zhì)量濃度為5、10、20、50、100、200 ng/mL 的標(biāo)準(zhǔn)工作液，按照1.2 步驟測(cè)定。以信噪比為3（S/N=3）作為檢出限（LOD），以信噪比為10（S/N=10）作為定量限（LOQ）。結(jié)果表明，18 種磺胺類抗菌藥物在5～200 ng/mL 范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r≥0.9962，方法的檢出限為0.11～0.47 μg/kg，定量限為0.37～1.57 μg/kg（見表2）。

表2 18 種磺胺類抗菌藥物的線性范圍、相關(guān)系數(shù)、回歸方程、檢出限和定量限Table 2 Linear range, correlation coefficients, regression equations, limits of detection and limits of quantification of 18 sulfonamides

2.3.2 回收率與精密度 按1.2.6 項(xiàng)下方法，向陰性魚肉樣品中分別添加濃度為5、10、50 μg/kg 三水平的回收率試驗(yàn)，每個(gè)添加水平重復(fù)測(cè)定6次。結(jié)果表明，3 個(gè)添加水平下鱸魚樣品中18 種磺胺類抗菌藥物的平均回收率為73.30%～116.9%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.29%～7.74%。結(jié)果表明該方法回收率和精密度良好，可滿足鱸魚中18 種磺胺類抗菌藥物殘留檢測(cè)的需求（見表3）。

表3 18 種磺胺類抗菌藥物在魚肉中的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）（n=6）Table 3 Recoveries and relative standard deviations of 18sulfonamidesin fish meat (n=6)

續(xù)表 3

2.4 實(shí)際樣品的測(cè)定

采用本研究建立的檢測(cè)方法測(cè)定當(dāng)?shù)厥惺鄣?5 份鱸魚樣品，結(jié)果顯示，18 種磺胺類藥物在15 份鱸魚樣品均未檢出。

3 結(jié)論

本研究采用新型的增強(qiáng)型脂質(zhì)去除凈化柱結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法以內(nèi)標(biāo)法定量，建立了鱸魚樣品中18 種磺胺類藥物殘留的檢測(cè)方法。通過對(duì)色譜、質(zhì)譜條件以及提取溶劑和凈化方式的優(yōu)化，樣品以1%甲酸乙腈提取，采用新型的增強(qiáng)型脂質(zhì)去除固相萃取柱凈化，可以有效去除脂質(zhì)和蛋白質(zhì)等干擾物，有效提高了回收率，達(dá)到了更好的凈化效果。該方法操作簡(jiǎn)單，無需活化、淋洗和洗脫等過程，在減少有機(jī)試劑消耗的同時(shí)，省時(shí)省力，線性關(guān)系良好，回收率和精密度均可滿足檢測(cè)分析的需求，適用于以鱸魚為主的多種水產(chǎn)品中磺胺類藥物殘留的檢測(cè)分析。