椴樹蜂蜜多糖和多花種蜂蜜多糖加工特性的比較

吳海濤，張藝瑋

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)理學(xué)院，黑龍江大慶 163319；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江大慶 163319）

多糖作為天然食品添加劑是安全的，被認(rèn)為是改善產(chǎn)品品質(zhì)的重要物質(zhì)，此外，多糖化具有提升食品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、食品等多個(gè)行業(yè)，對(duì)多糖加工特性的探究為其應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。近年來，蜂蜜多糖被人們漸漸關(guān)注。蜂蜜多糖是存在于蜂蜜中罕見的微量物質(zhì)，又稱作蜂蜜糊精，是蜂蜜的膠體成分，來源為花蜜和脂質(zhì)[1]。有研究表明，蜂蜜含有低分子量多糖，可以抵抗宿主酶的降解，因此可作為腸道微生物菌群的營(yíng)養(yǎng)來源[2-3]?？傊涿圩鳛橐环N獨(dú)特的天然產(chǎn)物具有重要的研究?jī)r(jià)值。

蜂蜜多糖種類隨蜜源的不同而具備不同的特性。1965 年，Siddiqui 等[4]已對(duì)一些蜂蜜樣品中多糖成分含量進(jìn)行了檢測(cè)，多糖組成中均含有葡萄糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖和木糖，其中個(gè)別蜂蜜多糖中存在鼠李糖和微量的糖醛酸。Tonks 等[5]按分子大小對(duì)麥盧卡蜂蜜進(jìn)行分餾，結(jié)果表明30 kDa 離心過濾器保留的物質(zhì)中存在多糖，并且與大多數(shù)免疫細(xì)胞因子刺激活性相關(guān)，但是沒有進(jìn)一步對(duì)其成分進(jìn)行研究。Megherbi 等[6]對(duì)金合歡、山地多花和多花種蜂蜜進(jìn)行了指紋圖檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)痕量的多糖。王彤[7]采用水溶醇沉法得到多糖沉淀，通過脫蛋白、透析和冷凍干燥得到產(chǎn)率均在0.04%左右的10 種蜂蜜多糖，利用毛細(xì)管電泳-紫外檢測(cè)方法測(cè)定單糖組成和含量，結(jié)果表明10 種蜂蜜多糖均含不同比例的果糖和葡萄糖，天然多花種蜂蜜多糖和棗花蜂蜜多糖含鼠李糖，天然棗花蜂蜜多糖和蕎面花蜂蜜多糖含阿拉伯糖。關(guān)于多糖的熱力學(xué)研究是其生物應(yīng)用的一個(gè)重要內(nèi)容，多糖的熱穩(wěn)定性可確定其在工業(yè)生產(chǎn)中質(zhì)量的變化。流變特性是多糖作為增稠和穩(wěn)定劑的必需研究指標(biāo)，主要受溫度、pH 及多糖濃度的影響，如角叉菜聚糖和卡拉膠在一定溫度范圍內(nèi)的抗粘度能力使其成為食品或化妝品添加劑的理想備選材料[1]。對(duì)水和脂肪的結(jié)合能力是食品配方和加工中最實(shí)用的功能特性，多糖通過水和油的相互作用與食品的質(zhì)地直接相關(guān)[8]，具有高持油性（oil holding capacity，OHC）的多糖能使高脂肪食品和乳液更加穩(wěn)定。多糖的晶體特性與其物理、化學(xué)性能有直接的關(guān)系[9]。膠凝性質(zhì)的探究為其在食品工業(yè)中膠凝劑和增稠劑的原料應(yīng)用提供理論依據(jù)[10]；黑孜然種子多糖發(fā)泡性的探究為其用于食品配方中的發(fā)泡劑提供數(shù)據(jù)支撐[11]。綜上，加工特性的探究是研究多糖特性的重要內(nèi)容。然而，蜂蜜多糖作為一種新型多糖，其加工特性鮮有研究。亟需關(guān)于蜂蜜多糖的熱力學(xué)、流變學(xué)方面的研究，從而促進(jìn)蜂蜜多糖的開發(fā)利用。

蜂蜜多糖作為珍貴的功能性物質(zhì)，其成分的探究及開發(fā)具有一定的研究?jī)r(jià)值。為了開發(fā)有價(jià)值的蜂蜜多糖，本實(shí)驗(yàn)選擇椴樹蜂蜜、多花種蜂蜜作為原材料進(jìn)行蜂蜜多糖的制備及特性研究。采用熱重和差示掃描量熱分析進(jìn)行熱力學(xué)測(cè)試，采用靜態(tài)和動(dòng)態(tài)流變測(cè)試進(jìn)行流變特性分析，測(cè)定蜂蜜多糖的持水性及持油性；以期為椴樹蜂蜜、多花種蜂蜜在保健產(chǎn)品中的利用提供科學(xué)依據(jù)，促進(jìn)新型多糖的開發(fā)及利用，并且推動(dòng)蜂蜜整個(gè)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

椴樹蜂蜜、多花種蜂蜜 購(gòu)自黑龍江省哈爾濱市超市（天然原料蜜，保存在4 ℃）；其他試劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純。

HH-4J 數(shù)顯恒溫?cái)嚢杷″?上海霓玥儀器有限公司；TDL-40B 高速大容量離心機(jī) 華威科創(chuàng)科技有限公司；Pilot10-15M 冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；SDT 650 同步熱分析儀、Discover-HR-1 旋轉(zhuǎn)流變儀 美國(guó)TA 公司；RE-2000A 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 河南益源儀器有限公司；D8 ADVANCE 采用X-射線衍射儀 德國(guó)Bruker。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蜂蜜多糖的制備 采用水溶醇沉法提取蜂蜜多糖[4,12]。100 g 蜂蜜加200 mL 蒸餾水于燒杯中，60 ℃溶解2 h，室溫下加3 倍體積95%的乙醇提取14 h。離心（6000×g，10 min）收集沉淀物，然后將沉淀物溶解在水中。采用Sevag 法去除蛋白，采用過氧化氫法脫色。使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮。選擇分子截留量為8～14 kDa 的透析袋透析48 h，每6 h 換水。收集透析液，離心，凍干得到蜂蜜多糖。多糖含量通過苯酚-硫酸法測(cè)定[13]，以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品為參照，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=6.99X+0.00733（R2=0.99656），其中X 為葡萄糖質(zhì)量濃度（mg/mL），Y 為吸光值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蜂蜜多糖中粗多糖含量。

1.2.2 X-射線衍射測(cè)定 采用X-射線衍射儀進(jìn)行蜂蜜多糖晶體結(jié)構(gòu)的分析。室溫（20 °C）下，取微量樣品（2 mg），衍射角度2θ=5°～60°，步長(zhǎng)為0.1°，掃描速度為每0.1 s/步。

1.2.3 熱力學(xué)特性分析 蜂蜜多糖的熱力學(xué)特性采用熱重-差熱同步熱分析儀進(jìn)行分析，在升溫、恒溫或降溫過程中，觀察樣品的質(zhì)量隨溫度或時(shí)間的變化。將10 mg 樣品放入鉑坩堝中，使用空鋁盤作為參考，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下以10 ℃/min 的速率從25 ℃升溫到700 ℃，得到熱重（TG）和導(dǎo)數(shù)熱重（DTG）；將儀器從室溫加熱到400 ℃進(jìn)行DSC 分析測(cè)定，升溫速率同上。

1.2.4 流變特性測(cè)定 取5 mg/mL 的蜂蜜多糖溶液，水?。?0 ℃）攪拌2 h 后，密封，靜置過夜。使用旋轉(zhuǎn)流變儀測(cè)定蜂蜜多糖溶液的流變特性。

選用Steady-State flow 模式，測(cè)試溫度為25 ℃，測(cè)定多糖溶液在剪切速率為0.1～100 s-1條件下的表觀粘度和應(yīng)力。

選用Oscillation-Frequency 模式，測(cè)試溫度為25 ℃，掃描頻率為0.1～100 Hz，振蕩應(yīng)變固定為2%，研究多糖隨振動(dòng)頻率變化的粘彈性質(zhì)，得到儲(chǔ)能模量、損耗模量及相位角tanδ。

流變儀設(shè)定溫度掃描范圍為20～90 ℃，升溫速率為2 ℃/min，頻率固定為1 Hz（6.28 rad/s），記錄溫度對(duì)多糖流變特性的影響。

1.2.5 持水性與持油性測(cè)定 蜂蜜多糖的持水量（Water holding capacity，WHC）和持油量（Oil holding capacity，OHC）根據(jù)Yuan 等報(bào)道的方法稍作改動(dòng)進(jìn)行測(cè)定[14]。

持水量的測(cè)定：將50 mg 蜂蜜多糖（精確到0.001 g）放入離心管中，稱重，分散到5 mL 蒸餾水中。在室溫下混勻，每15 min 振搖5 s，1 h 后將其離心（4000×g，20 min），除去上層水分，游離水的質(zhì)量為m。WHC 表示為每克多糖所含的水克數(shù)，計(jì)算公式如下：

持油量的測(cè)定：將50 mg 蜂蜜多糖（精確到0.001 g）放入離心管中，稱重，然后加入5 mL 大豆油。在室溫下孵育60 min，每15 min 將懸浮液渦旋混合5 s。1 h 后將其離心（4000×g，20 min），除去上層相，將與多糖分離的油的質(zhì)量測(cè)定為m0。OHC 表示為每克多糖中所含油的克數(shù)，計(jì)算公式如下：

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差的形式。使用SPSS 26.0 軟件進(jìn)行方差分析，使用Origin 9.65 繪圖處理。所有試驗(yàn)至少重復(fù)三次。

2 結(jié)果與分析

2.1 X-射線衍射分析

多糖的晶體和半晶體結(jié)構(gòu)直接影響其物理性質(zhì)[15]。蜂蜜多糖的X-衍射記錄見圖1。

圖1 蜂蜜多糖的X-射線衍射圖Fig.1 X-ray diffraction spectrum of honey polysaccharides

如圖1所示，兩種蜂蜜多糖的X-射線衍射出現(xiàn)不明顯的凸起，并無任何典型或尖銳的強(qiáng)烈峰，表明均為典型的無定形性質(zhì)，MHP 分別在2θ=20°處有較弱的衍射峰出現(xiàn)，說明可能存在晶體結(jié)構(gòu)，結(jié)晶度較小，與川貝母多糖的X-射線衍射分析相似[16]，而LHP 的X-衍射峰較MHP 更弱。X-衍射表明蜂蜜多糖既有結(jié)晶性又有無定形狀態(tài)。

2.2 熱力學(xué)特性

2.2.1 熱重分析 多糖的熱穩(wěn)定性是多糖應(yīng)用的重要特征，通過熱重分析（TG）、導(dǎo)數(shù)熱重分析（DTG）和示差掃描量熱（DSC）分析蜂蜜多糖的熱力學(xué)性質(zhì)。TG 可測(cè)量溫度變化過程中產(chǎn)品的重量損失和熱降解溫度[17]，見圖2。如圖2所示，蜂蜜多糖的熱分解分成兩個(gè)階段，第一階段為水分的流失，第二階段為蜂蜜多糖的化學(xué)分解。蘭莖粉多糖[18]和綠豆皮多糖[19]等天然多糖也有兩個(gè)熱分解階段。通過分析可知，LHP 和MHP 的重量損失分別為85.05%和81.30%，熱降解溫度分別為236.7 和322 ℃。LHP 失重比MHP 多，MHP 具有更強(qiáng)的熱穩(wěn)定性和更穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，這種熱穩(wěn)定性的差異可能是由多糖的結(jié)構(gòu)、分子量大小引起的[20]。

圖2 蜂蜜多糖的TG、DTG 曲線圖Fig.2 TG and DTG curve of honey polysaccharides

2.2.2 示差掃描量熱分析 DSC 用于確定蜂蜜多糖隨著溫度升高而發(fā)生的吸熱或放熱變化[21]，見圖3。如圖3所示，LHP 和MHP 均表現(xiàn)出一個(gè)較寬的放熱反應(yīng)峰，分別在75 和72 ℃附近，該范圍蜂蜜多糖為失重狀態(tài)，可能發(fā)生分解反應(yīng)，而在400 ℃后可能存在特征峰-吸熱峰。川貝母多糖的DSC 分析在231.9 和300.1 °C 出現(xiàn)放熱谷，多糖熱穩(wěn)定性的差異可能是由提取方法、多糖的化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)之間的差異引起[22]?？傮w來看，LHP 和MHP 的熱穩(wěn)定性較強(qiáng)，可在正常操作溫度下保持穩(wěn)定。

圖3 蜂蜜多糖的DSC 曲線圖Fig.3 DSC curve of honey polysaccharides

2.3 流變特性

2.3.1 靜態(tài)流變學(xué)測(cè)試 如圖4所示，顯示了蜂蜜多糖溶液（0.5%）的穩(wěn)態(tài)剪切流動(dòng)曲線。圖4 中兩種蜂蜜多糖溶液均表現(xiàn)出剪切變稀行為。隨剪切速率的增大，表觀粘度逐漸降低，符合非牛頓流體特征，即為剪切稀化的假塑性流體，此現(xiàn)象與黑穗醋栗多糖的流變特性相同[23]。剪切變稀的主要原因是分子在流動(dòng)方向的取向、柔性鏈的變形和分子間相互作用的減少[24-25]。LHP 和MHP 在高剪切速率下粘度分別在1.3 和1.2 mPa·s 保持不變，LHP 的分子量大，阻力大，進(jìn)而粘度相對(duì)較大，而粘度較低的多糖，意味著可以在較低的能量下運(yùn)行，能夠減少機(jī)械運(yùn)轉(zhuǎn)過程中的能損耗，利于工業(yè)化生產(chǎn)[26]。

圖4 蜂蜜多糖隨剪切速率的流變學(xué)變化Fig.4 Rheological changes of honey polysaccharides with shear rate

2.3.2 動(dòng)態(tài)流變學(xué)測(cè)試 0.5%的LHP 和MHP 的頻率掃描變化見圖5。儲(chǔ)能模量（G'）反映了蜂蜜多糖溶液的彈性性質(zhì)，損耗模量（G″）反映了蜂蜜多糖溶液的粘性性質(zhì)[27]。如圖5所示，LHP 和MHP 在頻率為0.1～100 Hz 內(nèi)G″＜G'，且兩條曲線接近于平行變化，表現(xiàn)為弱凝膠行為，刺梨多糖也得到了類似的結(jié)果[28]。

圖5 蜂蜜多糖的流變特性隨頻率的變化Fig.5 Changes of rheological properties of honey polysaccharides with frequency

蜂蜜多糖溶液（0.5%）從20 ℃升溫到90 ℃的粘度和應(yīng)力變化見圖6，如圖6a所示，兩種蜂蜜多糖溶液的粘度在溫度20～63 ℃范圍內(nèi)幾乎沒有變化，并在很寬的溫度范圍內(nèi)保持穩(wěn)定（見圖6b）。綠藻胞外多糖也得到了類似的結(jié)果[7]。結(jié)果表明，在一般溫度范圍內(nèi)，LHP 和MHP 的粘度不受影響，是食品或化妝品添加劑的理想選擇。

圖6 蜂蜜多糖隨溫度影響的流變變化圖Fig.6 Rheological changes of honey polysaccharides with temperature

2.4 持水性與持油性

保水和結(jié)合脂肪的能力是食品配制和加工中最實(shí)用的功能特征，通過水和油之間的相互作用直接與產(chǎn)品質(zhì)地相關(guān)[2]。結(jié)果如表1所示，LHP 和MHP 的持水量分別為(1.60±0.09) g 水/g 和(0.40±0.02) g 水/g，低于杏仁多糖1.95 g 水/g[28]。LHP 和MHP 的持油量分別為(18.80±1.05) g 油/g 和(11.4±0.89) g 油/g，高于綠藻酸性多糖的持油量（15.09 g 油/g）[15]，高OHC的多糖對(duì)高脂食品和乳液的穩(wěn)定性能更強(qiáng)。蜂蜜多糖具有理想的脂肪結(jié)合力，因此，蜂蜜多糖在功能性食品工業(yè)中具備潛在的應(yīng)用基礎(chǔ)。蜂蜜多糖作為水溶性多糖，其表現(xiàn)出的持水持油特性是多糖與其所合有的蛋白質(zhì)共同作用的結(jié)果，即蛋白質(zhì)作為疏水結(jié)構(gòu)存在，而多糖鏈作為親水性結(jié)構(gòu)存在。

表1 蜂蜜多糖的持水性和持油性Table 1 Water holding capacity and oil holding capacity of honey polysaccharides

3 結(jié)論

本文利用X 射線衍射研究椴樹蜂蜜多糖和多花種蜂蜜多糖的晶體結(jié)構(gòu)，也通過熱力學(xué)特性、流變學(xué)特性、持水性和持油性來研究其加工特性。結(jié)果表明，MHP 具有更好的熱穩(wěn)定性；兩種多糖溶液在高頻率剪切下表現(xiàn)為弱凝膠行為；剪切速率變化下，表現(xiàn)為剪切稀化行為；且溫度對(duì)蜂蜜多糖的流變特性不具有很大程度的影響。根據(jù)流體力學(xué)，多糖加熱后，分子無規(guī)則運(yùn)動(dòng)增加，分子間距增大，減弱了多糖分子鏈之間的相互作用，多糖鏈更易于運(yùn)動(dòng)，溶液粘度降低，剪切稀化現(xiàn)象明顯。根據(jù)本文結(jié)果，可以利用蜂蜜多糖熱重分析，對(duì)不同溫度下的蜂蜜多糖開發(fā)利用。同時(shí)，蜂蜜多糖具有較好的水和脂肪結(jié)合能力。多糖加工特性的研究應(yīng)從熱力學(xué)特性和流變學(xué)特性等方面結(jié)合物理加工特性進(jìn)行全面研究，進(jìn)而為其在工業(yè)和功能性食品中的應(yīng)用打下基礎(chǔ)。