刺梨中質(zhì)量標(biāo)記物的提取工藝優(yōu)化及其含量同時(shí)測(cè)定

汪 濤，李良群，嚴(yán)艷芳，田 強(qiáng)，陳發(fā)菊，譚云飛，楊 娟，彭 梅，楊禮壽，羅忠圣，李齊激，楊小生,3,

（1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，貴州貴陽 550025；2.貴州省中國(guó)科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽 550014；3.貴州醫(yī)科大學(xué)天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽 550014）

刺梨（Rosa roxburghii）是一種薔薇科薔薇屬多年生灌木，是我國(guó)西南地區(qū)特有的一種野生藥用植物，集中分布于貴州、云南、四川等地區(qū)[1]。刺梨的利用迄今已有400 多年的歷史，具有很高的營(yíng)養(yǎng)和藥用價(jià)值。刺梨的根、莖、葉、果實(shí)均可入藥，有健胃、消食、滋補(bǔ)的作用[2-3]。研究表明，刺梨富含維生素C、五環(huán)三萜、黃酮類、多糖類、有機(jī)酸類、其他類化合物如超氧化物歧化酶（SOD）等化學(xué)成分[4-8]，具有抗凋亡作用、降血糖、抗氧化、減輕炎癥作用、增強(qiáng)免疫功能、調(diào)節(jié)小鼠結(jié)腸菌群等多種生物活性[9-13]；因此刺梨被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、保健品等行業(yè)。

中藥質(zhì)量標(biāo)志物（Q-marker）是用于評(píng)價(jià)中藥質(zhì)量的新概念，2016 年由劉昌孝院士首次提出，為藥材、飲片、制劑等方面建立了可參照的質(zhì)量評(píng)價(jià)和質(zhì)量控制模式，對(duì)形成質(zhì)量和風(fēng)險(xiǎn)控制的“藥材-飲片-成藥”全過程質(zhì)量追溯系統(tǒng)、建立全新的質(zhì)量管理體系具有實(shí)踐應(yīng)用價(jià)值[14-15]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，刺梨三萜類物質(zhì)在抗抑郁、消炎、對(duì)海馬神經(jīng)元的保護(hù)及機(jī)體免疫調(diào)節(jié)等方面具有較好的藥理活性[16-19]，此外，刺梨三萜提取物對(duì)酒精性肝損傷的小鼠具有很好的治療效果[20]，并且刺梨總?cè)疲ㄖ饕汤孳?、野薔薇苷、薔薇酸和委陵菜酸）還可以改善機(jī)體免疫抑制[21]?；诖汤嫒瞥煞值幕钚砸约捌湓诖汤嬷参矬w內(nèi)中的較高含量，因此可以作為刺梨質(zhì)量標(biāo)志物。

迄今，有關(guān)刺梨三萜的研究主要集中于總?cè)坪繖z測(cè)或者2 種三萜的含量測(cè)定。南瑩等[22]研究了貴州龍里地區(qū)的刺梨果實(shí)中總?cè)频暮?；代甜甜等[23]測(cè)定了貴州松桃地區(qū)野生刺梨中總?cè)频暮?；劉英梟等[24]研究了刺梨果渣中薔薇酸的提取工藝；李齊激等[25-26]使用HPLC 測(cè)定了刺梨中刺梨苷或薔薇酸和1-β-羥基薔薇酸的含量。在提取工藝研究方面，刺梨三萜的提取方法主要有超聲提取[27]和乙醇回流提取[28]，但是普遍存在提取效率不高，損失較大的問題。特別是近幾年來，貴州省將刺梨產(chǎn)業(yè)打造成富民和鄉(xiāng)村振興的大產(chǎn)業(yè)，大面積種植刺梨和開發(fā)高附加值的刺梨產(chǎn)品是貴州促進(jìn)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的主要方式之一。如能以刺梨中含有的功能性三萜類物質(zhì)為基礎(chǔ)開發(fā)高附加值的產(chǎn)品，將會(huì)創(chuàng)造更大的經(jīng)濟(jì)效益。因此，對(duì)刺梨中質(zhì)量標(biāo)記物的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化及其含量同時(shí)的測(cè)定進(jìn)行研究，具有較強(qiáng)的新穎性和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。本研究以貴州惠水野生刺梨為原材料，以4 個(gè)化合物即薔薇酸、委陵菜酸、刺梨苷、野薔薇苷為質(zhì)量標(biāo)志物建立HPLC 同時(shí)測(cè)定方法并優(yōu)化提取工藝，分析刺梨根、莖葉、果四個(gè)不同部位中4 種化合物的含量，為其開發(fā)利用與質(zhì)量評(píng)價(jià)提供重要參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

刺梨根、莖、葉、果 采自貴州省黔南布依族苗族自治州惠水縣212 國(guó)道（經(jīng)度：106.673411，緯度：26.197517），經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)孫慶文教授鑒定為薔薇科薔薇屬植物繅絲花的根、莖、葉、果實(shí)，標(biāo)本（憑證202106001）保存于貴州省、中國(guó)科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；三萜化合物標(biāo)準(zhǔn)品（薔薇酸，刺梨苷，野薔薇苷自制，經(jīng)HPLC 檢測(cè)測(cè)定純度≥98%）；乙醇（分析級(jí)） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甲醇、乙腈（HPLC 級(jí)） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；三氟乙酸（分析級(jí)） 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

BJ-400T 型粉碎機(jī) 陜西現(xiàn)代醫(yī)藥有限公司；SB25-12DTD 型超聲波清洗器 寧波新芝生物科技股份有限公司；FA2004N 型電子天平（萬分之一）上海菁海儀器有限公司；DKN612C 型電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海雅馬拓科技貿(mào)易有限公司；DK-98-Ⅱ型水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司；Eppendor f 5427R型高速冷凍離心機(jī) 北京龍躍生物科技發(fā)展有限公司；Agilent-1260 型高效液相色譜儀 上海連橋生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 質(zhì)量標(biāo)志物的提取工藝 參照劉偉等[29]的方法，略改：將刺梨根置于65 ℃的烘箱中烘干，粉碎，過3 號(hào)篩。精密稱定2.00 g 刺梨根粉末，按照料液比1:25 加入體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇，先放入超聲儀中25 ℃、250 W 超聲30 min，再將料液進(jìn)行加熱回流2 h，連續(xù)提取3次，得到刺梨總質(zhì)量標(biāo)志物提取液。以同樣的方法對(duì)刺梨莖、葉、果進(jìn)行提取。

1.2.2 試樣制備

1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制 精密稱定刺梨苷標(biāo)準(zhǔn)品10.00 mg，置于10 mL 容量瓶中，用75%甲醇完全溶解，定容至刻度線，即得刺梨苷標(biāo)準(zhǔn)溶液（刺梨苷濃度為1.022 mg/mL）。按照同樣的方法配制濃度為1.020 mg/mL 的野薔薇苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液，濃度為1.192 mg/mL 的薔薇酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液和濃度為1.098 mg/mL的委陵菜酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.2.2 供試品溶液配制 精密稱定刺梨根、莖、葉、果粉末樣品2.00 g，置于具塞錐形瓶中，裝入250 mL錐形瓶中，按1:25 g/mL 的比例加入50 mL 70%乙醇。先放入超聲儀中25 ℃、250 W 超聲30 min，再將料液進(jìn)行加熱回流2 h，重復(fù)提取3次，合并提取液，低溫濃縮后用75%甲醇定容至25 mL 量瓶中，0.45 μm微孔濾膜過濾，然后以刺梨苷、野薔薇苷、薔薇酸和委陵菜酸4 個(gè)質(zhì)量標(biāo)志物的含量為指標(biāo)，用HPLC進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.3 提取方法

1.2.3.1 超聲提取 精密稱定2.00 g 預(yù)處理后的刺梨根粉末，裝入250 mL 錐形瓶中，按1:20 g/mL 的比例加入40 mL 100%乙醇。 放入超聲儀中25 ℃、250 W超聲30 min 后將料液過濾，取濾液，過0.45 μm 微孔濾膜裝入2 mL 螺紋樣品瓶中，待HPLC 檢測(cè)使用。

1.2.3.2 乙醇回流提取 精密稱定2.00 g 預(yù)處理后的刺梨根粉末，裝入250 mL 錐形瓶中，按1:20 g/mL的比例加入40 mL 100%乙醇，加熱回流2 h，過濾，取濾液，過0.45 μm 微孔濾膜裝入2 mL 螺紋樣品瓶中，待 HPLC 檢測(cè)使用。

1.2.3.3 超聲輔助乙醇回流提取 精密稱定2.00 g預(yù)處理后的刺梨根粉末，裝入250 mL 錐形瓶中，按1:20 g/mL 的比例加入40 mL 100%乙醇。放入超聲儀中25 ℃、250 W 超聲30 min 后加熱回流2 h，取濾液，過0.45 μm 微孔濾膜裝入2 mL 螺紋樣品瓶中，待 HPLC 檢測(cè)使用。

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.4.1 溶劑用量對(duì)各質(zhì)量標(biāo)志物含量的影響 精密稱定2.00 g 預(yù)處理后的刺梨根粉末，裝入250 mL錐形瓶中，以不同溶劑用量（1:10、1:15、1:20、1:25、1:30 g/mL）加入100%乙醇。放入超聲儀中25 ℃、250 W 超聲30 min 后加熱回流2 h，以4 個(gè)刺梨質(zhì)量標(biāo)志物的含量為指標(biāo)，用HPLC 進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.4.2 乙醇濃度對(duì)各質(zhì)量標(biāo)志物含量的影響 精密稱定2.00 g 預(yù)處理后的刺梨根粉末，裝入250 mL錐形瓶中，按1:25 的比例加入50 mL 不同的乙醇體積分?jǐn)?shù)（60%、70%、80%、90%和100%）乙醇。放入超聲儀中25 ℃、250 W 超聲30 min 后加熱回流2 h，然后以4 個(gè)刺梨質(zhì)量標(biāo)志物的含量為指標(biāo)，用HPLC 進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.4.3 回流時(shí)間對(duì)各質(zhì)量標(biāo)志物含量的影響 精密稱定2.00 g 預(yù)處理后的刺梨根粉末，裝入250 mL錐形瓶中，按1:25 的比例加入50 mL 70%乙醇。放入超聲儀中25 ℃、250 W 超聲30 min 后分別加熱回流（0.5、1、1.5、2 和2.5 h），然后以4 個(gè)刺梨質(zhì)量標(biāo)志物的含量為指標(biāo)，用HPLC 進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.4.4 提取次數(shù)對(duì)各質(zhì)量標(biāo)志物含量的影響 精密稱定2.00 g 預(yù)處理后的刺梨根粉末，裝入250 mL錐形瓶中，按1:25 的比例加入50 mL 70%乙醇。放入超聲儀中25 ℃、250 W 超聲30 min 后加熱回流2 h（分別加熱1、2、3、4 和5次），然后以4 個(gè)刺梨質(zhì)量標(biāo)志物的含量為指標(biāo)，用HPLC 進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.5 響應(yīng)面試驗(yàn) 本研究使用Design Export 8.0軟件中的Box-Behnken 中心組合設(shè)計(jì)優(yōu)化提取條件（表1），在上述單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，考察溶劑用量（A）、乙醇濃度（B）和回流時(shí)間（C）3 個(gè)因素對(duì)刺梨三萜質(zhì)量標(biāo)志物含量的影響，從而確定刺梨中三萜質(zhì)量標(biāo)志物的最適提取工藝。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Design and results of response surface method

1.2.6 刺梨根、莖、葉、果中4 個(gè)標(biāo)志物的提取及含量測(cè)定

1.2.6.1 樣品處理 通過單因素與響應(yīng)面試驗(yàn)，得到提取刺梨質(zhì)量標(biāo)志物的最佳條件，在最佳條件下繼續(xù)提取刺梨根、刺梨莖、刺梨葉、刺梨果實(shí)中的質(zhì)量標(biāo)志物。然后采用高效液相色譜法對(duì)從刺梨中提取到的質(zhì)量標(biāo)志物含量進(jìn)行分析。各質(zhì)量標(biāo)志物的含量等于各質(zhì)量標(biāo)志物的量/刺梨原料質(zhì)量（單位mg/g），以4 種質(zhì)量標(biāo)志物的百分含量總和即總?cè)苹衔锇俜趾繛樵u(píng)價(jià)指標(biāo)。

1.2.6.2 儀器參數(shù) Thermo C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm；柱溫20 ℃；流速為1 mL/min；進(jìn)樣體積為10 μL；流動(dòng)相A 為0.05%三氟乙酸水，B 為乙腈；梯度洗脫條件為0～15 min，25% A～30% A；15～20 min，30% A～35% A；20～60 min，35% A 等度洗脫。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果表示為Mean±SD，未做特殊說明差異顯著性分析限定為P=0.05，利用Excel 2010 對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用Origin 2018 64Bit 軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 系統(tǒng)適用性考察

吸取“1.2.3.1”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)品溶液適量，在“1.2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，結(jié)果見圖1。由此表明，理論塔板數(shù)以刺梨苷、野薔薇苷、薔薇酸、委陵菜酸峰計(jì)，分別為30592、40063、30163、34065，分離度均大于1.5，各基線分離良好。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 線性關(guān)系考察 吸取“1.2.2.1”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)品溶液適量，在“1.2.6.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣。進(jìn)樣體積依次為2、4、6、8、10、20 μL，以質(zhì)量濃度與進(jìn)樣體積的乘積為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸并分析，結(jié)果各成分的r都在三個(gè)9 以上，表明各成分峰面積和質(zhì)量濃度與進(jìn)樣體積的乘積呈良好線性關(guān)系（見表2）。

2.2.2 日內(nèi)和日間精密度試驗(yàn) 吸取“1.2.2.1”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)品溶液適量，在“1.2.6.2”項(xiàng)色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，連續(xù)3 d，測(cè)得刺梨苷、野薔薇苷、薔薇酸、委陵菜酸的日內(nèi)精密度RSD 分別為1.20%、1.80%、1.20%、1.40%；日間精密度分別為1.79%、0.89%、1.26%、1.23%，表明儀器日內(nèi)和日間精密度良好。

2.2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)和重復(fù)性試驗(yàn) 吸取“1.2.2.1”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)品溶液適量，于0、2、4、8、12、24 h 在“1.2.6.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，測(cè)得刺梨苷、野薔薇苷、薔薇酸、委陵菜酸的精密度RSD 分別為1.44%、0.96%、0.96%、1.47%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。精密稱取同一批刺梨根粉末6 份，按“1.2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“1.2.6.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，測(cè)得刺梨苷、野薔薇苷、薔薇酸、委陵菜酸的精密度RSD 分別為1.40%、1.48%、1.65%、1.78%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.4 加樣回收試驗(yàn) 精密稱定刺梨根粉末樣品6 份，每份1.00 g，精密稱定，每份樣品分別加入相對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品（刺梨苷4.61 mg、野薔薇苷5.02 mg、薔薇酸4.88 mg、委陵菜酸3.24 mg），按“1.2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)得4 種成分加樣回收率，結(jié)果見表3。

表3 各成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Table 3 Results of recovery tests for various constituents (n=6)

2.3 刺梨中各質(zhì)量標(biāo)志物提取方法比較結(jié)果

首先以刺梨根為提取原料，對(duì)比超聲提取法、乙醇回流提取法及超聲-乙醇回流法三種提取工藝，以刺梨質(zhì)量標(biāo)志物化合物類型為橫坐標(biāo)，質(zhì)量標(biāo)志物含量為縱坐標(biāo)，其結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，先超聲再乙醇回流結(jié)合方法優(yōu)于單獨(dú)超聲提取法與單獨(dú)乙醇回流提取法；其二是超聲加乙醇回流得到的刺梨各質(zhì)量標(biāo)志物含量分別為，刺梨苷0.43%，野薔薇苷0.55%，薔薇酸0.22%，委陵菜酸0.26%。因此，接下來的試驗(yàn)都以超聲-乙醇回流法提取刺梨根、刺梨莖、刺梨葉和刺梨果中質(zhì)量標(biāo)志物。

圖2 三種提取方法效率對(duì)比圖Fig.2 Comparison of three extraction methods

2.4 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

溶劑用量、乙醇濃度、提取時(shí)間及提取次數(shù)等是影響刺梨中4 個(gè)質(zhì)量標(biāo)志物含量的主要因素[30]。因此，基于超聲-乙醇回流法，考察溶劑用量、乙醇濃度、回流時(shí)間以及提取次數(shù)對(duì)刺梨中4 個(gè)質(zhì)量標(biāo)志物含量的影響。

2.4.1 溶劑用量對(duì)刺梨中各質(zhì)量標(biāo)志物含量的影響溶劑用量對(duì)刺梨根中各質(zhì)量標(biāo)志物含量的影響結(jié)果見圖3。由圖3可知：當(dāng)料液比從1:10～1:25 時(shí)，刺梨中三萜化合物的含量呈現(xiàn)增大的趨勢(shì)，可能由于隨著溶劑用量的增大，刺梨三萜在乙醇中的溶解度也增大，在1:25 的時(shí)候刺梨三萜的溶解度達(dá)到最大，各三萜化合物的含量也達(dá)到最大（刺梨苷0.40%、野薔薇苷0.58%、薔薇酸0.18%、委陵菜酸0.24%）；當(dāng)料液比從1:25～1:30 時(shí)，刺梨苷和野薔薇苷明顯降低，委陵菜酸和薔薇酸的含量逐漸下降，這可能是由于其他醇溶性成分溶出，使得刺梨三萜的含量下降。選定料液比1:20、1:25、1:30 作為響應(yīng)面試驗(yàn)水平。

圖3 溶劑用量對(duì)刺梨根中質(zhì)量標(biāo)志物含量的影響Fig.3 Effects of solvent dosage on the contents of Q-marker in R. roxburghii root

2.4.2 乙醇濃度對(duì)刺梨中各質(zhì)量標(biāo)志物含量的影響乙醇濃度對(duì)刺梨根中各質(zhì)量標(biāo)志物含量的影響結(jié)果見圖4。由圖4可知：當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)從60%升到70%時(shí)，刺梨苷的含量增大，其含量從0.52%增加到0.55%，提高了5.77%；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)從60%升到70%時(shí)，野薔薇苷的含量緩慢上升，其含量從0.59%增加到0.63%，提高了6.78%；而當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)從80%升到100%時(shí)，兩者的含量呈現(xiàn)快速下降的趨勢(shì)；當(dāng)乙醇濃度從60%升到80%時(shí)，薔薇酸的含量呈現(xiàn)緩慢上升的趨勢(shì)，從0.11%增加到0.21%，提高了90.90%；委陵菜酸的含量增加到最大（2.37 mg/g），而乙醇濃度在80%以后兩者的含量開始下。這可能是由于刺梨苷和野薔薇苷在乙醇濃度為70%的時(shí)候的溶出率較好，因此在此時(shí)的含量較高；而薔薇酸和委陵菜酸則在乙醇濃度為80%的時(shí)候溶出率較好。綜合四者的總含量考慮，選定乙醇濃度60%、70%、80%作為響應(yīng)面試驗(yàn)水平。

圖4 乙醇濃度對(duì)刺梨根中質(zhì)量標(biāo)志物含量的影響Fig.4 Effects of ethanol concentration on the contents of Q-marker in R. roxburghii root

2.4.3 回流時(shí)間對(duì)刺梨中各質(zhì)量標(biāo)志物含量的影響回流時(shí)間對(duì)刺梨根中各質(zhì)量標(biāo)志物含量的影響結(jié)果見圖5。提取時(shí)間過短會(huì)造成原料提取不完全，時(shí)間過長(zhǎng)且在較高的溫度下會(huì)導(dǎo)致成分破環(huán)。由圖5可知：在30 min 時(shí)，提取不夠完全，刺梨三萜浸出不完全，因此含量較低；隨著回流時(shí)間的增加，刺梨苷、野薔薇苷和委陵菜酸的含量均呈上升趨勢(shì)，在回流時(shí)間為2 h 時(shí)，兩者的含量達(dá)到最高（刺梨苷0.87%、野薔薇苷0.98%、委陵菜酸0.26%），隨后刺梨苷的含量呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，而野薔薇苷和委陵菜酸的含量基本變化不大；在回流時(shí)間從0.5 h 到1.5 h 時(shí)，薔薇酸的含量緩慢上升，達(dá)到最大值（0.34%）；當(dāng)繼續(xù)增加回流時(shí)間時(shí)，薔薇酸的含量變化基本不大，這表明提取液已基本飽和，刺梨中薔薇酸已不易再滲出至溶液中，野薔薇苷和委陵菜酸亦是如此。本研究結(jié)果和高偉城等[31]采用 響應(yīng)面法優(yōu)化枇杷葉三萜酸類成分的提取工藝中提取時(shí)間研究結(jié)果相一致，結(jié)合四者的總含量考慮，選定提取時(shí)間1.5、2、2.5 h 作為響應(yīng)面試驗(yàn)水平。

圖5 回流時(shí)間對(duì)刺梨根中質(zhì)量標(biāo)志物含量的影響Fig.5 Effect of reflux time on the contents of Q-marker in R.roxburghii root

2.4.4 提取次數(shù)對(duì)刺梨中各質(zhì)量標(biāo)志物含量的影響提取次數(shù)對(duì)刺梨根中各質(zhì)量標(biāo)志物含量的影響結(jié)果見圖6。由圖6可知，當(dāng)提取次數(shù)逐漸增加到3次時(shí)，刺梨苷的含量從0.17%到0.22%、野薔薇苷的含量從0.27%到0.36%，而薔薇酸和委陵菜酸的含量差別不大；提取3次以上，刺梨中各質(zhì)量標(biāo)志物含量幾乎無增加，因此在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中將提取3次。而在實(shí)際生產(chǎn)中考慮到生產(chǎn)成本的問題，提取次數(shù)因根據(jù)實(shí)際情況而定?？紤]到提取次數(shù)對(duì)提取刺梨質(zhì)量標(biāo)志物的影響不大，將不作為響應(yīng)面優(yōu)化的影響因素。

圖6 提取次數(shù)對(duì)刺梨根中質(zhì)量標(biāo)志物物含量的影響Fig.6 Effect of extraction times on the contents of Q-marker in R. roxburghii root

2.5 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.5.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果 參考刺梨質(zhì)量標(biāo)志物提取單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)考察溶劑用量、乙醇濃度及提取試劑對(duì)刺梨中4 個(gè)三萜化合物含量的影響，結(jié)果見表4。

表4 響應(yīng)面法試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Design and results of response surface method

通過對(duì)表4 試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次回歸分析，得出多項(xiàng)式回歸方程如下：Y=0.096+(1.200E-003)A-(1.325E-003)B+(3.050E-003)C+(4.975E-003)AB-(1.975E-003)AC-(2.250E-004)BC-0.017A2-(5.558E-003)B2-(9.507E-003)C2，式中Y 為三萜化合物得率，A、B、C 分別為溶劑用量、乙醇濃度及提取時(shí)間，R2=0.8834。

2.5.2 響應(yīng)面結(jié)果分析 由表5 回歸模型方差分析結(jié)果可以看出，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)模型P＜0.05，具有顯著差異，三萜化合物與3 個(gè)變量之間有顯著的線性關(guān)系。失擬項(xiàng)P＞0.05 不顯著，表明所建立的二次回歸模型能有效的對(duì)響應(yīng)值進(jìn)行預(yù)測(cè)。通過表5 回歸模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果可知，A2、C2對(duì)刺梨4 個(gè)三萜化合物含量的影響顯著?；貧w優(yōu)化響應(yīng)面圖見圖7、圖8、圖9，響應(yīng)值與各因素的等高線圖、三維空間響應(yīng)面圖可直觀地展現(xiàn)各因素之間的交互作用對(duì)刺梨三萜含量的影響，通過等高線的密集程度判斷兩因素交互的影響程度[32]。由圖7a可知，等高線沿乙醇濃度密集，乙醇濃度對(duì)刺梨三萜化合物含量的影響大于溶劑用量。由圖7b可知，乙醇濃度固定不變時(shí)，增大溶劑用量，刺梨三萜化合物的含量先增大后減小；溶劑用量固定不變時(shí)，乙醇濃度增加，刺梨三萜化合物的含量先增大后減??；由圖8a可知，等高線沿溶劑用量密集，溶劑用量對(duì)刺梨三萜含量的影響大于回流時(shí)間。由圖8b可知，溶劑用量固定不變時(shí)，回流時(shí)間增加，刺梨三萜化合物的含量先增大后減??；回流時(shí)間固定不變時(shí)，溶劑用量增加，刺梨三萜化合物的含量先增大后減?。挥蓤D9a可知，等高線沿乙醇濃度密集，乙醇濃度對(duì)刺梨三萜含量的影響大于回流時(shí)間。由圖9b可知，乙醇濃度固定不變時(shí)，回流時(shí)間增加，刺梨三萜化合物的含量先增大后減??；回流時(shí)間固定不變時(shí)，乙醇濃度增加，刺梨三萜化合物的含量先增大后減小。綜上，3 個(gè)因素對(duì)刺梨三萜化合物含量影響為乙醇濃度＞溶劑用量＞提取時(shí)間。

圖7 溶劑用量和乙醇濃度交互作用對(duì)刺梨根中質(zhì)量標(biāo)志物含量的影響Fig.7 Effect of solvent dosage and ethanol concentration on the contents of Q-marker in R. roxburghii root

圖8 溶劑用量和回流時(shí)間交互作用對(duì)刺梨根中質(zhì)量標(biāo)志物含量的影響Fig.8 Effect of solvent dosage and reflux time on the contents of Q-marker in R. roxburghii root

圖9 乙醇濃度和回流時(shí)間交互作用對(duì)刺梨根中質(zhì)量標(biāo)志物含量的影響Fig.9 Effect of ethanol concentration and reflux time on the contents of Q-marker in R. roxburghii root

表5 回歸模型的方差分析和回歸系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)Table 5 Analysis of variance for the established regression model and significance test of each regression coefficient

2.5.3 提取工藝優(yōu)化及驗(yàn)證 通過Design-Expert 8.0軟件中Numerical 優(yōu)化模塊得到預(yù)測(cè)值，給出模型預(yù)測(cè)最佳提取條件為溶劑用量為1:25（g/mL）、乙醇濃度70.11%、提取時(shí)間1.98 h；在此優(yōu)化條件下刺梨質(zhì)量標(biāo)志物的總含量為4.89%。因試驗(yàn)儀器精度限制，采用溶劑用量為1:25（g/mL）、乙醇濃度70%、提取時(shí)間2 h 的提取條件進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，測(cè)得刺梨質(zhì)量標(biāo)志物的平均含量5.12%±0.02%，RSD 為1.923%，說明響應(yīng)面模型具有可行性。

2.6 刺梨中不同部位4 個(gè)質(zhì)量標(biāo)志物的含量測(cè)定

全面考察4 個(gè)標(biāo)志物在刺梨各部位的分布情況，使用最適的條件和方法，經(jīng)HPLC 測(cè)定刺梨根、莖、葉和果中4 個(gè)標(biāo)志物的含量，結(jié)果見表6。由表6可知：刺梨苷在葉子中的含量較高，這可能是由于葉片的光合作用或其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物是次生代謝產(chǎn)物的底物，葉片光合作用旺盛，產(chǎn)生的底物多，所以合成的次生代謝產(chǎn)物也多[33]，而刺梨苷的合成底物可能在葉片較多，則在葉片的含量較其他部位高；野薔薇苷在莖中的分布較高；薔薇酸和委陵菜酸則較多的分布于果實(shí)中，這可能是由于在合成、運(yùn)輸?shù)倪^程中產(chǎn)生了一定的差異。4 個(gè)標(biāo)志物在刺梨不同部位的總含量分別為刺梨葉2.64%、刺梨根2.41%、刺梨莖2.40%、刺梨果2.23%。由此可見，刺梨的不同部位中4 個(gè)標(biāo)志物的總含量（從大到?。╉樞?yàn)榇汤嫒~、刺梨根、刺梨莖、刺梨果。

表6 刺梨不同部位的含量Table 6 Contents of different parts of R. roxburghii

3 結(jié)論與討論

迄今，國(guó)內(nèi)外對(duì)刺梨成分工藝的研究主要集中在刺梨中多糖和黃酮類物質(zhì)的提取工藝優(yōu)化以及刺梨果酒的工藝優(yōu)化[34-37]，也有部分研究是關(guān)于刺梨多酚[38]和刺梨膳食纖維的工藝優(yōu)化[39]，而對(duì)刺梨中三萜提取條件的優(yōu)化研究較少。本實(shí)驗(yàn)的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用超聲-回流的方法以高收率獲得刺梨質(zhì)量標(biāo)志物，該方法可以作為刺梨質(zhì)量標(biāo)志物的提取工藝方式。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[34]，溶劑用量、乙醇濃度與提取時(shí)間是影響刺梨質(zhì)量標(biāo)志物提取效率最主要的因素。實(shí)驗(yàn)過程中，隨著溶劑用量的增加，刺梨三萜化合物的含量會(huì)增加；但是如果乙醇的添加量太少，會(huì)導(dǎo)致其無法浸潤(rùn)整個(gè)刺梨根粉末，影響刺梨三萜的提取，也會(huì)為后續(xù)過濾、檢測(cè)等工藝增加一定的難度。此外，本研究在對(duì)刺梨根質(zhì)量標(biāo)志物的提取過程中發(fā)現(xiàn)：從回流時(shí)間來看，回流2 h 可提高刺梨三萜的含量，但是當(dāng)超過2 h 后，刺梨三萜的含量呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，這可能是由于在一定時(shí)間后，提取過程中的原料和溶劑達(dá)到了飽和狀態(tài)。根據(jù)本研究中的響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果，可以得出影響提取工藝效率大小，依次為乙醇濃度＞溶劑用量＞提取時(shí)間。提取刺梨中質(zhì)量標(biāo)志物的最佳工藝為：按照料液1:25（g/mL）加入70%的乙醇，先放入超聲儀25 ℃、250 W 超聲30 min，再將料液進(jìn)行加熱回流2 h，連續(xù)提取3次。在此條件下，所得到的刺梨葉中質(zhì)量標(biāo)志物的總含量為2.64%，分別為刺梨苷含量為0.99%、野薔薇苷含量為0.72%、薔薇酸含量為0.43%和委陵菜酸含量為0.51%?？紤]到實(shí)際生產(chǎn)中需要成本問題，應(yīng)當(dāng)適當(dāng)?shù)亟档鸵掖紳舛群吞崛〈螖?shù)以提高經(jīng)濟(jì)效益。

與此同時(shí)，采用HPLC 法同時(shí)測(cè)定刺梨中4 種質(zhì)量標(biāo)志物的研究尚未見報(bào)道。本研究探索了HPLC 同時(shí)測(cè)定刺梨4 種質(zhì)量標(biāo)志物的含量分析檢測(cè)方法，以Thermo C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm；柱溫20 ℃；流速為1 mL/min；進(jìn)樣體積為10 μL；流動(dòng)相A 為0.05%三氟乙酸水，B 為乙腈；梯度洗脫條件為0～15 min，25% A～30%A；15～20 min，30% A～35% A；20～60 min，35% A 等度洗脫作為檢測(cè)條件，能夠較好同時(shí)測(cè)定4 種質(zhì)量標(biāo)志物。以此條件，采用HPLC 測(cè)定了刺梨不同部位的質(zhì)量標(biāo)志物，發(fā)現(xiàn)刺梨三萜總含量在刺梨中的（從大到?。╉樞?yàn)榇汤嫒~、刺梨根、刺梨莖、刺梨果。而目前刺梨常用的藥用部位為根、莖和果實(shí)，葉片利用較少，因此可以將葉片作為開發(fā)三萜類化合物的新選擇。刺梨中質(zhì)量標(biāo)記物的提取工藝及其含量HPLC 同時(shí)測(cè)定的研究將為刺梨質(zhì)量評(píng)價(jià)和開發(fā)及生產(chǎn)利用提供科學(xué)依據(jù)。